利用人工合成mv5序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法
【技術領域】 [0001] 本發明涉及一種培育甘蔗抗病品種的方法，具體涉及一種利用人工合 成MV5序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，屬于生物。
【背景技術】 [0002] 甘鹿（Saccharum officinarum)是最重要的糖料作物，鹿糖占我國食 糖總產的90%以上。甘蔗花葉病是甘蔗上發生最普遍、危害最嚴重的一類病毒病害，它主 要破壞甘蔗葉片的葉綠體，嚴重制約其光合作用，從而使甘蔗的生長受到限制，造成產量 降低5% -19%、節間變短、品質變劣和品種退化。該病病原復雜，可由多種病毒引起，主 要為甘鹿花葉病毒（Sugarcane Mosaic Virus, ScMV)和高梁花葉病毒（Sorghum Mosaic Virus，SrMV)，屬馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus)成員，為單鏈正義RNA病毒，基因組結構簡 單，編碼10個成熟蛋白，分別為PI、HC-pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、Nib和CP。且該病 的侵染病毒極易分化，不同地區的分離物或株系均存在差異。在1997年已報道至少存在7 個株系，包括屬于ScMV的株系ScMV-A，B，D，E和屬于SrMV的株系SrMV-H，I，M，這些不同株 系的病毒均可引起甘蔗花葉病的發生。因此，僅以單一株系的花葉病毒的單一基因為靶標 的轉基因改良顯然無法應對蔗區病原株系多樣化、復雜化以及優勢株系的變化。
[0003] RNA干擾（RNA interference，RNAi)是一種轉錄后基因表達沉默機制，構建可轉 錄為雙鏈RNA(dsRNA)的植物表達載體轉化植物，可實現植物目標基因的可遺傳的基因沉 默，用于基因功能鑒定和創造分子育種新材料。而且，引發RNAi的片段并不需要完整的基 因序列，還可以是多個病毒的不同基因片段的嵌合體，因此，RNAi針對的靶標基因也可以是 多個不同病毒的基因片段。為此，我們采用RNAi技術，將收集到的ScMV各病毒株系的核酸 序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分別進行多序列比對，并從多序列比對結果中分別選 出兩條100%同源的序列區段，采用人工合成的方式串聯在一起，作為RNAi干擾片段，構建 反向重復序列，得到一個RNAi載體。通過基因槍轟擊法遺傳轉化甘蔗，以獲得具有沉默病 毒基因表達效果的轉基因甘蔗。
[0004] 專利號為ZL20071009226. 8的發明專利"利用SrMV-Pl基因培育抗花葉病甘蔗品 種的方法"，介紹了一種利用SrMV-Pi基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括SrMV-P i基因 的克隆、抗花葉病甘蔗轉Pi基因植物表達載體的構建、抗甘蔗花葉病轉P :基因材料的培育 以及抗病高產高糖轉基因甘蔗新材料的篩選鑒定。

【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種利用人工合成序列MV5培育抗花葉病甘蔗品 種的方法。針對現有蔗區甘蔗花葉病嚴重的問題，人工合成可同時沉默甘蔗花葉病毒和高 粱花葉病毒的新型核酸序列，構建RNAi載體，通過基因槍轟擊法進行遺傳轉化，獲得對花 葉病高抗的轉基因甘蔗。
[0006] 本發明的目的是通過以下方法實現的。
[0007] 本發明的利用人工合成MV5序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括MV5序列的 人工合成、RNAi干擾載體構建、抗花葉病轉基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定；其特征在 于：
[0008] (1)MV5序列的人工合成：
[0009] 從ScMV和SrMV核酸序列中選取若干區段串聯在一起，獲得MV5序列，同時在正義 鏈5'端加入Xba I和Xho I酶切位點，反義鏈5'端加入Cla I和Kpn I酶切位點，采用 人工合成的方式，獲得目的片段A，其序列如下：
[0010] GATCTAGACT CGAGGCATCT CCAACATTCA GACAGATAAT GCACCACTTT AGTGATGCAG CTGAAGCGTA CATAGAGCGT AGATTTAGGC GCAATGTACA ATATCTCAGC TACGCATCAA ATATCAAGTT TAGTGCAGAA AAGTCGAGAT GTTCGGTCTG GACGGAAATG TCGGCGAGAC TCAGGAGAAT ACAGAGAGAC ACACAGCTGG TTAACCGTGA GAAAAAGCGT AGATTTAGGC GCTGTATACA ATATATCAGC TACGCATCTA ATATCAGGTA CCATCGATAG
[0011] 所述從ScMV和SrMV核酸序列中選取若干區段串聯在一起，指分別將收集到的 ScMV各個病毒株系的核酸序列和SrMV各個病毒株系的核酸序列分別進行多序列比對，從 中分別各選取2條長度大于40bp，且100%同源的序列區段串聯在一起，共262bp，為目標 RNAi干擾序列。
[0012] (2) RNAi干擾載體構建：
[0013] (a)目的片段I的獲得：利用限制性內切酶Kpn I和Xho I將目的片段A進行酶 切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段I ;目的片段I的序列為序列 表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
[0014] (b)目的片段II的獲得：將pHANNIBAL載體質粒DNA用限制性內切酶Kpn I和Xho I進行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段II，目的片段II的序 列為序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列；
