本發(fā)明涉及的是一種生物納米材料領(lǐng)域的技術(shù)，具體是一種在稀土上轉(zhuǎn)換納米材料表面修飾蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
上轉(zhuǎn)換納米材料(Upconversion Nanoparticles，簡稱UCN)，如Yb、Tm、Ho或其他稀土元素?fù)诫s的NaLnF4納米顆粒(Ln為鑭系元素)，是一類吸收長波長(紅外光)、低能量光子，發(fā)射短波長(可見光)、高能量光子的新型熒光納米材料。與傳統(tǒng)的下轉(zhuǎn)換納米材料如量子點(diǎn)，納米金等對比，UCN具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如優(yōu)異的光學(xué)穩(wěn)定性、高化學(xué)穩(wěn)定性、低毒性，另外在近紅外光激發(fā)下具有組織穿透能力深、對生物組織無損傷、近乎零背景熒光干擾、成像靈敏度高等諸多優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用前景，如生物標(biāo)記、細(xì)胞成像、病變檢測、DNA檢測、生物傳感等。
然而，通過現(xiàn)有方法獲得的純UCN表面沒有可以利用的基團(tuán)，使生物活性分子無法直接固定于UCN表面，限制了生物相容性、毒性等生物化學(xué)性質(zhì)的改善，并限制其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。因此對UCN的表面進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾是其在生物醫(yī)用領(lǐng)域應(yīng)用的重要需求之一。
現(xiàn)有憑借表面靜電吸附生物活性分子的方法，也有對UCN表面通過SiO2層包裹后再通過硅烷偶聯(lián)劑的偶聯(lián)作用進(jìn)行修飾的方法。這些方法或穩(wěn)定性、重現(xiàn)性不高，或過程繁瑣、效率不高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)連接過程復(fù)雜、修飾效率較低等缺陷，提出一種上轉(zhuǎn)換納米材料的表面修飾方法，能簡便、高效地在上轉(zhuǎn)換納米材料表面通過直接硅烷化的方式進(jìn)一步耦聯(lián)蛋白質(zhì)生物活性分子。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
本發(fā)明涉及一種上轉(zhuǎn)換納米材料的表面直接硅烷化方法，通過向分散于溶劑中的UCN滴加硅烷偶聯(lián)劑并充分反應(yīng)后得到表面包覆SiO2殼及修飾有氨基的UCN。
所述的上轉(zhuǎn)換納米材料UCN包括但不限于：NaYF4、NaLnF4等摻雜稀土元素的上轉(zhuǎn)換納米材料。
所述的溶劑，采用但不限于環(huán)己烷。
所述的溶劑中優(yōu)選加有表面活性劑且pH值為8～9。
所述的表面活性劑采用壬基酚聚醚類表面活性劑，優(yōu)選采用CO-520，通過氨水調(diào)節(jié)堿性環(huán)境。
所述的硅烷偶聯(lián)劑采用三烷氧基型硅烷偶聯(lián)劑，優(yōu)選采用APTS，制備得到修飾有氨基的SiO2殼層，不僅可以有效改善UCN的生物相容性等化學(xué)性質(zhì)，而且為進(jìn)一步的表面修飾耦聯(lián)蛋白質(zhì)分子做了基礎(chǔ)。
所述的表面包覆SiO2殼及修飾有氨基的UCN，具體通過以下方式制備：
1)稱量UCN粉末分散于10～1000mL環(huán)己烷中，相應(yīng)的質(zhì)量與體積比為1:1，超聲8～12min分散均勻；
2)加入壬基酚聚醚類表面活性劑，超聲8～12min后室溫磁力攪拌1～1.5h；
3)加入氨水，調(diào)節(jié)溶液體系的pH值為8～9后室溫磁力攪拌20～40min；
4)緩慢滴加三烷氧基型硅烷偶聯(lián)劑于反應(yīng)溶液體系中，攪拌36～52h；
5)取出反應(yīng)產(chǎn)物，采用離心方法(9000r/min，6min)，加入無水乙醇(乙醇與產(chǎn)物溶液體積比至少大于1:1)沉淀并用超純水清洗3～4遍，收集沉淀物真空冷凍干燥16～32h即可得到表面包覆SiO2殼及修飾有氨基的上轉(zhuǎn)換納米材料。
本發(fā)明涉及一種UCN表面修飾蛋白質(zhì)生物活性分子的方法，將上述表面包覆SiO2殼及修飾有氨基的UCN分散于溶劑中得到納米粒子分散液，并將蛋白質(zhì)生物活性分子分散于緩沖液中得到蛋白質(zhì)溶液，然后將納米粒子分散液與蛋白質(zhì)溶液混合后加入NHS和EDC作為催化劑并充分反應(yīng)得到表面修飾蛋白質(zhì)的上轉(zhuǎn)換納米材料。
所述的納米粒子分散液與蛋白質(zhì)溶液的溶質(zhì)質(zhì)量比優(yōu)選為1:2。
所述的溶劑，優(yōu)選采用去離子水。
所述的緩沖液，優(yōu)選采用PBS緩沖液。
