用于對全基因組進行快速作圖的納米流體裝置以及相關(guān)的分析系統(tǒng)和方法
【專利說明】用于對全基因組進行快速作圖的納米流體裝置以及相關(guān)的分析系統(tǒng)和方法
[0001 ] 相關(guān)申請
[0002]本申請要求2013年3月13日提交的美國臨時申請序列號61/778,746的優(yōu)先權(quán)，該臨時專利申請的內(nèi)容以參考的方式并入本文中，如同在本文的全文中敘述一樣。
_3] 關(guān)于聯(lián)邦政府資助的聲明
[0004]本發(fā)明是在由美國國立衛(wèi)生研究院所給予的資助號為HG002647的政府支持下完成。美國政府在本發(fā)明中具有某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明涉及多核酸的基因組特征分析。
【背景技術(shù)】
[0006]近來，業(yè)界對于將納米尺度部件并入芯片實驗室流體裝置中已產(chǎn)生相當(dāng)大的興趣。該興趣的起因在于在從微米尺度轉(zhuǎn)變到納米尺度中的若干優(yōu)點(和可有利地所實現(xiàn)的差異)。這些差異包括例如:雙層重疊(DL0)及其對電滲和電荷選擇透過性的影響、電場的局部增強、較高的表面積-體積比、對大的合成和生物聚合物的限制效應(yīng)、和熵效應(yīng)的新出現(xiàn)的重要性。參見例如Yuan等人，Electrophoresis(電泳)2007，28，595-610 ； Schoch等人，Rev.Mod.Phys.2008，80，839-883 ；和Kovarik等人，Anal.Chem.2009,81,7133-7140。納米尺度裝置的以往例子包括將多孔介質(zhì)和凝膠使用于色譜分離和具有納米尺度孔的濾膜。參見例如Lerman等人，B1polymers，1982,21，995-997；和Tong等人，IVLNano Lett.2004，4，283-287。然而，近來的研究工作集中于用于流體和分析物輸送工程幾何界限明確的管道以及將它們無縫隙地并入裝置中。參見例如Volkmuth等人，Nature 1992，358，600-602 ；和Striemer等人，Nature2007，445，749-753。這種規(guī)則結(jié)構(gòu)的優(yōu)點是在其內(nèi)部的壓力和場梯度、流體流動、和分子運動的相對簡單性，相比之下這些特性具有更曲折的網(wǎng)絡(luò)。例如，限定、表征及容易地建模這些系統(tǒng)的能力可以允許更好地理解分離機制和單分子物理學(xué)。參見例如Volkmuth等人，Nature 1992，358，600-602;Reisner等人，Phys.Rev.Lett.2005，94，196101 ；和Salieb-Beugelaar等人，Lab chip，2009，9，2508-2523。
[0007]最近，F(xiàn)IB銑削技術(shù)已被描述成用于形成納米流體裝置。參見Menard等人，《在絕緣基材中利用聚焦離子束銑削制作亞5nm納米通道》，Nano Lett.2011，11，512_517(于2010年12月20日發(fā)表)；和于2010年9月21日提交的名稱為“用于形成納米通道的方法、系統(tǒng)和裝置”的美國臨時專利申請序列號61/384,738(和相關(guān)的PCT申請PCT/US2011/052127)，這些文獻的內(nèi)容以參考的方式并入本文中如同在本文的全文中的敘述。除了 FIB銑削外，也可以采用適合于制作納米通道的多種其它方法，包括例如電子束光刻、納米壓印平板印刷、光亥IJ、模板法或模壓成型方案、以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的其它方法。
