專利名稱：微擬球藻培養基配方及三級培養方法
技術領域：
本發明屬于海洋微藻養埴領域，尤其涉及一種微擬球藻培養基配方及三級培養方法。
背景技術：
微擬球藻(Nannochloropsis oculata)又稱微綠球藻，是一種廣泛分布的海水藻類，直徑為2-4微米，細胞球形，淡緑色，富含不飽和脂肪酸及其它營養元素，其中EPA含量
占脂肪酸總量的30%。EPA能降低膽固醇和甘油三酯的含量，促進體內飽和脂肪酸代謝，從而降低血液粘稠度，增進血液循環，提高組織供氧而消除疲勞，并防止脂肪在血管壁的沉積，預防動脈粥樣硬化的形成和發展、預防腦血栓、腦溢血、高血壓等心腦血管疾病。EPA在減輕炎癥方面也起著重要的作用。另外，微擬球藻油脂含量占干重的68%以上，是提煉生物柴油的理想微藻。目前，微擬球藻規模化培養存在的主要問題是生長緩慢，生物量低，易污染，特別是梅雨季節，不利于大規模培養。以前使用的微擬球藻培養基沒有加入碳酸氫鈉，但我的實驗表明，微擬球藻除了能利用空氣中游離的C02，還能有效地利用培養液中的HC03-作為碳源。大量實驗表明添加O. 5g/L的碳酸氫鈉能能很好地促進微擬球藻的生長。另外，我還在培養基中補充了檸檬酸鐵、維生素H、赤霉素和人尿，能將產量提高54%。總之，使用優化培養基并采用三級培養微擬球藻方法具有生長速度快、產量高、成本低、不易污染的優勢。

發明內容
為了克服目前技術的不足，本發明提供了一種微擬球藻配方及三級培養方法，具體技術方案如下一種微擬球藻培養基，配方如下=NaNO3 7. 5 X 10_2g，KH2PO4 I X 10_2g，NaHCO35父10、，檸檬酸鐵(卩6(6!1507.5!120)2\10-\，￥812 5 X KTgJB1 I X IO^4g, VH 5Xl(T7g，九ニO植物生長刺激素(即赤霉素)5國際單位，人尿2mL，消毒海水lOOOmL。優選地,還包括微量元素O. 55 2. 25ml/L,所述微量元素配方為磷酸ニ氫鈉32 40g/L、硫酸銅I. 2 3. 2g/L、硫酸鋅4. 2 6. 2g/L、氯化鈷4 6g/L、氯化錳30 45g/L加水定容至1し優選地，所述微量元素溶液中加入120 140g/L的磷酸ニ氫鈉溶液。優選地，所述微量元素溶液中加入こニ胺四こ酸ニ鈉3 10g/L。應用本發明所提供的培養基對微擬球藻進行三級培養，包括如下步驟1) ー級培養容器為5000mL三角燒瓶，燒瓶用洗液洗滌、晾干、120°C恒溫消毒；培養用的海水比重1.015 I. 018，鹽度30 32，經過經脫脂棉過濾、煮沸、冷卻后加入營養鹽；室內培養，室溫20-26°C，室內自然光+輔助日光燈管光源照射，光強3000-10000LX，光暗周期=14L: 10D，指數增長期藻種接種，接種密度300-350 X 104cell/mL,不充氣。培養期間每天搖瓶6次。密度達3000X 104cell/mL，即可轉入ニ級培養。2) ニ級培養容器為50L白塑料桶，白塑料桶刷干凈、漂白粉消毒后用消毒水沖干凈備用。ニ級培養用的海水經漂白粉消毒、硫代硫酸鈉處理后加入營養鹽；將ー級培養的藻液按I : 10的比例接種到白桶。室內培養，室溫20-26 °C，室內自然光+輔助日光燈管光源照射，光強3000-10000LX，光暗周期=14L:10D，充氣培養，充氣量以能將藻細胞沖起懸浮即可。3)三級培養容器為水泥池。面積20-30m2，池深50cm，水深20_30cm，內貼白色瓷磚，三級培養用海水經漂白粉消毒、硫代硫酸鈉處理。