專利名稱：一株小球藻及其培養方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用生物的方法，處理人類活動產生的生產、生活廢水，或含高濃度二氧化碳的廢氣，并且將由此生產的生物質用于進一步的資源開發，包括能源、食品、保健品、 肥料、飼料等產品。本發明屬于環境處理和生物產品開發領域。
背景技術：
當前人類社會面臨兩大難題氣候變暖和環境惡化。氣候變暖的一大誘因是工業革命以來由于化石能源的消耗造成的大氣中CO2含量的上升。工業生產部門的CO2集中排放是大氣中新增(X)2的主要來源，以國內某大型城市為例，2007年“熱電廠”、“工業與建筑業”、“交通”各類CO2排放分擔率分別為35. 4%,34. 4%。工廠高COD污水的排放，農業肥料的使用和畜牧業糞便處理的不當，使我國工農業發達地區水體的污染和富營養化日益嚴重。微藻也稱單細胞藻類，種類約占全球已知藻類的70%。藻類大多具有從水相中吸收有毒物質或降解有機污染物的能力。微藻具有資源豐富、光合效率高、生長速度快、適應性強的特點，20世紀50年代，Oswald和Gotaas最早提出利用微藻處理污水的想法。自 20世紀80年代以來，生物技術的飛速發展，使藻類大規模培養技術逐步完善。國內外對進一步發揮藻類凈化污水的潛力進行了大量研究，使藻類凈化污水的機理研究取得了很大進展。微藻是以水為電子供體的光能自養生物。光合作用過程中，它們以光能為能源，利用簡單的無機物合成有機物，同時消耗、同化污水中大量的氮、磷等營養物質，使水源得到凈化。微藻對氮磷等營養物質的主要去除途徑一般包括吸收和吸附。微藻利用水中溶解的 C02、HC03_和CO32-作為碳源進行光合作用的同時，使廢水的PH升高，從而導致氨態氮的揮發和正磷酸鹽的沉淀，這也是氮磷等營養物質去除的一條途徑。微藻消化吸收無機氮磷轉化成生物量的能力可以有效的進行氮磷化合物解毒。同時，由于微藻能有效地進行光合作用， 將光能、吐0，0)2和無機鹽(如NH4+)轉化為體內有機化合物，產生大量氧氣，提高溶氧水平， 使水體PH值升高；在細菌的作用下使H2S變成無毒的硫酸鹽，從而達到凈化污水和保持良好水壞境的目的。微藻生物質有許多潛在的應用價值，因為藻類富含油脂、蛋白質、色素、維生素和礦物質。其主要的潛能有用于食料和醫藥業(人和動物的營養補充物維生素、蛋白質、脂肪酸、多糖等)；提取化工產品如化妝品、精細化工產品等；作為能源產生沼氣、燃料；用于餌料和飼料業(魚蝦、甲殼動物等水產動物的餌料，家禽飼料)；農業上作為土壤調節劑、肥料等。近年來隨著能源問題的日益突出，尋找合適的可再生能源成為研究領域的熱點。 微藻能源具備多個優勢，成為備受關注的一個焦點。首先，微藻的生長迅速，且不占用耕地， 可以在灘涂、鹽堿地等邊際土地上養殖；其次，微藻生長可吸收CO2作為碳源，可緩解全球溫室效應；再次，若以污水中的有機物和離子作為微藻生長的營養，收獲微藻的同時可以凈化
3污水。

發明內容
技術問題本發明要解決的技術問題是提供一株小球藻，并利用工農業廢棄物或人工培養基培養該小球藻獲得生物質，從中可開發多種產品，或應用于廢水凈化。技術方案為實現上述技術問題的解決，本發明采用如下技術方案本發明提供一株小球藻(Chlorella sp.)(分離自青島市嶗山區某村莊生活污水排放渠)，命名為MRA-I (Chlorella sp.)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其特征在于其基因組包含核酸序列18SrDNA (SEQ ID NO 1)和ITS(SEQ ID NO: 2)或者它們的互補序列。根據序列比對，本發明的MRA-I藻株與已公布的藻株的18S rDNA 數據存在差異。MRA-I 藻株與已報道的其近緣種 Chlorella vulgaris 和 Chlorella cf. minutissima的18S rDNA序列至少有2個堿基的差異(缺失)，與Chlorella sorokiniana至少有10個堿基的差異。
