專利名稱：水稻花粉母細胞特異性表達基因的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及水稻花粉母細胞特異性表達基因。
背景技術：
減數分裂是所有真核生物有性生殖過程中的關鍵。所有真核生物的減數分裂過程是高度保守的。減數分裂與有絲分裂的不同在于，一輪DNA復制后它經過了兩次連續的細胞分裂。減數分裂I時期的染色體行為，如同源染色體排列、聯會、重組和交叉釋放，是減數分裂所特有的，并且是進行遺傳特性分類的基礎。在酵母中，對于減數分裂的研究是廣泛的，但是在植物中，對于減數分裂一系列事件的遺傳控制的研究還是有限的。完全的減數分裂的特異性基因列表對于全面了解植物的減數分裂機制是非常有用的。有性生殖發育中的最關鍵點是在從有絲分裂細胞周期向減數分裂細胞周期的過渡中，所有的準備在減數分裂開始前完成。對于酵母、小鼠和玉米的研究指出控制減數分裂起始的信號級聯通路存在顯著的物種多樣性，但相比之下，減數分裂的基本過程在進化上是保守的。芽殖酵母中，減數分裂特異轉錄因子IMEl通過正調節一個蛋白激酶編碼基因的表達開始其減數分裂過程。裂殖酵母中，一個RNA結合蛋白Mei2成為了減數分裂起始的開關。在小鼠的生殖細胞中，一個脊椎動物特有基因StraS的特異性誘導對于向減數分裂過渡是必須的。而在玉米中，一個含有卷曲螺旋結構的植物特有蛋白Aml對于減數分裂的起始是必須的。因此研究水稻這種重要經濟作物的減數分裂起始的控制有重要的意義。此外，基于基因對基因的研究手段，許多單獨的減數分裂相關基因的成功鑒定之后，更加全面的工具的應用，如芯片，以及遺傳學的和生物化學的路徑的整合，將揭示新的在遺傳學上控制減數分裂的基因的相互作用和路徑。在植物中，只有花粉母細胞和大孢子母細胞通過減數分裂，由原來的二倍體細胞形成單倍體細胞，而所有其他細胞的分裂是通過有絲分裂實現的。相較于有絲分裂周期的細胞，花粉母細胞的轉錄組更全面地提供了減數分裂時期的特異基因，同時也提示了與減數分裂起始相關的路徑。然而，由于花粉母細胞埋在雄蕊頂部的花藥之內，收集均一的花粉母細胞群落在技術上存在困難。例如，有研究描述了處于發育第五階段的水稻雄蕊富含花粉母細胞(Lu XC,Gong HQ, Huang ML,Bai SL, He YB, Mao X，Geng Ζ, Li SG, Wei L，Yuwen JS,Xu ZH, Bai SN(2006)Molecular analysis of early ricestamen development using organ-specific gene expression profiling. Plant Mol Biol61 :845-851)，他們不得不切取整個處于發育第五階段的水稻雄蕊進行芯片分析。因此，本領域有必要找到有效的收集均一的花粉母細胞群落的方法，從而更有利于花粉母細胞的深入分析
發明內容
本發明的目的在于提供篩選水稻花粉母細胞特異性表達基因的方法。本發明的另一目的在于提供水稻花粉母細胞特異性表達基因。在本發明的第一方面，提供一種篩選水稻花粉母細胞特異性表達基因的方法，所述方法包括(1)利用激光捕獲顯微切割從水稻未成熟花序的切片(較佳地為石蠟切片)中分離出花粉母細胞；(2)對花粉母細胞進行表達譜分析，并與處于有絲分裂時期的三核花粉和/或幼苗的表達譜進行比較，找出特異性在花粉母細胞中表達而不在三核花粉和/或幼苗中表達的基因，所述基因即是水稻花粉母細胞特異性表達基因。在一個優選例中，所述的水稻未成熟花序是水稻發育時期第5期的未成熟花序。在另一優選例中，水稻未成熟花序的切片如下制備將水稻未成熟花序進行固定、 石蠟包埋、切片、脫蠟、干燥，得到用于分離水稻母細胞的水稻未成熟花序的切片。較佳地，采用微波輔助的丙酮固定法進行固定。較佳地，所述的切片的厚度為8-10 μ m。較佳地，如下制備將水稻未成熟花序經過微波輔助的丙酮法固定、石蠟滲透與包埋以及切片脫蠟，制成幼嫩花藥橫切片。在另一優選例中，步驟(1)包括在水稻未成熟花序的切片中將花粉母細胞標記出來，用紫外激光束將花粉母細胞與周圍細胞分開，收集花粉母細胞。在另一優選例中，包括將水稻未成熟花序的切片置于激光捕獲顯微切割儀器中，從放大的顯微圖中辨別出處于花藥室中的花粉母細胞/小孢子，并將部分切片分別通過染色確定花粉母細胞位置用作參照；根據參照將同批未經染色的幼嫩花藥橫切片在激光捕獲顯微切割儀顯示屏上花粉母細胞標記出來，經過焦距和能量的精細調整后，用紫外激光束將花粉母細胞與周圍細胞分開，再用近紅外激光束收集花粉母細胞( 500個)。在另一優選例中，所述的染色如DAPI (4',6' - 二脒基_2_苯基吲哚，4’， 6，-diamidino-2-phenylindole)染色或苯氨藍染色。在另一優選例中，步驟O)包括(a)對花粉母細胞進行RNA抽提，獲得總RNA ；線性擴增總RNA，得到氨基-烯丙基 cRNA (互補 RNA)；(b)以熒光染料Cy3_，Cy5_偶聯花粉母細胞的氨基-烯丙基cRNA，用于與水稻基因組芯片雜交，分析表達譜；將該表達譜與三核花粉和/或幼苗經相同處理得到的表達譜比較，建立基于雜交信號絕對值的芯片數據分析方法，結合生物統計學找出可重復性地在花粉母細胞中顯著表達而不在三核花粉和/或幼苗中表達的基因，所述基因即是水稻花粉母細胞特異性表達基因。在另一優選例中，步驟(a)中，進行兩輪線性擴增，從而實現放大倍數達100萬倍以上；較佳地采用Epicentre TargetAmp-2-round試劑盒。在另一優選例中，步驟(a)還包括用Agilent 2100生物分析儀評估cRNA質量， 選擇那些具有“鐘形”曲線且峰值在200nts(較佳地300nts)以上的樣品用于進一步的探針標記。
