專利名稱：一種不對稱菁染料的制備及其用于牛血清白蛋白檢測的方法
技術領域：
本發明涉及一種不對稱菁染料，具體涉及一種不對稱菁染料的制備及其用于微量牛血清白蛋白檢測的方法，屬于化工高新技術化學及生物化學分析技術領域。
背景技術：
菁染料是一種商品化的生物熒光標記用染料，自從1856年Williams發現“豆粉”藍菁染料以來，光導性能優異的各類菁染料一直受到學者們的廣泛關注。每年在各種不同的應用領域都有大量的文獻相繼報道。如用作感光膠片的鹵化銀乳劑的增感劑及無機半導體材料、光盤的記錄介質、太陽能電池光敏劑、激光材料、生物分子的熒光探針等。菁染料的合成開發主要研究組有國外Patonay組和Waggoner組等。廈門大學等對花菁染料所做的研究工作較多，他們主要是借鑒Narayanant和Patonay等人的工作來合成用于標記生物大分子的染料。而姚祖光研究組主要研究其在CD-R光盤介質方面的應用。噻唑橙類染料是由Lee等人發現的一類用于網狀紅細胞分析的不對稱菁染料，該類染料與核酸結合后熒光顯著增強，目前已被研究者熟悉和使用。但該類染料與牛血清白蛋白相互作用的文獻報道不多。本發明提供了一種不對稱菁染料用于牛血清白蛋白分子的檢測方法。該方法通過染料與牛血清白蛋白的相互作用，利用熒光分光光度計精確的檢測出微量的牛血清白蛋白。本發明簡單實用，線性響應范圍寬，在牛血清白蛋白的定量分析檢測領域具有潛在的實際應用價值。

發明內容
本發明的目的在于克服上述不足之處，提供一種不對稱菁染料的制備方法及其用于牛血清白蛋白分子的檢測方法。該發明合成了一類不對稱菁染料，該類染料對微量的牛血清白蛋白具有熒光響應，染料溶液自身幾乎無熒光，加入微量的牛血清白蛋白溶液后，染料與蛋白分子相互作用，使染料發出強熒光，依據加入蛋白的量和熒光強度之間呈線性關系，可以用于定量檢測牛血清白蛋白分子。按照本發明提供的技術方案，一種用于牛血清白蛋白檢測的不對稱菁染料，結構通式如下
X=S; O; C(CH3)2 Ri=(CH2)mCH3, m=0~7 R2=(CH2)nOH, n=1~6
其中X為硫原子、氧原子或-C (CH3)2，優選硫原子和氧原子況為長鏈烷基-(CH2)mCH3，m = O 7，優選m = O 2 ;另一端為喹啉環，喹啉環中的氮原子上連接的R2為一端含有羥基的長鏈烷基-(CH2) ηΟΗ，η = I 6，優選η = I 3。其中m、η為正整數。將不對稱菁染料配置成的染料母液加入到pH值4 8的磷酸鹽緩沖溶液中，配制成檢測牛血清白蛋白的熒光試劑，同時將牛血清白蛋白配制成牛血清白蛋白溶液，然后將牛血清白蛋白溶液加入到熒光試劑中，用熒光光譜儀連續掃描記錄下一定濃度的熒光試劑及分批次加入牛血清白蛋白溶液以后的熒光光譜圖，記錄最大熒光發射強度，以牛血清白蛋白的濃度為橫坐標、最大熒光發射強度為縱坐標做成標準曲線；然后將未知濃度的牛血清白蛋白樣品，在同樣的條件下與牛血清白蛋白溶液作用，測其熒光光譜圖，取最大熒光強度值，在標準曲線上即得到未知樣品的牛血清白蛋白的濃度。一種用于牛血清白蛋白檢測的不對稱菁染料的制備方法，由式(2)所示化合物與式(3)所示化合物通過與式(4)所示化合物經縮合反應制得；
權利要求
1.一種用于牛血清白蛋白檢測的不對稱菁染料，其特征是結構通式如式(I)所示
2.一種用于牛血清白蛋白檢測的不對稱菁染料的制備方法，其特征是由式(2)所示化合物與式(3)所示化合物通過與式(4)所示化合物經縮合反應制得；
3.如權利要求2所述用于牛血清白蛋白檢測的不對稱菁染料的制備方法，其特征是步驟(I)所述溶劑為甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、乙醚或乙腈。