[0015] (c)中間載體B的獲得：將回收的目的片段I和目的片段II用T4-DNA連接酶進行 連接，并將連接產物轉化至大腸桿菌DH5 a中，挑取陽性克隆驗證，獲得中間載體B ;所述中 間載體B是指將目的片段I插入到pHANNIBAL載體后獲得的載體；
[0016] ⑷目的片段III的獲得：提取中間載體B的質粒DNA，并用限制性內切酶Cla I和 Xba I進行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段III ;目的片段III 的序列為序列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
[0017] (e)目的片段IV的獲得：將目的片段A用限制性內切酶Cla I和Xba I進行酶切， 將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段IV ;目的片段IV的序列為序列表 中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
[0018] (f)中間載體C的獲得：將回收的目的片段III和目的片段IV用T4-DNA連接酶進行 連接，并將連接產物轉化至大腸桿菌DH5 a中，挑取陽性克隆驗證，獲得中間載體C ;所述中 間載體C是指將目的片段IV插入到中間載體B后獲得的載體；
[0019] (g)目的片段V的獲得：提取中間載體C的質粒DNA，并用限制性內切酶Not I進 行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段V ;目的片段V的序列為 序列表中SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；
[0020] (h)目的片段VI的獲得：將植物表達載體pGreenII0229質粒DNA用限制性內切酶 Not I進行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段VI ;目的片段VI 的序列為序列表中SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列；
[0021] ⑴抗甘蔗花葉RNAi干擾載體pG0229i-MV5的獲得：將回收的目的片段V和目的 片段VI用T4-DNA連接酶進行連接，并將連接產物轉化至大腸桿菌DH5 a中，挑取陽性克隆 驗證，獲得可用于遺傳轉化甘蔗受體材料的RNAi干擾載體pG0229i-MV5 ;
[0022] (3)抗花葉病轉基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定：提取構建完成的RNAi干擾載 體pG0229i-MV5質粒DNA，用核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度，并將其定量至1 y g/ y 1， 基因槍轟擊法遺傳轉化甘蔗，分子檢測獲得陽性轉基因植株，并進行抗病轉基因甘蔗的抗 病性鑒定。
[0023] 所述pHANNIBAL載體、pGreenII0229載體、大腸桿菌DH5a，均由商業購買獲得。
[0024] 利用本發明的人工合成MV5序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，在人工接種條件 下，分別接種了屬于ScMV株系的ScMV-A，D和屬于SrMV株系的SrMV-I，M共4個株系，對照 發病率分別達到了 84. 6%、85. 7%、87. 5%和86. 9%，而轉基因甘蔗均無發病，說明轉入人 工合成的MV5基因后提高了甘蔗抗多種花葉病毒的能力。采用本發明的方法篩選獲得的轉 基因植株，都具有抗性廣譜、抗病性好、抗性持久及生物安全性高的特點。
[0025] 本發明的優點和有益效果：
[0026] 1.本發明獲得的植物表達載體采用了 RNAi技術，使得甘蔗抗病毒育種擺脫了對 抗源基因的依賴。
[0027] 2.本發明人工合成的核酸序列包含2段與ScMV各病毒株系核酸序列100%同源 和2段與SrMV各病毒株系核酸序列100%同源的序列區段，作為RNAi序列，獲得的轉基因 植株，具有抗性廣譜、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特點。
[0028] 3.本發明獲得的RNAi干擾載體用于轉基因甘蔗，可以有效地縮短甘蔗抗花葉病 育種周期。
【附圖說明】 [0029] 圖1為構建完成的pG0229i-MV5質粒圖譜。
[0030]
【具體實施方式】為了進一步闡明本發明而不是限制本發明，以下結合實施例加以 說明。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。所述試劑和生物材料如 無特殊說明均可從商業途徑獲得。
[0031] 實施例一：構建抗甘蔗花葉病的RNAi干擾載體
[0032] 構建抗甘蔗花葉病的RNAi干擾載體的方法，包括以下步驟：
[0033] 1、MV5序列的人工合成：
[0034] 將收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分別進行 多序列比對，從中分別選取2條長度大于40bp且100%同源的序列區段，然后將選取出來的 4條序列區段采用人工合成的方式串聯在一起，共262bp，即為目標RNAi干擾序列；同時在 擬人工合成序列的正義鏈5'端加入Xba I和Xho I酶切位點，反義鏈5'端加入Cla I和 Kpn I酶切位點，人工合成獲得目的片段A ;所述目的片段A是指在目標RNAi干擾序列的正 義鏈5'端和反義鏈5'端加入酶切位點后的核苷酸序列；人工合成后，目的片段A的序列 為序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0035] 2、RNAi干擾載體構建：
[0036] 利用限制性內切酶Kpn I和Xho I將步驟1中獲得的目的片段A進行酶切，將酶 切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段I，同時將pHANNIBAL載體質粒DNA 用限制性內切酶K