[0008]已有人提出了一些納米流體裝置，包括具有用于單分子感測和/或核酸測序的整體式微型電極(納米或微米尺度)的裝置。可替代地，由整個流體部件所構(gòu)成的整體式裝置可以提供對單分子輸送和檢測的更大控制。參見Menard等人，《一種用于在單個雙鏈DNA分子中執(zhí)行側(cè)向電導(dǎo)率測量的裝置》，六03似1102012，12，9087-9094(于2012年9月5日發(fā)表)；2011年9月12日提交(和相應(yīng)的正在審批的PCT/US13/054128)的名稱為“具有與流體感測納米通道相交的流體輸送納米通道的裝置及相關(guān)方法”的美國臨時專利序列號61/533，523;和2013年2月28日提交的名稱為“用于大分子的受控制的捕獲、捕集和輸送的具有整體式部件的納米流體裝置及相關(guān)的分析方法”的美國臨時專利序列號61/770,586，這些文獻的內(nèi)容以參考的方式并入本文中如同在本文全文中的敘述。將部件并入到單個整體裝置上可以使?jié)M足目前在例如DNA測序和醫(yī)療診斷領(lǐng)域中的分析需求的新方法和系統(tǒng)成為可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的實施例提供使染色體DNA的高通量限制性酶切作圖簡單化的裝置。
[0010]本發(fā)明的實施例包括納米流體分析系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包括:(a)長度在500μπι和10cm之間并且在檢測納米通道的尺寸相對于反應(yīng)納米通道減小的界面位置處合并入檢測納米通道中的反應(yīng)納米通道；(b)與反應(yīng)納米通道的進入部連接的微流體通道；(c)與微流體通道連接的第一電極；(d)在與反應(yīng)納米通道進入部間隔但與其接近的位置從反應(yīng)納米通道延伸并且與其流體連通的第一橫向流體通道；(e)與第一橫向流體通道連接的第二電極；(f)從位于第一橫向流體通道下游位置的反應(yīng)納米通道延伸并且與其流體連通的第二橫向流體通道；(g)與第二橫向流體通道連接的第三電極；(h)與檢測納米通道連接的第四電極；
(i)用于控制第一、第二、第三和第四電極的操作從而可控制地在防止片段無序化(例如，使DNA在反應(yīng)納米通道中反應(yīng)從而產(chǎn)生有序片段)的反應(yīng)納米通道內(nèi)部引導(dǎo)、加載和消化DNA的電路;和(j)與構(gòu)造成空間上且時間上確定片段大小由此能夠?qū)崟r或近實時地生成染色體DNA的有序限制性圖譜的檢測納米通道連接的電或光檢測器。
[0011 ]微流體通道可以包括構(gòu)造成部分地堵塞微流體流道的相互間隔的柱的陣列。
[0012]所述系統(tǒng)可以包括將微流體通道與流體輸送納米通道進入部連接的納米漏斗。
[0013]納米流體反應(yīng)通道可以具有含有由“U”形段所連接的多個緊密相隔的大體平行段的蜿蜒形狀。
[0014]可以將微流體通道、反應(yīng)納米通道、檢測納米通道及第一和第二流體橫向通道整體地并入到流體芯片上。
[0015]第一和/或第二橫向流體通道可以是具有在大約lnm和大約lOOnm之間的深度、及在大約20nm和大約2000nm之間的寬度的流體納米通道。
[0016]與檢測納米通道相比，反應(yīng)納米通道的長度可以大10和1000倍之間并且深度和/或?qū)挾却?和10倍之間。
[0017]微流體通道可以與一個或多個貯存池流體連通，至少一個貯存池包含用于DNA分析的全細胞。
[0018]用于分析的全細胞可以被用于基因組DNA提取的凝膠基質(zhì)所限定。
[0019]用于分析的全細胞可以被至少一個高和/或低密度柱陣列限定在微流體通道中，以便于基因組DNA的提取。
