快速檢測家蠶微孢子蟲的引物對及其試劑盒和檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學和免疫學領域，快速檢測家蠶微抱子蟲的引物對，還設及 快速檢測家蠶微抱子蟲的引物對試劑盒和利用該試劑盒檢測家蠶微抱子蟲的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 為有效控制蠶業生產中因家蠶微抱子蟲引發的家蠶微粒子病，W免其引發家蠶 大量死亡，需要開發靈敏、便捷、準確的家蠶微抱子蟲檢測方法。家蠶微抱子蟲（Nosema bombycis)，也稱家蠶微粒子蟲，主要寄生于經濟昆蟲家蠶體內，所引發的家蠶微粒子病是 蠶桑產業上毀滅性的病害，其病原家蠶微抱子蟲被世界各養蠶國家和地區列為蠶業生產上 的法定檢疫對象，而在成品卵時期成功檢出家蠶微抱子蟲對于蠶業生產中的家蠶微抱子蟲 防控具有重要作用。
[0003] 在傳統的蠶業生產中，為了生產無毒蠶卵控制家蠶微抱子蟲的傳播，蠶種檢疫部 口常采用的是母蛾鏡檢法，是一種間接判定法，其主要過程為：研磨母蛾后，通過光學顯微 鏡鏡檢的方法進行家蠶微抱子蟲的檢測，將有毒母蛾所產的卵視為有毒卵，從而間接判定 成品卵中是否含有家蠶微抱子蟲，整個檢驗過程耗費人工，且最終檢測結果對鏡檢人員的 經驗要求較高，主觀性強；另一方面，蠶種場送檢的母蛾未必能夠代表整批成品卵產品的真 實情況。基于W上原因，一種能夠直接檢測成品卵中的家蠶微抱子蟲的檢測方法急需建立。 基于核酸擴增方法的檢測對象是來自家蠶微抱子蟲的DNA，經特異性擴增后進行產物鑒定， 運類方法靈敏度高，特異性好。
[0004] 雖然核酸擴增檢測法具有靈敏度高、特異性和可靠性強，但運一類方法通常設備 依賴性較強，而且擴增結果需用瓊脂糖凝膠電泳并進行圖像采集后才能獲得最終檢測結 果，耗時較長。
[0005] 另一種檢測方法基于雙抗夾屯、的免疫學檢測方法，其檢測對象主要是病原蛋白 質，檢測結果的特異性由特異性針對該蛋白質的抗體保證，是一種快速檢測的常規方法，運 種方法能夠與膠體金試紙條檢測技術相結合，具有成本低廉、操作簡單的優點。在免疫膠體 金試紙條檢測中，常利用抗原-抗體特異性結合的特點，構建抗原-抗體-膠體金顆粒的復 合體，當該復合體集中在試紙條的檢測線上時，膠體金顆粒能夠形成紅色沉淀線，但該種方 法的靈敏度依賴于高親和力W及高特異性抗體的獲得W及樣品中的抗原含量，家蠶成品卵 中的微抱子蟲數量極少，其對應的抗原量也相應很少，也限制該方法在成品卵檢疫中的應 用。
[0006] 綜上所述，如果能在核酸擴增產物中加入特殊的標記物，就能使得PCR擴增的產 物也能夠用免疫膠體金試紙條檢測，可W減少對儀器依賴，并加快檢出時間。因此在本檢測 方法的PCR過程中使用了 一對同時標記了兩種化合物的引物，該試紙條是W雙抗（或配體） 夾屯、法的方式檢測。

【發明內容】

[0007] 有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種快速檢測家蠶微抱子蟲的引物對，特 異性好；本發明的目的之二在于提供快速檢測家蠶微抱子蟲的引物對試劑盒，特異性好，靈 敏度高，本發明的目的之=在于提供利用快速檢測家蠶微抱子蟲的引物對試劑盒檢測家蠶 成品卵中家蠶微抱子蟲的檢測方法，操作步驟簡便。
[000引為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：
[0009] 1、快速檢測家蠶微抱子蟲的引物對，所述引物對的核巧酸序列如SEQIDNO. 7和 SEQIDNO. 8所示。該引物對選擇區域合適，避免了引物二聚體的形成，從而杜絕了假陽性 的產生。