18S rDNA比對結果堿基差異數Chlorella vulgaris strain CCAP 211/822Chlorella cf. minutissima CCAP 211-522Chlorella sorokiniana strain CCALA 26010本發明的小球藻藻株Chlorella sp. MRA-I已經于2011年3月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，其保藏編號為 CGMCC No. 4652。本發明還提供一種MRA-I藻株的培養物，所述培養物通過將MRA-I藻株在培養基中培養獲得，所述培養基可以為N8、M8、BG-11、以及4種改良的BG-Il培養基，培養基具體的成分可以見實施例1中所述。本發明還提供培養本發明的MRA-I藻株的方法，包括自養培養方式和異養培養方式。所述自養培養方式，其特征在于溫度為15-37°C，優選15-34°C，更優選22-28°C，接受 50-2000 μ mo 1 photons nT2s-1 (優選 50-600 μ mol photons nT2s-1)的燈光或太陽光光照， 向MRA-I藻株的培養物中通入含0. 03-30% CO2的氣體或空氣。所述異養培養方式，其特征在于采用工業、養殖業等產生的含有機質的廢水，或者利用工業加工的各種糖類配置的培養基，溫度為15-37°C，在培養過程中連續或半連續的攪拌或通入氣體。所述的有機質的來源為工業、養殖業等產生的含有機質的廢水，所述的(X)2的來源包含工廠產生的廢氣或者空氣，在通入氣體中(X)2的含量不超過30%。發明人發現，當培養基中的氮或/和磷源的濃度較高時(比如氮的濃度從9.9mM 提高到29. 7mM,磷的濃度從0. 17mM提高到7. ImM)，有利于MRA-I藻株生物質的獲得。并且發現，MRA-I藻株優選在22-28°C下生長。在1. 5g/L至5g/L的硝酸鈉濃度下，MRA-I均有較好的生長，過高的硝酸鈉濃度(10g/L)，MRA-l的生長受到一定的抑制。在0. 375g/L的硝酸鈉濃度下培養時，獲得最高的油脂含量達到52%，其中中性脂的含量占到總脂的90%以上，其他濃度硝酸鈉培養獲得的油脂含量為至34%之間；而最高的14天油脂產量是在0. 375g/L的硝酸鈉濃度下獲得的，為1. 87g/L ；最低的油脂為0. 96g/L，是在10g/L的硝酸鈉濃度下獲得的。將在0. 375g/L的硝酸鈉濃度下獲得的油脂經過柱層析分離出中性脂成份，使用氣相色譜-質譜技術分析脂肪酸的組成，發現主要為18碳酸和16碳酸，最多的油酸占到脂肪酸總量的57%此外，發明人還發現，MRA-I藻株優選在低濃度的CO2濃度下生長；在5%的CO2濃度下，MRA-I的油脂含量為33.5%，14天油脂產量為1. 51g/L ；相對于5%和10% CO2濃度， 20%的(X)2濃度獲得了較低的油脂含量和產量，分別為24. 7%和0. 79g/L。本發明還提供MRA-I藻株用于生產油脂、脂肪酸、蛋白質淀粉、色素、多糖和/或核酸的應用。在一個實施方案中，所述脂肪酸主要為18碳酸和16碳酸。所述藻株的應用領域包含能源、食品、飼料、保健品和醫藥。此外，本發明還提供MRA-I藻株用于廢水的凈化的應用。本發明提供下列1. 一株小球藻藻株Chlorella sp. MRA-1，其特征在于保藏編號為CGMCC No. 4652， 在其基因組中包含核酸序列18S rDNA(SEQ ID NO 1)和ITS(SEQ ID NO 2)或者它們的互補序列。