唑菌酯的熒光標記方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種唑菌酯的熒光標記方法及其應用。提出了一種步驟簡單、快速、高效的農藥唑菌酯熒光標記的方法，即在催化劑的作用下將唑菌酯用乙二胺進行酰胺化，得到的唑菌酯衍生物在氫氧化銀的輔助下進一步同丹磺酰氯酰胺化引入熒光基團，經丹磺酰氯標記的唑菌酯具有明顯的熒光特性，采用熒光共聚焦顯微鏡技術可確定熒光標記唑菌酯在生物體內的移動部位，進而可通過丹磺酰氯熒光標記唑菌酯的行蹤來追蹤確定其代謝途徑。
【專利說明】唑菌酯的熒光標記方法及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種對唑菌酯實施熒光標記的方法及其應用，以用于唑菌酯代謝途徑 的檢測。

【背景技術】
[0002] 唑菌酯是一種甲氧基丙烯酸酯類高效低毒殺菌劑，具有廣譜的殺菌活性，以唑菌 酯為主要活性組分的農藥具有非常廣泛的使用范圍，可有效防治黃瓜霜霉病、小麥白粉病， 對油菜菌核病菌、葡萄白腐病菌、蘋果輪紋病菌、蘋果斑點落葉病菌等也具有良好的抑菌活 性。
[0003] 但迄今為止，唑菌酯及其以唑菌酯為主要活性組分的農藥還沒有獲得農業部的農 藥登記許可證書，更不能在國外直接銷售，一個主要原因是沒有進行完整的藥理實驗和環 境轉移實驗，也就是完整的農藥安全性評價。
[0004] 放射性同位素標記是藥物代謝研究經常采用的一種方法，該技術靈敏度高、易于 代謝產物的跟蹤，但衰變很快的放射性元素通常不易引入唑菌酯中，再有放射性活度對生 物體的作用達到一定劑量時，會改變機體的生理狀態，產生輻射效應，還存在半衰期短、費 用高、檢測時間長、特異性差，操作危險、不能反映藥物分子在代謝過程中發生的結構變化 等缺點。有專利提出在唑菌酯標記方面，采用 14c進行標記的《殺菌劑唑菌酯14c標記化合 物的合成方法》，申請號：201010558062. 6。由于14C半衰期較長，利用其放射性（活度）進 行檢測時，存在靈敏度低的問題。


【發明內容】

[0005] 本發明目的是為解決現有技術的不足，提出一種步驟簡單、快速、高效的農藥唑菌 酯熒光標記的方法。可實現對唑菌酯代謝途徑的研究，在高靈敏度條件下進行檢測分析與 追蹤。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明采取以下技術方案：在催化劑的作用下將唑菌酯用 乙二胺進行酰胺化，得到的唑菌酯衍生物在氫氧化銀的輔助下進一步同丹磺酰氯酰胺化引 入熒光基團。
[0007] 所述的將唑菌酯用乙二胺進行酰胺化，是將唑菌酯溶解于甲醇中并以氧化鈣作為 催化劑，按摩爾比1:3至1:10加入乙二胺，在40°C?45°C溫度下充分反應后過濾、蒸干反 應液，用二氯甲烷：甲醇=40 :1洗脫液進行柱層析純化，得到唑菌酯衍生物。
[0008] 所述的用丹磺酰氯酰胺化引入熒光基團，是將所述的唑菌酯衍生物和丹磺酰氯按 摩爾比1:1. 05至1:1. 15加入到二氯甲烷中，并加入催化劑4-二甲氨基吡啶（DMAP)、縛酸 劑三乙胺和氫氧化銀，室溫下完全反應，過濾后，用二氯甲烷：甲醇=40 :1洗脫液進行柱層 析純化，得到丹磺酰氯熒光標記的唑菌酯，收率為93%，總收率為79%。
[0009] 本發明方法制備的丹磺酰氯熒光標記的唑菌酯特別適用于農藥的安全性檢測，即 采用熒光共聚焦顯微鏡技術可確定熒光標記唑菌酯在生物體內的移動部位，進而可通過丹 磺酰氯熒光標記唑菌酯的行蹤來追蹤確定其代謝途徑。
[0010] 本發明唑菌酯的熒光標記方法，較同位素標記方法具有步驟簡單、快速、高效的優 點。丹磺酰氯作為熒光衍生試劑與含有伯胺官能團化合物進行鍵合標記，具有簡便、快速、 靈敏、穩定等特點，經丹磺酰氯標記的唑菌酯還具有不影響其殺蟲效果的特點，其殺菌活性 對黃瓜黑星病菌的EC50值與唑菌酯106mg/L的EC50值相近似，離體殺菌活性達到80%以 上。所制得的丹磺酰氯熒光標記的唑菌酯作用于hela細胞時，觀察其熒光信號，可追蹤其 移動部位，標記效果好、安全可靠，通過熒光標記唑菌酯的行蹤，可更加有效地追蹤其代謝 途徑。本發明將在農藥唑菌酯代謝過程的研究中發揮重要作用，實際應用價值高。
[0011] 熒光標記法在生命科學、現代分子生物學及藥物學等領域得到廣泛應用，具有操 作簡便、高靈敏度、重現性好等特點。以丹磺酰氯為標記物的技術途徑通常是要求底物上含 有胺基或需要在底物上引入胺基，再通過酰胺化引入發光基團。采用常規有機合成方法， 通過酯的胺解反應，在唑菌酯上引入胺基的效率較低，通常收率只有?50% ;通過酰胺引入 發光基團，因形成的形成鹽酸三甲胺，受平衡影響導致目標產物收率低，通常只有?65%左 右。因此，采用常規的有機合成途徑兩步總收率僅為30%，進而造成唑菌酯與熒光標記物的 巨大浪費。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是唑菌酯全掃描質譜譜圖；
[0013] 圖2是唑菌酯[Μ+ΗΓ413. 2二級串聯質譜譜圖；
[0014] 圖3是唑菌酯衍生物質譜譜圖；
[0015] 圖4是丹磺酰氯突光標記唑菌酯的質譜譜圖；
[0016] 圖5是丹磺酰氯熒光標記唑菌酯的核磁譜圖GHNMR譜圖溶劑d6-DMS0);
[0017] 圖6是唑菌酯及其衍生物和熒光標記物的紫外譜圖；
[0018] 圖7是丹磺酰氯熒光標記唑菌酯的高效液相色譜譜圖；
[0019] 圖8是丹磺酰氯熒光標記唑菌酯表面增強拉曼光譜；
[0020] 圖9是丹磺酰氯熒光標記唑菌酯在hela細胞內的共聚焦顯微鏡成像照片。