所述的蛋白質(zhì)生物活性分子，包括但不限于：HER-2抗體、血清蛋白、酶等蛋白質(zhì)分子等。
所述的表面修飾蛋白質(zhì)的上轉(zhuǎn)換納米材料，具體通過以下方法制備得到：
a)稱量上述表面包覆SiO2殼及修飾有氨基的UCN和蛋白質(zhì)，將UCN分散于1～1000mL超純水中配制UCN分散溶液，將蛋白質(zhì)生物活性分子溶于4～1000mL的濃度為10mM的PBS緩沖溶液(pH7.4)中。
b)按照溶質(zhì)質(zhì)量比為1:2的比例量取上述納米粒子分散液和蛋白質(zhì)溶液并混合，然后加入足量N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶液作為催化劑；將混合溶液體系室溫?cái)嚢?～5小時(shí)；
c)取出反應(yīng)物，采用離心方法(9000r/min，6min)，加入超純水清洗3～4次，收集沉淀物分散于超純水中或真空冷凍干燥后冷藏保存，即得到表面修飾蛋白質(zhì)的上轉(zhuǎn)換納米材料。
本發(fā)明涉及一種通過上述方法制備得到的表面修飾有蛋白質(zhì)生物活性分子的UCN的應(yīng)用，將其作為特異性靶向標(biāo)記物，應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)影像、重大疾病治療或體外生物檢測中。
技術(shù)效果
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)效果包括：
1.室溫即可進(jìn)行，制備方法過程優(yōu)化簡便，生產(chǎn)周期短；
2.重復(fù)性、穩(wěn)定性高；
3.表面耦聯(lián)蛋白質(zhì)分子的適用范圍廣泛，如抗體、血清蛋白、酶等蛋白質(zhì)分子類型，可針對需求選擇特異性蛋白質(zhì)分子進(jìn)行表面修飾，拓展了本發(fā)明在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍等。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
本實(shí)施例包括以下步驟：
1)稱取1000mgNaYF4：Yb，Tm@NaGdF4上轉(zhuǎn)換納米顆粒，分散于1000mL環(huán)己烷中，超聲處理8～12min使其分散均勻。
2)加入50mL的CO-520，超聲處理8～12min，室溫磁力攪拌1.5h。加入10mL氨水調(diào)節(jié)混合體系pH為8.5-9，室溫磁力攪拌30min。
3)逐滴加入4mLAPTS(邊攪拌邊滴加)，室溫磁力攪拌48h。取出反應(yīng)后混合液采用離心方法(9000r/min，6min)，加入無水乙醇產(chǎn)生沉淀，并用超純水清洗3次。真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為包覆連有氨基的SiO2殼的上轉(zhuǎn)換納米材料。
4)稱取UCN@SiO2-NH2 5mg，分散于1mL超純水中，超聲均勻。
5)稱取10mgHER2抗體，溶于4mLPBS緩沖溶液(pH7.4)中。
6)將兩溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各3mL，室溫磁力攪拌4h。
7)取出反應(yīng)后溶液，采用離心方法(9000r/min，6min)，加入超純水清洗3次，真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為表面修飾HER2抗體的上轉(zhuǎn)換納米材料。
實(shí)施例2
本實(shí)施例包括以下步驟：
1)稱取100mgNaYF4：Er，Ho@NaGdF4上轉(zhuǎn)換納米顆粒，分散于100mL環(huán)己烷中，超聲處理8～12min使其分散均勻。
2)加入5mL的CO-520，超聲處理8～12min，室溫磁力攪拌1.5h。
3)加入1mL氨水調(diào)節(jié)混合體系pH為8.5-9，室溫磁力攪拌30min。
4)逐滴加入400μLAPTS(邊攪拌邊滴加)，室溫磁力攪拌48h。取出反應(yīng)后混合液采用離心方法(9000r/min，6min)，加入無水乙醇產(chǎn)生沉淀，并用超純水清洗3次。真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為包覆連有氨基的SiO2殼的上轉(zhuǎn)換納米材料。
5)稱取UCN@SiO2-NH2 30mg，分散于6mL超純水中，超聲均勻。
6)稱取60mgHER2抗體，溶于24mLPBS緩沖溶液(pH7.4)中。
7)將兩溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各18mL，室溫磁力攪拌4h。取出反應(yīng)后溶液，采用離心方法(9000r/min，6min)，加入超純水清洗3次，真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為表面修飾HER2抗體的上轉(zhuǎn)換納米材料。