2. 1所述的藻株用于獲得藻株高生物質產量的應用；用于廢水凈化和/或廢氣凈化的應用；以及用于生產油脂、脂肪酸、蛋白質、淀粉、色素、多糖和/或核酸的應用。3. 2所述的應用，其中所述廢水為含高濃度氮、磷的廢水。4. 2所述的應用，其中所述廢氣為含(X)2的廢氣。5. 2所述的應用，其中所述脂肪酸主要為16碳酸和18碳酸，其中所述色素包括葉綠素a，葉綠素b和類胡蘿卜素。6. 一種得到微藻高生物質產量的方法，其特征在于采用1所述的小球藻藻株 Chlorella sp. MRA-I ；采用工業、養殖業等產生的含有機質的廢水，或者利用工業加工的各種糖類配置的培養基，或N8、M8、BG-Il培養基或改良BG-Il培養基作為培養基；培養溫度為 15-34°C，優選地 22-280C ；光照強度為 50-2000 μ mol photons nT2s-1 (優選 50-600 μ mol photonsm^s"1 ；向MRA-I藻株的培養物中通入含0. 03-30% (v/v) CO2的氣體或空氣，優選地 5% -20% (ν/ν)的空氣混合氣。培養時間一般為12天到16天。7. 6的方法，其中所述培養基中包含1. 5g/L-5g/L的NaN03。8. 6的方法，其中所述培養基中氮的濃度為29. 7mM,磷的濃度為7. ImM。9. 一種利用1所述的藻株獲得高油脂產量的方法，其特征在于，將1所述的小球藻藻株Chlorella sp. MRA-I在5-10%濃度(X)2下，0. 375g/L濃度的NaNO3下進行培養。有益效果工業社會以來，人類的生產生活活動，對自然環境產生了多方面的不良影響。首先是化石燃料的使用造成了 (X)2排放增多，引起了全球的氣候變暖問題，成為了當前人類社會面臨的重要挑戰。其次，工農業生產和人類的生活，帶來了廢水的大量排放，廢水中往往含有高濃度的氮磷等營養物，這些營養物進入江河湖海，引起了水體的富營養化問題，已經深刻影響到了人們的生活和養殖業。
本發明提供的MRA-I藻株可以利用廢水中的氮磷營養生長，同時作為自養生物， 可固定轉化CO2為生物質。若以廢水和廢氣培養MRA-1，一方面可以減輕高濃度的氮磷等營養物流入自然水體，一方面有減少CO2排放的效果。生產的生物質，有開發成多種工業產品的潛力。以生產生物柴油的原料——油脂為例，在低氮條件下培養14天，MRA-I的油脂產量可達到1.86g/L，總脂的含量占到干重的53% ；平均油脂產率為1.33g/L，高于絕大多數的文獻報道，也是目前已報道的小球藻中自養條件下最高的油脂產率；作為生物柴油的原料部分，中性脂在總油脂中的含量高達90%，其脂肪酸組成也適合生物柴油的生產。


圖1為不同培養基中MRA-I的生物質產量(a)，油脂含量和產量(b)圖2為溫度對微藻生長的影響圖3為硝酸鈉濃度對MRA-I生長(a)、油脂含量和產量(b)的影響圖4為(X)2濃度對MRA-I生長(a)、油脂含量和產量(b)的影響圖5為MRA-I的中性脂中的脂肪酸甲酯化后的質譜圖(a)和脂肪酸組成(b)圖6為MRA-I在0. 375g/L硝酸鈉濃度下色素含量變化圖 7 為 MRA-I 的 18S rDNA 核酸序列(SEQ ID NO 1)圖 8 為 MRA-I 的 ITS 核酸序列(SEQ ID NO 2)