在另一優選例中，分析表達譜時，安排至少兩個生物學重復。在本發明的另一方面，提供一種所述的方法篩選獲得的水稻花粉母細胞特異性表達基因。在一個優選例中，所述基因是減數分裂特異基因。在本發明的另一方面，提供一種啟動子，其指導基因在水稻花粉母細胞中特異性表達。在本發明的另一方面，提供一種收集花粉母細胞群落的方法，所述方法包括利用激光捕獲顯微切割從水稻未成熟花序的切片中分離出花粉母細胞。在一個優選例中，所述方法包括在水稻未成熟花序的切片中將花粉母細胞標記出來，用紫外激光束將花粉母細胞與周圍細胞分開，收集花粉母細胞。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1A-F、DAPI染色粳稻品種日本晴不同發育階段的花藥、小孢子/花粉。其中， A-B顯示從水稻發育時期第5期階段的約2mm花序采集的花藥的橫截面的染色情況；C-D顯示在減數分裂期從3-4mm花序采集的花藥釋放的小孢子的染色情況；E顯示四分體期從約 5mm花序采集的花藥釋放的小孢子的染色情況；F顯示從約6mm花序獲得的三核花粉(TCP) 的染色情況。圖1G-I、采用激光捕獲顯微切割系統分離的水稻發育時期第5期階段的花藥的橫截面的花粉母細胞。圖2、約2mm長的幼嫩花藥的橫截面的苯胺藍染色。2mm長的未成熟花序中的花藥切片用苯胺藍染色以觀察胼胝質，大多數花藥處于減數分裂前階段，PMC(花粉母細胞)中沒有觀察到胼胝質。其中，A、一些花藥處于早期減數分裂階段，胼胝質堆積在PMC周圍。B、胼胝質堆積處顯示亮黃熒光(箭頭所示)。標尺表示50 μ m。圖 3、用 Agilent Bioanalyzer 2100 檢測 RNA 質量(即 RNA 完整度)。A、激光顯微切割獲得的水稻花粉母細胞抽提得到的總RNA樣品。BioanalyzerflOO 檢測結果顯示185與^S核糖體RNA比例接近1 2，說明激光顯微切割獲得的水稻花粉母細胞抽提得到的總RNA保持完整，質量是好的。B、以激光顯微切割獲得的水稻花粉母細胞抽提得到的總RNA為模板，經兩輪線性擴增得到的aRNA。BioanalyzerflOO檢測結果顯示譜線呈“鐘”形且峰值大于200Nts，說明擴增質量良好。圖4、對通過芯片篩選獲得的部分基因進行實時PCR結果驗證的結果比較。
具體實施例方式本發明人經過深入的研究，找到了一種收集均一的花粉母細胞群落的優選方法， 采用該方法可良好地分離出均一的花粉母細胞，獲得的細胞可用于篩選水稻花粉母細胞特異性表達基因以及特異性表達啟動子。如本文所用，所述的“啟動子”或“啟動子區(域)”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導核酸序列轉錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。在本文中，所述的啟動子或啟動子區包括啟動子的變體，其通過插入或刪除調控區域，進行隨機或定點突變等來獲得。組織或器官特異型啟動子調控下的基因轉錄一般只發生在某些特定器官或組織中。如本文所用，所述的“可操作(性)地連接”或“操作性連接”是指兩個或多個核酸區域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子區域的引導，從而，啟動子區域被“可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用，所述的“目的基因”是指可由本發明的啟動子指導表達的基因。“外源的”或“異源的”是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質序列之間的關系。例如， 如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動子對于該目的基因來說是外源的。特定序列對于其所插入的細胞或生物體來說是“外源的”。如本文所用，術語“特異性表達”是指目的基因在特定的時間和/或特定的組織表達。“組織特異性”又稱“器官特異性”，在一些調控元件的調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現出其相關的發育調節的特性。本發明中，所述的“組織特異性表達”是指在植物花粉母細胞中特異表達。通常，如果在特定組織或器官中mRNA以比在其它組織或器官中高至少5倍，優選至少高10倍，更優選至少高100倍，最優選至少高1000 倍水平被表達，則認為相關基因的表達是組織或器官特異性的。如本文所用，所述的“植物”是禾本科植物，如水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等。較佳地，所述的“植物”是水稻。激光顯微切割以往本領域人員在分析花粉母細胞時，由于細胞分離困難，通常取整個處于發育第五階段的水稻雄蕊進行分析。然而，這種方法獲得的是多種細胞混合的組織，當用于細胞基因特異性表達分析時，無法獲得準確的結果。