4.如權利要求2所述用于牛血清白蛋白檢測的不對稱菁染料的制備方法，其特征是步驟(I)所述鹵代烷為溴代烷、碘代烷或對甲基苯磺酸甲酯。
5.如權利要求2所述用于牛血清白蛋白檢測的不對稱菁染料的制備方法，其特征是步驟⑶所述溶劑為醋酸、丙酸、甲醇、乙醇或乙腈。
6.如權利要求2所述用于牛血清白蛋白檢測的不對稱菁染料的制備方法，其特征是步驟(4)所述金屬鈉鹽或鉀鹽為氯化鈉、溴化鈉、碘化鈉、氟硼酸鈉、氯化鉀、溴化鉀、碘化鉀或氟硼酸鉀。
7.一種用于牛血清白蛋白檢測的不對稱菁染料的熒光測試方法，其特征是步驟如下 (1)染料母液的配制精確稱取I 50mg菁染料純品,加入I IOOmL無水乙醇溶解，配制成10_6 10_3mol/L的染料母液冷藏備用； (2)牛血清白蛋白溶液的配制精確稱取500mg牛血清白蛋白，加入2mL二次蒸餾得到的蒸餾水中溶解，配制成1(Γ6 l(T3mol/L的牛血清白蛋白母液； (3)緩沖溶液的選擇選擇pH值在4 8的緩沖液； (4)數據記錄精確移取I 3mL步驟(3)配置的緩沖溶液到IcmXIcm的熒光比色皿中，精確移取100 μ L步驟⑴制備的染料母液到比色皿中，將緩沖溶液和染料混合物攪拌均勻；3-5min后，采用熒光光譜儀測量其熒光光譜，記錄掃描數據； (5)牛血清白蛋白濃度測定在步驟(4)制備得到的混合物中分次加入10μL步驟(2)制備的蛋白質母液，采用熒光光譜儀分別掃描其熒光光譜圖，記錄數據；依據蛋白質加入量和總體積換算成濃度后和熒光發射強度最大值之間做曲線，得到標準曲線；標準曲線做好后，相同的條件下，取未知濃度的牛血清白蛋白溶液測量熒光光譜，通過熒光發射最大值，在標準曲線中找到對應的牛血清白蛋白濃度，即測知其濃度值。
8.如權利要求3所述用于牛血清白蛋白檢測的不對稱菁染料的熒光測試方法，其特征是步驟⑴所述溶劑為甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺DMF或二甲基亞諷DMSO。
9.如權利要求3所述用于牛血清白蛋白檢測的不對稱菁染料的熒光測試方法，其特征是所述緩沖溶液為PH為7、濃度為O. 2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液、羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液、Tri-HCl緩沖溶液或醋酸-醋酸銨緩沖溶液。
10.如權利要求3所述用于牛血清白蛋白檢測的不對稱菁染料的熒光測試方法，其特征是所述熒光光譜儀激發和發射的狹縫寬度值選擇3 20，選用最大激發波長為400 620nm。
全文摘要
本發明涉及一種不對稱菁染料，具體涉及一種不對稱菁染料的制備及其用于牛血清白蛋白檢測的方法，屬于化工高新技術化學及生物化學分析技術領域。本發明提供了實驗室定量測量微量牛血清白蛋白的一種簡單可操作的方法，普通的實驗室科研人員可以依據此原理，合成出合適的染料，并經過配制溶液后作出標準曲線，用于牛血清白蛋白的微量定量分析。其制備2-甲基-3-烷基取代苯并噻唑季銨鹽時，收集產物后繼續加熱回流反應，回流結束后冷卻過濾，母液再重復加熱回流，冷卻過濾，大大提高了產物的產率，其產率由原來的20%提高到95%以上。采用熒光光譜儀對微量牛血清白蛋白進行檢測，檢測靈敏度高，可以達到微摩爾級的染料濃度；染料合成方法簡單，采用重結晶方法，純化效率高。
文檔編號C09B23/06GK102618060SQ20121007086
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月17日 優先權日2012年3月17日
發明者張丹, 郭琳, 陳秀英 申請人:江南大學