【具體實施方式】
[0021] 通過以下實施例對本發明作進一步詳細說明.
[0022] 實施例1
[0023] 丹磺酰氯熒光標記的唑菌酯的制備。
[0024] a.將唑菌酯用乙二胺進行酰胺化：
[0025] 稱取412mg(lmmol)唑菌酯，加入10mL甲醇，加入經500°C焙燒的固體堿氧化鈣 200mg，滴加0. 67mL (?lOmmol)乙二胺，緩慢升溫至4(TC后反應6小時。過濾后，蒸干反應 液，制備色譜柱層析純化（洗脫液組成二氯甲烷：甲醇=20:1)得374mg (0. 85mmol)唑菌酯 衍生物，收率為85% ;化學反應式如下：
[0026]

【權利要求】
1. 一種唑菌酯的熒光標記方法，其特征在于，包括如下步驟：將唑菌酯用乙二胺進行 酰胺化，得到的唑菌酯衍生物進一步用丹磺酰氯酰胺化引入熒光基團。
2. 根據權利要求1所述的唑菌酯的熒光標記方法，其特征在于，所述的將唑菌酯用乙 二胺進行酰胺化，是將唑菌酯溶解于甲醇中并以氧化鈣作為催化劑，按摩爾比1:3至1:10 加入乙二胺，在40°C?45°C溫度下充分反應后過濾、蒸干反應液，用二氯甲烷：甲醇=40 :1 洗脫液進行柱層析純化，得到唑菌酯衍生物。
3. 根據權利要求1所述的唑菌酯的熒光標記方法，其特征在于，所述的用丹磺酰氯酰 胺化引入熒光基團，是將所述的唑菌酯衍生物和丹磺酰氯按摩爾比1:1. 05至1:1. 15加入 到二氯甲烷中，并加入催化劑4-二甲氨基吡啶、縛酸劑三乙胺和氫氧化銀，室溫下完全反 應，過濾后，用二氯甲烷：甲醇=40 :1洗脫液進行柱層析純化，得到丹磺酰氯熒光標記的唑 菌酯。
4. 用權利要求1所述方法所獲得的丹磺酰氯熒光標記唑菌酯在農藥的安全性檢測中 的應用，采用熒光共聚焦顯微鏡技術可確定熒光標記唑菌酯在生物體內的移動部位，進而 可通過丹磺酰氯熒光標記唑菌酯的行蹤來追蹤確定其代謝途徑。
【文檔編號】C09K11/06GK104193682SQ201410348233
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月21日 優先權日:2014年7月21日
【發明者】石磊, 李 杰, 程舸, 劉曉梅 申請人:吉林大學