基于以上現有技術的困難，本發明人經過了深入研究，嘗試了多種細胞分離手段，最后找到了一種合適的收集均一的花粉母細胞群落的方法。即采用激光顯微切割方法，該方法可獲得高純度的水稻花粉母細胞。可利用所述花粉母細胞進行特異性表達分析。因此，本發明提供了一種收集花粉母細胞群落的方法，所述方法包括利用激光捕獲顯微切割從包含花粉母細胞的水稻組織(優選水稻未成熟花序，或水稻未成熟花序中的花藥)中分離出花粉母細胞。更特別地，所述方法包括在包含花粉母細胞的水稻組織中將花粉母細胞標記出來，用紫外激光束將花粉母細胞與周圍細胞分開，收集花粉母細胞。較佳地，在收集時，將近紅外激光束定位于剛好在花粉母細胞上的收集蓋的熱塑高分子膜的特定區域，使膜與花粉母細胞融合，從而花粉母細胞被收集蓋收集。較佳的，在激光捕獲顯微切割之前，對包含花粉母細胞的水稻組織進行預處理，包括對包含花粉母細胞的水稻組織進行微波輔助的丙酮法固定，石蠟包埋，切片(較佳地切成8-10 μ m厚度切片)，對切片進行脫蠟和干燥。
篩選特異性表達基因的方法目前，水稻等作物的全基因組順序已經公布，全基因組芯片為全基因組規模的基因表達研究提供了可能；但以往的研究受限于取用樣品多為多種細胞混合的組織、器官，而植物各種生命活動的基本單元是細胞，不同類型的細胞甚至同類細胞處于不同環境下，其基因表達可以存在很大差異，取用混合樣品的基因芯片結果只能反映多種細胞基因表達的平均值或優勢細胞類型中的基因表達情況，一般不能篩選細胞類型特異性表達的基因，激光顯微切割可以從混和的細胞群中挑選出特定類型的細胞供DNA、RNA分析，解決取樣的精準度問題。具體而言，以往的研究取材是整個花序或整個花藥，在此基礎上得到的基因芯片結果反映的是花序或花藥中多種不同組織、細胞表達的平均值，無法區分基因是在花粉母細胞中表達，還是在花粉周圍的花藥壁、維管束或花絲中表達的，得不到花粉母細胞特異性表達譜。而本發明采用激光顯微切割技術，在顯微鏡下專一選取花粉母細胞，用激光切下取得，不含有其他類型的細胞或組織，所以能夠得到花粉母細胞特異性的表達譜。因此，本發明提供了一種篩選水稻花粉母細胞特異性表達基因的方法，所述方法包括(1)利用激光捕獲顯微切割從包含花粉母細胞的水稻幼嫩花藥組織中分離出花粉母細胞；(2)對花粉母細胞進行表達譜分析，并與處于有絲分裂時期的三核花粉和/或幼苗的表達譜進行比較，找出特異性在花粉母細胞中表達而不在三核花粉和/或幼苗中表達的基因，所述基因即是水稻花粉母細胞特異性表達基因。較佳地，所述的包含花粉母細胞的水稻組織是水稻的花序。更佳地，所述的水稻的花序是水稻發育時期第5期的未成熟花序。處于這一時期的植株具有以下特點1)水稻植株生長大約兩個月，未開花；2)最后兩片葉環的距離小于2cm ；3)未成熟花序長度大約3cm 左右；4)小花長度約為2mm(1.5mm至2. 5mm之間)。可通過做切片進行顯微觀察以進一步確定水稻花藥的發育時期。水稻花藥發育時期按Lu XC, Gong HQ, Huang ML, Bai SL, He YB, Mao X,Geng Ζ,LiSG,Wei L,Yuwen JS,Xu ZH,Bai SN(2006)Molecular analysis of early ricestamen development using organ-specific gene expression profiling. Plant Mol Biol61 :845-851中所劃分，本領域熟練人員可以通過觀察判定大致時期。對花粉母細胞進行表達譜分析的方法較佳地如下(a)將收集到的花粉母細胞轉移到微量離心管中，進行微量RNA抽提(例如picopure試劑盒)，獲得總RNA(pg級)； 用微量凝膠毛細管電泳(如Agilent Bioanalyer 2100和RNAPico-chip)的方法監測總 RNA完整度(如圖3A)。完整度符合要求的總RNA作為模板，經過基于T7RNA聚合酶的兩輪線性擴增(例如用EpicentreTargetAmp-2-round試劑盒，參考文獻Van Gelder，R. N.， yon Zastrow, Μ. Ε. , Yool, Α. , Dement, W. C. , Barchas, J. D. , and Eberwine, J. H. (1990). Amplified RNAsynthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87，1663-1667)，得到 amino-allyl (氨基-烯丙基)cRNA (互補 RNA) 20 微克每樣品，再經微量凝膠毛細管電泳檢測cRNA擴增質量(如圖;3B)，質量良好的用于下步；(b)標記花粉母細胞的氨基-烯丙基(amino-allyl) cRNA，用于與水稻基因組芯片雜交，，并安排至少兩個生物學重復；將該表達譜與三核花粉和/或幼苗經相同處理得到的表達譜比較，建立基于雜交信號絕對值的芯片數據分析方法，結合生物統計學找出可重復性地在花粉母細胞中顯著表達而不在三核花粉或幼苗中表達的基因，所述基因即是水稻花粉母細胞特異性表達基因。