[0010] 2、快速檢測家蠶微抱子蟲的試劑盒，所述試劑盒包括兩種不同核酸分子標記物， 分別標記SEQIDNO. 7和SEQIDNO. 8的引物對和膠體金免疫層析試紙條，所述膠體金免 疫層析試紙條的點樣區噴涂有連接其中一種核酸分子標記物抗體的膠體金顆粒，檢測線固 定有與另一種核酸分子標記物特異結合的配體。由于引物中引入了特殊的標記物，使得PCR 擴增的產物能夠用免疫膠體金試紙條檢測，簡化了檢測步驟，并且本發明使用的引物對特 異性好，靈敏度高，與傳統的凝膠電泳相比，其敏感度增加10倍。
[0011] 作為本發明優選的技術方案，所述核酸分子標記物為生物素、地高辛、簇基巧光素 或異硫氯酸巧光素。運幾種標記物可W被其對應的抗體或配體特異性識別，且特異性高，從 而通過免疫學的方法進行檢測。
[0012] 作為本發明更優選的技術方案，所述核酸分子標記物為生物素或簇基巧光素，配 體為鏈霉親和素分子和抗簇基巧光素兔抗。
[0013] 本發明試劑盒中還包括展開液，所述展開液各組分濃度如下：TrisIOmM,BSA 1%，NaC1137mM，KCl2. 7mM，NazHPOJOmM和KH2P〇42mM。展開液中的Tris成分能在一定程 度上實現對引物二聚體及非特異性擴增產物的清除。
[0014] 本發明中，所述試劑盒還包括待檢樣品處理液和裂解液，所述待檢樣品處理液為 質量分數為4%的KOH;所述裂解液含體積分數為1 %的NP-40 (乙基苯基聚乙二醇）和體 積分數為2%的化itonX-IOO(聚乙二醇辛基苯基酸）。待檢樣品處理液能夠使家蠶微抱 子蟲表面部分蛋白脫落，裂解液主要目的是裂解家蠶微抱子蟲釋放出DNA，W作為PCR擴增 反應的模板。
[0015] 由于本發明DNA提取中并未對所提取的家蠶微抱子蟲基因組DNA進行純化，因此 會有較多雜質，其普通的PCR核酸聚合酶并不適用于該檢測體系；選用熱啟動的PCR核酸聚 合酶能夠有效降低PCR過程中的引物二聚體和非特異性擴增產物的生成，所W在本發明中 使用了適用于模板來源復雜的熱啟動PCR聚合酶Mi曲tyAmpDNApolymeraseVer. 3。
[0016] 作為本發明進一步優選的技術方案，利用待檢樣品處理液和裂解液提取DNA的步 驟如下：取蠶卵加水研磨后離屯、，收集沉淀，在沉淀中加入待檢樣品處理液，混勻18~25°C 放置IOmin后用水清洗，離屯、收集沉淀，然后向沉淀中加入裂解液，100°C放置1虹。
[0017] 作為本發明最優選的技術方案，所述膠體金免疫層析試紙條由W下方法制備：先 用抗簇基巧光素兔抗（抗FAM兔抗）與膠體金顆粒交聯，形成膠體金-抗簇基巧光素兔抗 復合物，然后噴涂于點樣區；再用生物素的配體鏈霉親和素在纖維膜上按線狀噴涂，形成檢 測線；最后與吸水濾紙、樣品墊和底板組裝膠體金免疫層析試紙條。為了證明試紙條處于有 效期內在檢測線下游固定質控線，質控線上包被抗兔IgG的二抗，如羊抗兔IgG抗體。
[0018] 3、利用所述快速檢測家蠶微抱子蟲的試劑盒檢測家蠶微抱子蟲的方法，包括如下 步驟：
[0019] A.提取待測樣品DNA，然后W核酸分子標記物分別標記SEQIDNO. 7和SEQID NO. 8的引物對進行PCR擴增，收集擴增產物；
[0020] B.將步驟A)所得擴增產物點于所述膠體金免疫層析試紙條的樣品墊，并用含核 酸變性劑的展開液層析，根據檢測線是否有可見條帶，判定陰性或陽性；如果有可見條帶， 判定為陽性，如果無可見條帶，判定為陰性。
