家蠶熱休克蛋白hsp90基因的熒光定量pcr檢測微粒子病蠶卵的方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種家蠶熱休克蛋白HSP90基因的熒光定量 PCR檢測微粒子病蠶卵的方法及應用。
【背景技術】
[0002] 家蠶微粒子病是蠶桑生產上危害嚴重而又長期得不到根治的傳染性疫病，并嚴重 制約著蠶絲業的健康穩定的發展。家蠶微粒子病由家蠶微孢子蟲引起，家蠶微孢子蟲除了 水平傳播外，還可通過胚胎向下代垂直傳播。被養蠶國家或地區定為法定檢疫對象。我國 蠶業每年因感染微孢子蟲而燒毀大量蠶種，造成的經濟損失高達千萬元。
[0003] 目前蠶業生產上對微孢子蟲的檢疫主要是母蛾鏡檢，母蛾鏡檢法是十八世紀法國 科學家巴斯德提出，已經使用了 100多年的檢疫方法，母蛾鏡檢法費時費力，對操作人員的 技術要求較高。而且母蛾鏡檢法是對母蛾進行檢驗，不是對蠶卵進行檢測，不符合成品檢測 的原則。所以大家都在探索微孢子蟲檢疫的新方法，目前實驗室中已經建立的新檢測方法 有：顯微鏡鏡檢法、免疫學檢測法、PCR技術、核酸分子雜交方法、環介導等溫擴增法等。但 是，上述檢測方法均都是以微孢子蟲為檢測靶標，成品蠶卵中微孢子蟲數量非常少，這些方 法的靈敏度都達不到檢測要求，不能用于蠶卵的檢測，不利于實際生產上廣泛地推廣和使 用。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種用家蠶熱休克蛋白HSP90基因作為蠶卵檢測靶標在檢 測微粒子病蠶卵中的應用。
[0005] 本發明的另一目的是提供一種家蠶熱休克蛋白HSP90基因的熒光定量PCR檢測微 粒子病蠶卵的方法，解決了現有技術中存在的靈敏度低的問題。
[0006] 本發明所采用的第一技術方案是，用家蠶熱休克蛋白HSP90基因作為蠶卵檢測靶 標在檢測微粒子病蠶卵中的應用。
[0007] 本發明所采用的第二技術方案是，一種家蠶熱休克蛋白HSP90基因的熒光定量 PCR檢測微粒子病蠶卵的方法，具體按照以下步驟實施：
[0008] 步驟1、取正常蠶卵和待測蠶卵各20粒，用試劑盒分別提取正常蠶卵和待測蠶卵 的mRNA，然后反轉錄成cDNA ;
[0009] 步驟2、根據豕香熱休克蛋白HSP90基因序列和豕香actin基因序列設計引物； [0010] 步驟3、以步驟1獲得的正常蠶卵的cDNA為模板，使用步驟2合成的引物，以家蠶 actin基因為參照，進行熒光定量PCR，得到正常蠶卵家蠶熱休克蛋白HSP90基因的相對表 達量；
[0011] 步驟4、以步驟1獲得的待測蠶卵的cDNA為模板，使用步驟2合成的引物，以家蠶 actin基因為參照，進行熒光定量PCR，得到待測蠶卵家蠶熱休克蛋白HSP90基因的相對表 達量；
[0012] 步驟5、如果待測蠶卵家蠶熱休克蛋白HSP90基因的相對表達量大于或者等于正 常蠶卵家蠶熱休克蛋白HSP90基因的相對表達量3倍，則判定該待測蠶卵為不合格蠶卵，即 微粒子病蠶卵。
[0013] 本發明的特點還在于，
[0014] 根據家蠶actin基因序列設計引物的上游引物為GTCGCTGACCGCGTGACTGT，如SEQ ID NO. 3所示，下游引物為CCAAGGGGCTCACCGCTGTC，如SEQ ID NO. 4所示；根據家蠶熱休 克蛋白HSP90基因序列設計引物的上游引物的序列為GGATGTCCACGTCGCACTTCA，如SEQ ID NO. 5所示，下游引物的序列為GCGCGGCTACTCGTTCACTACC，如SEQ ID NO. 6所示。
[0015] 本發明的有益效果是：本發明與現有技術相比，最大的特點是改變了檢查靶標，現 有的微粒子病的檢測方法均都是以微孢子蟲為檢測靶標，本發明則是以家蠶的熱休克蛋白 HSP90為檢測靶標。就像人體血清中C反應蛋白（CRP)被認為是人體急性炎癥時反應最主 要、最敏感的標志物之--樣。用家蠶熱休克蛋白HSP90為檢測靶標，可以大大提高靈敏 度。具有結果可靠和準確靈敏、檢查效率高等優點。
【附圖說明】
[0016] 圖1是感染微孢子蟲的蠶卵和正常蠶卵蛋白質SDS-PAGE電泳圖譜。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。
[0018] 實施例1家蠶卵蛋白質的提取
[0019] 取家蠶卵30粒，液氮研磨至粉狀，加入200111裂解液（含9111〇1/1尿素、4%(：祖?5、 1%DTT)室溫放置3h，離心（4°C，12000g，30min)取上清，并再次離心取上清，充分去除不 溶性雜質，上清即為提取的家蠶卵總蛋白溶液。采用Bradford法測定提取的蛋白質濃度。 加入6倍體積一20°C預冷的TCA-丙酮（10%三氯乙酸、0. 07%巰基乙醇溶于100%丙酮） 溶液，漩渦后靜置于一20°C下，沉淀蛋白過夜；離心（4°C，12000g，15min)棄上清，沉淀用一 20°C的丙酮溶液（含0.07%巰基乙醇）懸浮30min，離心（4°〇，1200(^，1511^11)，重復2~3 次；沉淀靜置于常溫，揮發丙酮。沉淀加入1ml裂解液（9mol/L尿素、4% CHAPSU % DTT)， 漩渦震蕩，37°C水浴I. 5h以上，離心（4°C，12000g，15min)，上清液用于蛋白質電泳分析。采 用Bradford法測定提取的蛋白質濃度。
[0020] 采用不連續電泳的電泳，參數設為濃縮電壓60V持續30min ;分離電壓120V，持續 時間2h，分離膠濃度為12 %，濃縮膠濃度為6 %。
[0021] 運用上述蛋白質提取與電泳條件，進行微孢子蟲感染微孢子蟲的蠶卵與政策蠶卵 差異蛋白質分析，如圖1所示，鑒定出兩條差異條帶a和條帶b，a條帶為家蠶感染微孢子蟲 后蠶卵下調蛋白質，b條帶為家蠶感染微孢子蟲后蠶卵上調蛋白質。
[0022] 實施例2家蠶感染微孢子蟲后感染微孢子蟲的蠶卵（待測蠶卵）和正常蠶卵差異 蛋白質的LC-MS/MS分析
[0023] 1、將所選擇的膠帶用切膠筆切下。
[0024] 2、加 50 μ L DD. H2O 洗兩次，IOmin/ 次；
[0025] 3、加50mM NH4HCO3/乙腈=I : 1溶液（考染脫色液）50 μ L，超聲脫色5min或37°C 脫色20min，吸干；
[0026] 4、重復步驟3,直至藍色褪去；
[0027] 5、加乙腈50 μ L脫水至膠粒完全變白，真空抽干IOmin ;
[0028] 6、加 IOmM DT