花粉母細胞特異性表達基因本發明還提供了采用所述的篩選特異性表達基因的方法獲得的水稻花粉母細胞特異性表達基因。花粉母細胞代表了在植物雄性有性生殖中雄性減數分裂前的最后階段，所以闡明其轉錄組對完全了解這一關鍵過程是重要的。盡管減數分裂過程中和之后的發育階段轉錄組已經有報道，但是對于減數分裂前轉錄組的報道并沒有。本發明采用激光顯微切割技術獲得高純度的水稻花粉母細胞，并在水稻全基因組芯片上篩選到151個在水稻花粉母細胞中表達，而在幼苗、花粉等其他組織不表達的基因， 該篩選涵蓋了幾乎所有水稻基因，29010個中只篩到151個，幾率為0.051%。該151個基因是潛在的減數分裂特異基因。本發明人在基因分析的同時，還用實時PCR對部分基因表達進行了驗證，兩者結果相符。可見，本發明準確地獲得了水稻花粉母細胞特異性表達基因。啟動子基于以上篩選獲得的基因，可獲得花粉母細胞特異性表達啟動子，所述的啟動子可以目的基因(可以是外源基因)操作性相連，從而驅動目的基因(可以是外源基因)在花粉母細胞中特異性表達。花粉母細胞特異性表達基因的啟動子比一般花粉特異性表達基因的啟動子優越的地方在于一般花粉特異性表達基因的啟動子在雜合子狀態下只在50%花粉中表達；而花粉母細胞特異性表達基因的啟動子在雜合子狀態下也在100%花粉中表達。目前已報道的水稻花粉母細胞特異性啟動子僅有OsMELl (Plant Cell2007,19 2583-2594)。基于本發明在水稻花粉母細胞分離技術上的改進，本發明可以得到比OsMELl 啟動子更特異的水稻花粉母細胞。以下證據證明了這一點(1)基于激光顯微切割所得樣品的基因芯片結果顯示，OsMELl在三核花粉、幼苗等其他階段表達也有中-輕度表達，而本發明所得到的水稻花粉母細胞特異性表達基因在三核花粉、幼苗等其它階段無表達。(2)以OsMEL啟動子驅動⑶S報告基因的轉基因水稻，經⑶S染色顯示在幼苗等有可見表達。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。I.材料與方法植物材料及組織收集7jCfS (Oryza stativa L. ssp. Japonica cv· Nipponbare ；曰本日青)植株在溫室中培養，生長條件為^±1°C，1 光照/Ilh黑暗。
本發明人取發育時期第5期的未成熟花序獲得花粉母細胞。此時期的雄蕊切片開始顯示蝴蝶的形狀，可見包括一層表皮細胞及來源于壁細胞的三層細胞(內層，中層和絨氈層)在內的四層細胞從外而內包裹著花粉母細胞。花粉母細胞的DAPI染色顯示細胞核沒有可見的染色體(圖1A-B)，而在稍后的時期中(花序長度2. 5-3. 5mm)，細胞進入減數分裂，染色體可見(圖1C-D)。花粉母細胞的細胞壁上幾乎沒有胼胝質，而性母細胞在細胞壁上積累胼胝質。本發明人用苯胺藍(0.1%) 對雄蕊切片進行染色，發現大部分發育中的小孢子沒有明顯可見的胼胝質，只有小部分細胞顯示在性母細胞之間會有胼胝質出現，基于以上觀察可知本發明人所選取的細胞處于減數分裂前期到早期的階段。為了分離三核花粉，本發明人從正開花的花序中收集花藥，在40%蔗糖溶液中孵育并振蕩以釋放花粉，40C，300g離心沉淀花粉。水稻種子浸泡在水中J6士 l°C，14h光照/IOh黑暗中培養1周，取整株苗為材料。激光顯微切割樣品的準備利用微波滲透丙酮固定、石蠟包埋的方法處理包含花粉母細胞的未成熟花序以進行激光捕獲顯微切割(Tang WH, Coughlan S, Crane Ε, Beatty Μ, Duvick J (2006) The application of laser microdissection to in planta gene expressionprofi1ing of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola. Mol Plant Microbe Interact 19:1240—1250)。 >t 豐幾(Leica Microtome, Germany) ^htEW ^ 8-10 μ m厚度切片。利用石蠟膠帶轉移裝置(Instrumedics, Hackensack, NJ, USA)展片。 切片在純二甲苯中脫蠟兩次，每次5分鐘，并在通風櫥中吹干，即可用于激光顯微切割。激光捕獲顯微切割用Veritas顯微切割系統(Arcturus/Molecular Devices)分離獲得均質的花粉母細胞。在選定時期的水稻花序切片中將花粉母細胞挑出。在監視屏上將靶細胞標記出來。首先用一束很細的紫外-激光束將靶細胞與周圍細胞分開，然后，將紅外激光束定位于剛好在花粉母細胞上的收集蓋的熱塑高分子膜的特定區域，使膜與靶細胞融合。為此，靶細胞被收集蓋收集，并轉入RNA抽提液中。兩個花粉母細胞的生物學重復，每個約有1000個細胞被收集下來用于RNA抽提。RNA抽提及擴增用Picopure RNA 提取試劑盒(Arcturus/Molecular Devices)抽提 LCM 切割得到的花粉母細胞及收集的三核花粉的總RNA。由于極其微量，且前面步驟繁多，為保證順利實施，需要用微量凝膠毛細管電泳進行質量監測，完整度符合要求的總RNA作為模板；因此， 用RNA-6000Pico芯片(Agilent Technologies)在安捷倫2100生物分析儀上檢測總RNA 的完整性(圖3A)。只有那些核糖體RNA 28S :18S > 1的RNA樣品被用來進行進一步的擴增。幼苗的總 RNA 用 TrizolReagent (Chomczynski and Sacchi, 1987)直接抽提。