具體實施例方式MAR-I分離自青島市嶗山區某村莊生活污水排放渠，具體過程為用無菌瓶取適量排放渠污水，在實驗室無菌條件下，涂布BG-Il培養基平板，置光照培養箱，25°C條件下培養至出現藻落，挑取多個藻落再進行多次劃線分離的步驟，直至得到完全純化的藻落。其中的一株命名為MRA-1, ^ 18S rDNA和ITS序列的測序分析，鑒定為Chlorella sp.。實施例1. MRA-I藻株在多種培養中的培養配置N8、M8、BG-11、以及4種改良的BG-Il培養基中，采用柱式培養器(直徑為 42mm,長度為600mm，壁厚2mm，材質為普通玻璃)，從底部通入含5 % CO2的空氣，光照強度為 200 μ mol photons IrT2iT1，在25°C恒溫室采用上述培養基培養MRA-1藻株，接種濃度為OD75tl 為0. 2。培養基的配方如表1和表2 ；P培養基為將BG-Il培養基中的磷源的濃度從0. 175mM 調整到7. ImM, Mg為將BG-Il培養基中的鎂鹽的濃度從0. 30mM調整到1. 63mM, P-Mg為將 BG-Il培養基中的磷源和鎂鹽的濃度分別調整到7. ImM和1. 63mM, P-Mg-Fe為將BG-Il培養基中的磷源、鎂鹽和鐵鹽的濃度調整到7. ImMU. 63mM和0. 49mM。表1BG-11培養基的配置
權利要求
1.一株小球藻藻株Chlorella sp. MRA-I，其特征在于保藏編號為CGMCC No. 4652，在其基因組中包含核酸序列18S rDNA(SEQ ID NO 1)和ITS(SEQ ID NO 2)或者它們的互補序列。
2.權利要求1所述的藻株用于獲得藻株高生物質產量的應用；用于廢水凈化和/或廢氣凈化的應用；以及用于生產油脂、脂肪酸、蛋白質、淀粉、色素、多糖和/或核酸的應用。
3.權利要求2所述的應用，其中所述廢水為含高濃度氮、磷的廢水。
4.權利要求2所述的應用，其中所述廢氣為含(X)2的廢氣。
5.權利要求2所述的應用，其中所述脂肪酸主要為16碳酸和18碳酸，其中所述色素包括葉綠素a，葉綠素b和類胡蘿卜素。
6.一種得到微藻高生物質產量的方法，其特征在于采用權利要求1所述的小球藻藻株Chlorella sp. MRA-I ；采用工業、養殖業等產生的含有機質的廢水，或者利用工業加工的各種糖類配置的培養基，或N8、M8、BG-11培養基或改良BG-Il培養基作為培養基；培養溫度為 15-340C，優選地 22-280C ；光照強度為 50-2000 μ mol photons nT2s-1 ；向 MRA-I 藻株的培養物中通入含0.03-30% (v/v)CO2的氣體或空氣，優選地5%-20% (ν/ν)的空氣混合氣。
7.權利要求6的方法，其中所述培養基中包含1.5g/L-5g/L的NaN03。
8.權利要求6的方法，其中所述培養基中氮的濃度為29.7mM，磷的濃度為7. ImM。
9.一種利用權利要求1所述的藻株獲得高油脂產量的方法，其特征在于，將權利要求1 所述的小球藻藻株Chlorella sp. MRA-I在5-10%濃度CO2下，0. 375g/L濃度的NaNO3下進行培養。
全文摘要
本發明公開了一株小球藻藻株Chlorella sp.MRA-1，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.4652，MRA-1的生長可適應多種培養基、溫度、氮源濃度、CO2濃度條件，在低氮條件下的油脂含量和產率高，本發明也公開了MRA-1的培養方法及其應用領域，其應用領域包括CO2的固定，廢水的凈化，油脂、蛋白質、色素、淀粉、多糖、核酸等生物質的生產。
文檔編號C02F3/32GK102229889SQ20111014554
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月31日 優先權日2011年5月31日
發明者何茹, 劉君寒, 李福利, 胡光榮, 袁程 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所