[0021] 檢測原理如下：當存在待檢的特異性擴增產物時，擴增產物帶有不同的標記物，形 成標記A-擴增產物-標記B復合物，標記A-擴增產物-標記B復合物與膠體金-抗標記 A抗體復合物結合，形成膠體金顆粒-抗標記A抗體-標記A-擴增產物-標記B的紅色顆 粒復合物，紅色顆粒復合物在展開緩沖液中沿試紙條方向層析，在檢測線部位與標記B的 配體結合，形成肉眼可見的紅色線條，判定為陽性；當特異性擴增產物不存在時，不能形成 膠體金顆粒-抗標記A抗體-標志物A-擴增產物-標記B的紅色顆粒復合物，檢測線上不 能與標記B的配體結合，不能形成紅色線條，判定為陰性。 陽02引本發明步驟A中，所述PCR擴增條件為98°C預變性5min，98°C變性10sec，64°C退 火15sec，68°C延伸35sec，擴增30個循環；最后68°C延伸3min。
[0023] 本發明說明書中所使用的技術術語解釋：
[0024] PCR:聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction)的簡稱，可W放大擴增特定 DNA片段的分子生物學技術。
[00巧]引物：引導DNA合成酶進行DNA合成的物質，一般為一對單鏈寡核巧酸，與擴增模 板相結合后，從引物的3'端開始合成。
[00%] 標記：將能被檢測到的分子與單鏈寡核巧酸偶聯在一起的方法。
[0027] 抗體：能與抗原或半抗原特異性結合的蛋白質分子。
[0028] 引物二聚體：在PCR過程中，在上下引物間，或單向引物自身之間的連接現象稱為 引物二聚體，單向引物自身之間形成的引物二聚體不會形成假陽性信號。
[0029] 核酸聚合酶：催化合成核巧酸鏈的酶類，主要分為DNA聚合酶和RNA聚合酶。
[0030] 本發明的有益效果在于：本發明是W標記的特異性引物對擴增合適的基因片段， 能保證擴增結果的特異性，從而保證了檢測結果的準確性；為了簡化檢測程序將設計的特 異引物進行雙標記，從而避免了外加帶標記的探針的繁雜過程；擴增產物直接使用免疫膠 體金試紙條判定，使得整個檢測過程在保持檢測結果準確性的基礎上簡化了操作步驟，整 個檢測過程方便快速；本發明還提供了一種的家蠶成品卵中家蠶微抱子蟲核酸擴增檢測的 樣品處理方法，該方法與傳統提取家蠶微抱子蟲基因組的方法相比，快速、高效。因此本發 明是一種理想的家蠶成品卵中家蠶微抱子蟲的檢測手段。
[0031] 本專利還提供快速檢測家蠶成品卵中家蠶微抱子蟲的試劑盒，具有如下優點： 陽〇巧操作簡單：全部檢測過程僅需將擴增產物加在展開緩沖液里后，將混合物滴加在 試紙條上即可，無需專業人員操作，適用于蠶種場用工環境；
[0033] 快速：擴增產物滴加到試紙條2-5min后即可判定結果；
[0034] 靈敏度：比瓊脂糖凝膠電泳靈敏10倍，可檢出光學顯微鏡中無法檢出的家蠶微抱 子蟲；
[0035] 特異性高：因為使用了標記的特異性引物對，其檢測結果更加準確客觀。
【附圖說明】
[0036] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0037] 圖 1 為引物篩選結果圖（A:LSU149;B:LSU151;C:LSU153;D:LSU323;E:LSU3238 和LSU397;F:LSU480;G:LSU482 ;圖中Nb:家蠶微抱子蟲；Ser:沙雷氏菌；BmNPV:家蠶核型 多角體病毒；Bp:球抱白僵菌；S.au:金黃色葡萄球菌）。
[0038] 圖2為采用特異性標記引物LSU480檢測球抱白僵菌膠體金免疫層析試紙條結果。
[0039] 圖3為采用特異性標記引物檢測家蠶微抱子蟲特異性檢測結果（A:瓊脂糖凝膠電 泳；B:膠體金免疫層析試紙條）。
[0040] 圖4為采用特異性標記引物檢測家蠶微抱