所有總RNA 樣品都用 iTargetAmp aminoallyl-aRNA 二輪擴增試劑盒(Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, U. S. A.)及 Superscript III 禾口 SuperScriptII 反轉錄酶 (Invitrogen，Carlsbad, CA, U. S. Α.)進行兩輪線性擴增。對于每個樣品，用約Ing總RNA 起始(在一個2- μ 1體系中)，大約可得到8 μ g amino-allylcRNA。擴增后的RNA質量用 Agilent 2100生物分析儀進行評估，只有那些具有“鐘形”曲線且峰值在300nts以上的樣品用于進一步的探針標記。amino-allyl cRNA的標記及基因芯片的雜交根據Ambion的染料偶合實驗方法(Amino-Allyl MessageAmp II試劑盒， Ambion), amino-allyl cRNA在黑暗條件下與Cy3或Cy5單-反應NHS酯反應30分鐘。用 4M鹽酸羥胺終止反應。用RNeasy柱(Qiagen, Valencia, CA, U. S. Α.)將標記的RNA從未偶合的染料分子中分離出來。用水將樣品洗脫下來，并用分光光度計確定樣品濃度及染料的強度。將Cy3和 Cy5標記cRNA混合，在旋轉雜交爐中65°C條件下雜交17小時(60-mer01igo Microarray Processing Protocol ν 4. 1，Agilent Technologies)。芯片在室溫條件下洗滌并用安捷倫芯片掃描儀掃描，掃描分辨率為5 μ m, PMT 100 %，10 %。芯片和實驗設計7jc M 4x44K S 片(chip code 251524111447) (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)有45，152個點，包含1283個負對照和43，734個根據Rice AnnotationProject (RAP)的核酸序列及全長cDNA序列合成的寡核苷酸。Shimono等U007) 和Suwabe等Q008)用過同樣的芯片。總共43734個60mer的探針代表了 29，008個不同的水稻基因，包含28，840個推測的蛋白編碼基因及168個miRNA編碼基因。在28，840個基因中，22，532個基因有單一的探針，4619個基因有2個序列探針，1235個基因有3個探針，330個基因有4個探針，92個基因有5個探針，16個基因有6個探針，11個基因有7個探針，3個基因有8個探針，2個基因有9個探針。四張雙標芯片做了雜交。每種樣品有兩個獨立的生物學重復，花粉母細胞和三核花粉用Cy3標記。幼苗表達了水稻基因組的大部分基因，用Cy5進行標記，并在所有雜交中作為參照。公共參照一次制樣，在所有實驗中均勻取樣。芯片特征抽出及前處理通過TIFF圖像的觀察以確保每組飽和點的數量在2到10之間，并使用Agilent’ s Feature Extraction (Feature Extraction software 9. 5. 3)以^ % 的SSSi (Protocol for use with Agilent Gene Expression oligo microarraysVersion 5. 7, March 2008)對探針特征進行提取。芯片數據的質量通過以下幾點來保證1)生物學重復必須有r > = 0. 9的相關性；2)具有芯片數據過濾器。當它們的中值強度低于背景強度或者重復探針具有較大差異時，不規則的點必須進一步移除。例如中值強度在重復探針中的差異大于3倍方差。數據歸一化和統計分析在沒有扣除背景的情況下考慮數據的歸一化。本發明人沒有扣除背景強度的原因有兩點1)當背景被扣除后，低強度探針有高的信噪比；2)當背景噪聲被扣除后，重復間的相關系數降低。雖然loess歸一化在很多的雙標芯片中應用的很好，但是本發明人認為它不適用于本發明人的研究。Loess歸一化需要假設大多數基因超出強度范圍內表達或超出強度范圍上調和下調表達的基因數量是相同的。因為只有少量基因在PMC、TCP和幼苗中具有相似的表達水平，而大部分基因是有表達差異的。因此在本發明人的研究中使用了另外一種歸
一化方法。
為滿足對組織中基因差異表達進行描述，本發明人應用了兩步芯片間刻度歸一化。第一步，根據負對照探針進行基線轉換；第二步，基于組織中穩定表達的看家基因進行刻度歸一化。PMC、TCP和幼苗具有相似的基線。常規的看家基因例如肌動蛋白、微管蛋白或者組蛋白很可能有差異。但是101個在氧化磷酸化路徑中編碼酶的基因的總強度類似。為了評估陽性表達的基因，本發明人定義了負對照95%的強度作為基因表達的閾值。這一閾值是根據平衡假陽性和遺漏真實表達的基因的數量來確定的。對至少存在一個表達強度超過閾值的基因重復用Mudent’ s T-test進行檢測，ρ < 0. 001被認為是顯著表達的。在顯著表達基因中，前25%被認為是高表達的，中間50% 被認為是中度表達的，后25%被認為是低表達的。GeneSpring GX9. 0 (Agilent)用于分析芯片數據。微軟excel 2003和R軟件用于統計檢驗。在線基因組分析工具KEGG Pattway數據庫用于路徑的富集分析。本發明人的數據將存放于GEO數據庫。