實(shí)施例3
本實(shí)施例包括以下步驟：
1)稱取10mgNaYF4：Yb，Tm@NaGdF4上轉(zhuǎn)換納米顆粒，分散于10mL環(huán)己烷中，超聲處理8～12min使其分散均勻。
2)加入500μL的CO-520，超聲處理8～12min，室溫磁力攪拌1.5h。
3)加入100μL氨水調(diào)節(jié)混合體系pH為8.5-9，室溫磁力攪拌30min。逐滴加入40μLAPTS(邊攪拌邊滴加)，室溫磁力攪拌48h。
4)取出反應(yīng)后混合液采用離心方法(9000r/min，6min)，加入無水乙醇產(chǎn)生沉淀，并用超純水清洗3次。真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為包覆連有氨基的SiO2殼的上轉(zhuǎn)換納米材料。
5)稱取UCN@SiO2-NH2 5mg，分散于1mL超純水中，超聲均勻。
6)稱取10mg牛血清蛋白，溶于4mLPBS緩沖溶液(pH7.4)中。
7)將兩溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各3mL，室溫磁力攪拌4h。取出反應(yīng)后溶液，采用離心方法(9000r/min，6min)，加入超純水清洗3次，真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為表面修飾HER2抗體的上轉(zhuǎn)換納米材料。
實(shí)施例4
本實(shí)施例包括以下步驟：
1)稱取100mgNaYF4：Yb，Tm@NaGdF4上轉(zhuǎn)換納米顆粒，分散于100mL環(huán)己烷中，超聲處理8～12min使其分散均勻。
2)加入5mL的CO-520，超聲處理8～12min，室溫磁力攪拌1.5h。
3)加入1mL氨水調(diào)節(jié)混合體系pH為8.5-9，室溫磁力攪拌30min。
4)逐滴加入400μLAPTS(邊攪拌邊滴加)，室溫磁力攪拌48h。取出反應(yīng)后混合液采用離心方法(9000r/min，6min)，加入無水乙醇產(chǎn)生沉淀，并用超純水清洗3次。真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為包覆連有氨基的SiO2殼的上轉(zhuǎn)換納米材料。
5)稱取UCN@SiO2-NH2 50mg，分散于100mL超純水中，超聲均勻。
6)稱取100mgHER2抗體，溶于400mLPBS緩沖溶液(pH7.4)中。
7)將兩溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各300mL，室溫磁力攪拌4h。取出反應(yīng)后溶液，采用離心方法(9000r/min，6min)，加入超純水清洗3次，真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為表面修飾HER2抗體的上轉(zhuǎn)換納米材料。
實(shí)施例5
本實(shí)施例包括以下步驟：
1)稱取100mgNaYF4：Yb，Tm@NaGdF4上轉(zhuǎn)換納米顆粒，分散于100mL環(huán)己烷中，超聲處理8～12min使其分散均勻。
2)加入5mL的CO-520，超聲處理8～12min，室溫磁力攪拌1.5h。
3)加入1mL氨水調(diào)節(jié)混合體系pH為8.5-9，室溫磁力攪拌30min。逐滴加入400μLAPTS(邊攪拌邊滴加)，室溫磁力攪拌48h。
4)取出反應(yīng)后混合液采用離心方法(9000r/min，6min)，加入無水乙醇產(chǎn)生沉淀，并用超純水清洗3次。真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為包覆連有氨基的SiO2殼的上轉(zhuǎn)換納米材料。
5)稱取UCN@SiO2-NH2 50mg，分散于1000mL超純水中，超聲均勻。
6)稱取100mgHER2抗體，溶于4000mLPBS緩沖溶液(pH7.4)中。將兩溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各3000mL，室溫磁力攪拌4h。
7)取出反應(yīng)后溶液，采用離心方法(9000r/min，6min)，加入超純水清洗3次，真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為表面修飾HER2抗體的上轉(zhuǎn)換納米材料。
上述具體實(shí)施可由本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明原理和宗旨的前提下以不同的方式對其進(jìn)行局部調(diào)整，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)且不由上述具體實(shí)施所限，在其范圍內(nèi)的各個實(shí)現(xiàn)方案均受本發(fā)明之約束。