[0020]微流體進入通道包含具有DNA的全細胞。第二橫向流體通道在遠離反應(yīng)納米通道的一個端部合并入第二流體貯存池中。第二流體貯存池容納限制性內(nèi)切酶和輔助因子的溶液。
[0021]反應(yīng)納米通道可以是直的，并且可以具有在大約500μπι至大約2cm之間的長度。與檢測納米通道相比，反應(yīng)納米通道的長度大出大約10和大約1000倍之間并且深度和/或?qū)挾却蟪龃蠹s2和大約10倍之間。
[0022]所述系統(tǒng)可包括第二反應(yīng)納米通道，該通道與在第二反應(yīng)納米通道上的入口端上的流體微通道流體連通并且在第二反應(yīng)納米通道的相反的外出端處合并入各自的第二檢測納米通道中。
[0023]其它實施例涉及納米流體分析芯片。這些芯片包括:(a)適合于利用具有柱陣列的微流體通道從全細胞、細胞核、全染色體或者長DNA分子的其它來源中提取基因組DNA的微流體入口 ；(b)長度在500μηι和10cm之間的反應(yīng)納米通道，該反應(yīng)納米通道具有連接到微流體入口的進入部；(c)在由納米通道尺寸減小所限定的交匯處與反應(yīng)納米通道的外出端合并的檢測納米通道；(d)從與反應(yīng)納米通道的進入部間隔但與其接近的反應(yīng)納米通道流體連通的第一橫向納米通道;和(e)從位于第一橫向流體納米通道下游位置的反應(yīng)納米通道延伸并且與其流體連通的第二橫向流體納米通道。
[0024]芯片也可包括存在于反應(yīng)納米通道和微流體入口之間并且將這兩者加以連接的納米漏斗。
[0025]芯片可以包括多個貯存池，這些貯存池包括與微流體入口流體連通的至少一個貯存池、與第一橫向納米通道流體連通的至少一個貯存池、與第二橫向納米通道流體連通的至少一個貯存池、和與檢測納米通道的一端流體連通的至少一個貯存池。
[0026 ]微流體通道中的柱陣列可以包括軸向地相互間隔的陣列的多個段。
[0027]柱陣列可以構(gòu)造成大體上延伸跨過微流體通道的整個寬度。
[0028]其它實施例涉及從全細胞、細胞核、全染色體或者長DNA分子的其它來源中生成基因組DNA的有序限制性圖譜的方法。這些方法包括:(a)提供一種具有合并入反應(yīng)納米通道中的流體微通道的裝置，該反應(yīng)納米微通道在其中納米通道直徑尺寸減小的界面處合并入檢測納米通道；(b)在微通道中使全細胞溶解并且使具有最小分段的DNA去染色質(zhì);然后(c)將完整的DNA分子導(dǎo)入反應(yīng)納米通道中；然后(d)在反應(yīng)納米通道中利用限制性內(nèi)切酶將完整的DNA片段化。反應(yīng)納米通道的尺寸和構(gòu)造被設(shè)計成使得片段保持原來的順序直到將它們注入檢測納米通道中。所述方法還包括:(e)在沿檢測納米通道的一個或多個位置檢測信號，以便按片段沿長DNA分子的順序?qū)ζ芜M行作圖。
[0029]所述裝置可以包括與合并入反應(yīng)納米通道中的流體微通道流體連通的至少一個貯存池。可以通過利用貯存池導(dǎo)入用于分析的細胞、細胞核、全染色體、或者長DNA分子的其它來源，而實施導(dǎo)入步驟。所述方法也可以包括提供用于將全細胞固定的凝膠基質(zhì)和/或高密度柱陣列，然后使細胞溶解，提取出DNA，以及可選地將DNA染色，然后將完整的DNA分子導(dǎo)入反應(yīng)納米通道中。
[0030]所述裝置可以包括與反應(yīng)納米通道的入口端流體連通的具有柱陣列的微流體通道、和與位于微流體通道下游位置的反應(yīng)通道流體連通的第一橫向通道。
[0031]所述方法可以包括:通過將電壓施加到微流體和橫向通道以便在反應(yīng)納米通道的進入?yún)^(qū)域處產(chǎn)生偏壓而引導(dǎo)和加載樣品。
[0032]可以利用在接近反應(yīng)通道入口處的受控制的電壓或濃度極化梯度而實施引導(dǎo)步驟，使得最初DNA分子不經(jīng)受超過DNA拉伸強度的應(yīng)變并且不發(fā)生機械斷裂。