定量RT-PCR驗證芯片數據本發明人依據Tang等Q006)的方法運用反轉錄RNA結合STOR綠檢測在iCycler 儀(Bio-Rad)上進行定量實時PCR反應。II.實施例實施例1、水稻花粉母細胞的激光顯微切割粳稻品種日本晴未成熟花序中的雄蕊富含剛好進入減數分裂時期前的花粉母細胞(也稱小孢子母細胞)(圖1A，B)。對花藥進行染色體染色，胼胝質染色和周邊細胞層染色幫助判定這一特定發育時期(圖1C-E，圖2)。通過對材料準備方法的優化，本發明人運用激光捕獲顯微切割從這些花序的橫切面上分離了均一的花粉母細胞群落(圖1G-I)。從兩個獨立的花粉母細胞樣本中抽提出高質量的總RNA (約800個細胞/樣本) (圖 3A)。mRNA經線性擴增用于水稻基因組芯片雜交(圖;3B)。實施例2、水稻花粉母細胞的芯片分析本發明人使用Agilent公司的44k水稻基因組芯片，以三核花粉和一周幼苗作為對照，檢測花粉母細胞的基因表達譜。芯片上的探針(每個探針具有60bp長度)可檢測 29008個不同的水稻基因，其中包括觀840個已知的蛋白質編碼基因和168個miRNA編碼基因。而目前，NCBI庫中有四343個粳稻品種的基因記錄。因此本發明人使用的芯片涵蓋了目前已注釋基因的95%。在考慮了特定細胞類型的轉錄組分析結果基礎上進行芯片數據的處理。花粉母細胞的轉錄組數據和三核花粉的一起進行分析以便每一個探針表達值在統計學上確保數據質量的可靠。總的來說，生物學重復之間的相關系數高于0. 9。芯片數據的驗證本發明人運用定量RT-PCR以0s03g0268000，一個在花粉母細胞，三核花粉和幼苗中都高表達的磷酸酯酶編碼基因為對照，檢測了 13個基因的表達情況。檢測中，有兩個基因(0s06g04^900和0s04g0208600)屬于151個花粉母細胞特異表達基因之列，實時PCR 結果驗證了芯片數據是正確的(圖4)。
本發明人還用原位雜交的方法檢測了兩個基因(MSP1和SPL-like)，其結果證實了芯片數據。實施例3、在花粉母細胞中明顯表達的基因的數量有多少基因在花粉母細胞中確實進行了表達？從兩個花粉母細胞生物學重復的所有基因的雜交信號的密度分布圖，以及負對照探針的信號分布來看，本發明人判定至少59%的基因(17196Λ9008)在花粉母細胞中表達。其百分率高于三核華粉的41 % (11867Λ9008)，但低于幼苗的 72% (20783/29008)。另外，同時在花粉母細胞和幼苗中表達的基因數量(15902/17196,92. 5% )多于同時在三核花粉中表達的基因數量(10201/17196，59%)。結合減數分裂小孢子，四分體期，單核期花粉，二核期花粉，三核花粉和處于減數分裂時期的絨氈層細胞的轉錄組數據， 其中四分體期，單核期花粉的結果來自Hobo等的工作Q008) ；2008年，Suwabe等的主成分分析結果顯示花粉母細胞的轉錄組更接近幼苗的，而不同于減數分裂后的花粉/小孢子 (圖幻。分級的聚類系統圖顯示幼苗和減數分裂前的花粉母細胞，雄性性細胞和減數分裂進行期的細胞，四分體期的細胞聚集在一起，而稍后的單核期，二核期和三核花粉在一起。 這些結果進一步提示減數分裂完成后的細胞轉錄組存在顯著的變化。花粉母細胞中一些已知的減數分裂相關基因的表達方式與預期相符，說明芯片結果可靠。Agilent公司的60mer芯片在五個數量級的范圍內解析了基因表達的差異(信號分布范圍47到661955，圖4A中取對數值后5. 57到19. 34)，并且顯示了 mRNA濃度(也可代表表達水平)與信號強度線性相關，由此形成多于五個的數量級直到強度值接近飽和 (LeProust,2008)o 25%表達基因的對數值低于11，另外25%高于15。因此本發明人將對數值9到11，11到15和15以上分為表達水平低，中和高。從一些已知的水稻減數分裂相關基因和與已知的其它物種減數分裂相關基因同源的水稻基因在芯片結果中表達數據，本發明人看到這些基因中的大多數在花粉母細胞中表達，這和它們在減數分裂中預期作用一致。比如，基因PA^l，據報道作用于同源染色體的排列，其在花粉母細胞中的表達顯著升高，而在三核花粉或幼苗中沒有明顯表達。 Ameiotic 1的水稻同源基因(0s03g0650400)在花粉母細胞中的表達明顯高于在其它樣品中，這可能釋放了將蛋白表達水平歸結為mRNA表達的一些擔憂。據報道，玉米的ami基因在很多組織中高表達，但它只在減數分裂起始和進行中具有功能(Pawlowski WP, Wang CR, Golubovskaya IN, Szymaniak JM, Shid L, Hamant 0, Zhu Τ, Harper L, Sheridan WF, Cande WZ(2009)Maize AMEI0TIC1 is essential for multiple earlymeiotic processes and likely required for the initiation of meiosis. Proc Natl AcadSci USA 106(9) 3603-3608)。對于屬于多基因家族的基因來說，根據芯片數據可以找出某個成員更可能作用于減數分裂。