[0033]在引導(dǎo)步驟之后，可以通過改變施加到反應(yīng)納米通道和橫向納米通道的電壓以便以在大約lym/s和大約1mm/ s之間的速率將全部DNA分子拉入反應(yīng)納米通道中而實施加載，使得DNA分子的尾端具有充分的時間擴散地從任何柱的纏結(jié)分離并且避免機械斷裂。
[0034]可以通過改變施加到反應(yīng)納米通道和橫向納米通道的電壓以便將限制性內(nèi)切酶和輔助因子導(dǎo)入反應(yīng)納米通道中所含有的DNA而實施限制性消化的反應(yīng)，然后允許反應(yīng)進行直到所有限制性位點已經(jīng)被消化。
[0035]施加到反應(yīng)納米通道和橫向納米通道的電壓可以抑制或防止將限制性內(nèi)切酶和輔助因子導(dǎo)入微流體通道中并因此防止在反應(yīng)納米通道外部的DNA分子的消化。
[0036]可以通過改變施加到反應(yīng)納米通道和橫向納米通道的電壓以便驅(qū)動片段迀移到在反應(yīng)納米通道與檢測納米通道之間的界面，而實施有序限制性片段的檢測。
[0037]在一些實施例中，可以利用連續(xù)施加的恒定電壓來實現(xiàn)對限制性片段的引導(dǎo)、加載、限制性消化、和有序檢測。
[0038]與反應(yīng)納米通道相比，檢測納米通道直徑的尺寸可以減小50%至99%之間，由此導(dǎo)致當(dāng)各片段到達交匯處時輸送速率的增加和各相鄰片段的分離。然后可以實施檢測步驟，以便對經(jīng)過檢測納米通道的分離片段的輸送進行檢測。
[0039]可以通過用光學(xué)或電學(xué)的方法在沿檢測納米通道的一個或多個位置對片段進行檢測，而實施檢測步驟。
[0040]所述方法可以包括:通過對檢測信號的持續(xù)時間或積分幅度進行檢測而確定片段大小。
[0041 ]所述裝置可以是流體分析芯片。
[0042]該芯片可以結(jié)合與芯片連接的輸送系統(tǒng)而使用，其中輸送系統(tǒng)構(gòu)造成施加電動力學(xué)、壓力或向心力中的至少一種從而將基因組DNA及其片段經(jīng)過反應(yīng)納米通道輸送進入檢測納米通道。
[0043]本發(fā)明的其它實施例涉及用于與流體分析芯片相互作用的方法。這些方法包括:(a)控制進樣、細胞溶解、及DNA提取和染色；(b)引導(dǎo)DNA并且將所提取的DNA加載入反應(yīng)納米通道中，在反應(yīng)納米通道中利用限制性內(nèi)切酶和輔助因子進行限制性消化，和經(jīng)過檢測納米通道的限制性片段的有序輸送；(c)在經(jīng)過檢測納米通道的輸送期間，用電子方法檢測限制性片段；(d)實時或近實時地用電子方法分析來自DNA分子的限制性片段大小;和(e)用電子方法從多個DNA分子中生成共有性限制性圖譜，并且評定圖譜質(zhì)量以評估是否需要補充的取樣。
[0044]本發(fā)明的其它方面涉及用于與流體分析芯片相互作用的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包括:(a)用于控制進樣、細胞溶解、及DNA提取和染色的裝置；(b)用于控制DNA引導(dǎo)和加載入反應(yīng)納米通道、在反應(yīng)納米通道中使用限制性內(nèi)切酶和輔助因子的限制性消化、和經(jīng)過檢測納米通道的限制性片段的有序輸送的裝置；(c)用于在經(jīng)過檢測納米通道輸送期間檢測限制性片段的裝置；(c)利用實時或近實時分析對來自DNA分子的限制性片段大小進行分析的裝置;和(e)用于從多個DNA分子中生成共有性限制性圖譜，并且評定圖譜質(zhì)量以評估是否需要進行補充取樣的裝置。
[0045]本發(fā)明的其它實施例涉及流體分析裝置。