比如，RAD21家族的四個基因中，只有0sRAD21-4在花粉母細胞中表達值明顯高于三核花粉和幼苗，而0sRAD21-3在三核花粉中高于其它兩組樣品；這和報道的 0sRad21-4，酵母Rec8的一個同源蛋白，對減數分裂是必須的結論是一致的(Siang LR, Tao JY, Wang SX, Chong K, Wang T (2006) The Rice 0sRad21_4, an orthologue of yeast Rec8 protein, is required for efficientmeiosis. Plant Mol Biol 60 :533-554),而0sRAD21-3，酵母RAD21的一個同源蛋白，對花粉發育是必須的(Tao JY, Zhang LR, Chong K, Wang T(2007)0sRAD21_3, an orthologue of yeast RAD21, is required for pollen development inOryza sativa. Plant J 51:919-930)。細胞周期蛋白可能在減數分裂進 'if^WM^Mi^^ (Hamant 0， Ma H, Cande WZ (2006) Genetics of meiotic prophase I inplants. Annu Rev Plant Biol 57:267-302)。芯片可檢測44個細胞周期相關的同源基因，本發明人的數據顯示了其中3個(0sllg0157100, 0s02g0438200和0s03g0203800), 另外還有已報道的可能作用于雄性減數分裂的OsSDS。S期激酶相關蛋白I(SKPl)是泛素介導蛋白水解路徑中SCF復合體的一個連接蛋白。擬南芥的SKPl-Iikel (ASKl)作用于交叉的解除和姐妹染色體的粘連(Yang Μ, Hu Y, Lodhi Μ, McCombie WR, Ma H (1999) The Arabidopsis SKP1—LIKE1 geneis essential for male meiosis and may control homologue separation. Proc NatlAcad Sci USA 96:11416—11421)。 ￠1 禾g 中 #￠17 個擬南芥SKPl-Iike基因的同源基因。本發明人的結果顯示其中兩個(0s07g0409500， 0s07g0624900)很可能作用于雄性減數分裂。對于一些在序列上有限相似的基因，表達譜數據提供了功能相似的一些信息。擬南芥的AGAM0US，一個MADS-box轉錄因子，誘導另一個對花粉原基L2細胞中孢子細胞專一性必須的 MADS-Iike 轉錄因子 SP0R0CYTELESS/N0ZZLE(Schiefthaler et al.，1999 ；Yang et al.，1999 ；Ito etal. ,2004) 水稻的 SP0R0CYTELESS(SPL)同源蛋白還沒有鑒定出。但本發明人的芯片數據和原位雜交結果顯示與擬南芥SPL弱相似的0s01g0212500可能和SPL 一樣作用于減數分裂。至今報道了沈個在早期雄蕊發育中優先上調表達的基因，因此暗示它們參與了水稻雄蕊發育的調控(Lu XC, Gong HQ, Huang ML, Bai SL, He YB，MaoX，Geng Ζ, Li SG, Wei L,Yuwen JS,Xu ZH,Bai SN(2006)Molecular analysis ofearly rice stamen development using organ-specific gene expression profiling. PlantMol Biol 61。芯片數據顯示所有這沈個基因在花粉母細胞中都表達，并且多數在花粉母細胞中表達值高于隨后的三核花粉時期。這和以前的報道相一致。實施例4、151個基因在花粉母細胞中表達，而在三核花粉或幼苗中不表達本發明人得到了三組芯片數據，其中兩組是兩種不同的細胞，一組是混合的組織。 這三種樣品代表了顯花植物生長周期中的重要階段孢子體時期(雙倍體，幼苗)，配子體時期(單倍體，三核花粉)和過渡時期(花粉母細胞，雙倍體細胞即將減數分裂期而產生單倍體)。由于對DNA模板的爭奪，減數分裂期間，轉錄不可能發生，而DNA只進行復制，配對和聯會，因此在花粉母細胞中，可能已經轉錄并積累了減數分裂過程所必須的mRNA。幼苗中的許多細胞只進行有絲分裂。由于三核花粉比兩個精細胞大，它的轉錄組主要反映營養細胞的基因表達情況。因此三核花粉代表了有絲分裂的期。花粉母細胞與幼苗和三核花粉的比較可看作減數分裂與有絲分裂的比較。在花粉母細胞中表達，而在幼苗或三核細胞中不表達的基因可能是減數分裂相關基因。經檢測，151個基因在花粉母細胞中表達，而在另兩種樣品中不表達。運用類似 KEGG路徑的方法對它們進行了歸類。其中，具有F-box的蛋白明顯富集(21個)。21個類F-box蛋白中的11個屬于水稻 F-box 蛋白超級家族(Xu G, Ma H, Nei M, Kong H(2009) Evolution ofF-box genesin plants !different modes of sequence divergence and theirrelationships with functional diversification. Proc Natl Acad Sci USA 106(3) :835-840)，其中 4個除了含有N端保守F-box外還含有FBD結構域。考慮到776個水稻F_box蛋白中只有31個含有另外的FBD結構域(不含LRR)，那么F-box蛋白的FBD亞家族在花粉母細胞中是富集的。 另一種F-box蛋白包含一個DUF295結構域，有兩個含DUF295結構域的蛋白在花粉母細胞中表達，而在三核花粉或幼苗中不表達。F-box蛋白是SkpI-RbxI-Cu 11-F-box蛋白(SCF) 泛素連接酶的底物識別組分。其余的3個基因包括0sl0g0141400 (可能編碼一個RPWO蛋白，26S蛋白水解酶復合體中非ATP酶調節亞基，據推測是負責多聚泛素鏈結合的復合體的一個組分)，0s07g0624900 (可能編碼一個S期激酶相關蛋白1 (SKPl)，可能是多亞基環指類 E3復合體中的連接蛋白)和0s05g0352700(—個含有環型域的蛋白，最接近擬南芥MEE12 的水稻同源蛋白)，它們也參與了泛素介導的蛋白質水解。Ds插入導致MEE12突變引起自交中遺傳比例的混亂(1. 01)，這M個SCF復合體基因的表達特異性的程度顯示了控制雄性減數分裂的機制可能是通過應用特異的組分包括一個環指蛋白，一個SKP和20個以上的 F-box蛋白進行泛素介導的蛋白質水解來改變大量的關鍵調控因子。在151個基因列中包括8個含有Pentatricop印tide r印eat (PPR)結構域的蛋白編碼基因。這8個基因占到151個花粉母細胞特異性表達基因的5.3%。而含有 Pentatricop印tide repeat (PPR)結構域的蛋白總數在水稻蛋白總數中只占0. 88%。因此這類蛋白在花粉母細胞特異性表達基因體也是富集的。這151個花粉母細胞特異性表達基因的具體分類和基因數見表1。表1
類型基因數1.代謝酶類脂酶類5蛋白酶類4查爾酮及二苯乙烯合酶類2細胞色素P4502分泌型過氧化物酶1纖維素合成酶51其他酶類82.遺傳信息加工類泛素介導的蛋白降解復合物成員F-box蛋白2權利要求
1.一種篩選水稻花粉母細胞特異性表達基因的方法，其特征在于，所述方法包括(1)利用激光捕獲顯微切割從水稻未成熟花序的切片中分離出花粉母細胞；(2)對花粉母細胞進行表達譜分析，并與處于有絲分裂時期的三核花粉和/或幼苗的表達譜進行比較，找出特異性在花粉母細胞中表達而不在三核花粉和/或幼苗中表達的基因，所述基因即是水稻花粉母細胞特異性表達基因。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水稻未成熟花序是水稻發育時期第5 期的未成熟花序。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，水稻未成熟花序的切片如下制備將水稻未成熟花序進行固定、石蠟包埋、切片、脫蠟、干燥，得到用于分離水稻母細胞的水稻未成熟花序的切片。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)包括在水稻未成熟花序的切片中將花粉母細胞標記出來，用紫外激光束將花粉母細胞與周圍細胞分開，收集花粉母細胞。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，包括將水稻未成熟花序的切片置于激光捕獲顯微切割儀器中，從放大的顯微圖中辨別出處于花藥室中的花粉母細胞/小孢子，并將部分切片分別通過染色確定花粉母細胞位置用作參照；根據參照將同批未經染色的幼嫩花藥橫切片在激光捕獲顯微切割儀顯示屏上花粉母細胞標記出來，經過焦距和能量的精細調整后，用紫外激光束將花粉母細胞與周圍細胞分開，再用近紅外激光束收集花粉母細胞。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)包括(a)對花粉母細胞進行RNA抽提，獲得總RNA；線性擴增總RNA，得到氨基-烯丙基 cRNA ；(b)以熒光染料Cy3-，Cy5-偶聯花粉母細胞的氨基-烯丙基cRNA，用于與水稻基因組芯片雜交，分析表達譜；將該表達譜與三核花粉和/或幼苗經相同處理得到的表達譜比較， 建立基于雜交信號絕對值的芯片數據分析方法，結合生物統計學找出可重復性地在花粉母細胞中顯著表達而不在三核花粉和/或幼苗中表達的基因，所述基因即是水稻花粉母細胞特異性表達基因。
7.—種權利要求1所述的方法篩選獲得的水稻花粉母細胞特異性表達基因。
8.一種啟動子，其指導基因在水稻花粉母細胞中特異性表達。
9.一種收集花粉母細胞群落的方法，其特征在于，所述方法包括利用激光捕獲顯微切割從水稻未成熟花序的切片中分離出花粉母細胞。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括在水稻未成熟花序的切片中將花粉母細胞標記出來，用紫外激光束將花粉母細胞與周圍細胞分開，收集花粉母細胞。
全文摘要
本發明涉及水稻花粉母細胞特異性表達基因。本發明找到了一種收集均一的花粉母細胞群落的優選方法，采用該方法可良好地分離出均一的花粉母細胞，獲得的細胞可用于篩選水稻花粉母細胞特異性表達基因以及特異性表達啟動子。
文檔編號C12N15/29GK102242113SQ20101017487
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月14日 優先權日2010年5月14日
發明者唐威華, 張棟, 湯湘, 趙仕蘭 申請人:中國科學院上海生命科學研究院