將ニ級培養的藻液作藻種轉入水泥池培養，室外培養，自然光照射，充氣，接種密度200-300 X 104cell/mL,培養至密度達 2000-3000 X 104cell/mL 即可收獲。優選地，包括在步驟2)中充氣培養時同時施加臭氧。優選地，臭氧的濃度為O. 5微克/升空氣 O. 8微克/升空氣。有益效果實驗結果表明，使用優化培養基并采用三級培養微擬球藻具有生長速度快、產量高、成本低、易于操作、不易污染的優點。
具體實施例方式培養基配制方法I檸檬酸鐵較難溶解，可加少量自來水在火爐上微熱至80-90°C，并不斷攪拌至全部融化；2赤霉素為白色結晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每g用50mL酒精或60度白酒溶解I小時以上)，再按所需濃度兌水稀釋。3加營養鹽的過程中需不斷攪水，而且各種營養鹽按配方中提供的順序加入，以免發生化學反應；4各種營養鹽可先配成濃度較高的母液，再依次添加；5三級培養各階段營養鹽配方和濃度相同。 一種微擬球藻培養基，其特征在于該微擬球藻培養基配方如下NaN037. 5 X10_2g, KH2PO4 lXl(T2g，NaHCO3 5X10、，檸檬酸鐵(FeC6H5O7. 5H20) 2 X l(T4g，VB12SXlO-Tg7VB1 lX10_4g，VH 5 X 10_7g，九ニ O植物生長刺激素(即赤霉素)5國際單位，人尿2mL，消毒海水lOOOmL。優選地,還包括微量元素O. 55 2. 25ml/L,所述微量元素配方為磷酸ニ氫鈉32 40g/L、硫酸銅I. 2 3. 2g/L、硫酸鋅4. 2 6. 2g/L、氯化鈷4 6g/L、氯化錳30 45g/L加水定容至1し優選地，所述微量元素溶液中加入120 140g/L的磷酸ニ氫鈉溶液。優選地，所述微量元素溶液中加入こニ胺四こ酸ニ鈉3 10g/L。微擬球藻三級培養方法I 一級培養一級培養容器為5000mL三角燒瓶，燒瓶用洗液洗滌、晾干、120°C恒溫消毒；培養用的海水比重I. 015，鹽度30，經過經脫脂棉過濾、煮沸、冷卻后加入營養鹽；室內培養，室溫20-26 °C，室內自然光+輔助日光燈管光源照射，光強3000-10000LX，光暗周期=14L: 10D，指數增長期藻種接種，接種密度300-3 50 X 104cell/mL,不充氣。培養期間每天搖瓶6次。密度達3000X 104cell/mL，即可轉入ニ級培養。2 ニ級培養ニ級培養容器為50L白塑料桶，白塑料桶刷干凈、漂白粉消毒后用消毒水沖干凈備用。ニ級培養用的海水經漂白粉消毒、硫代硫酸鈉處理后加入營養鹽；將ー級培養的藻液按I : 10的比例接種到白桶。室內培養，室溫20-26°C，室內自然光+輔助日光燈管光源照射，光強3000-10000LX，光暗周期=14L: 10D,充氣培養，充氣量以能將藻細胞沖起懸浮即可。3三級培養三級培養容器為水泥池。面積20-30m2，池深50cm，水深20_30cm，內貼白色瓷
磚，三級培養用水經漂白粉消毒、硫代硫酸鈉處理。將ニ級培養的藻液作藻種轉入水泥池培養，室外培養，自然光照射，充氣，接種密度200-300 X IO4ceI Ι/mL，培養至密度達2000-3000 X IO4Cel 1/mL 即可收獲。優選地，包括在步驟2)中充氣培養時同時施加臭氧。優選地，臭氧的濃度為O. 5微克/升空氣 O. 8微克/升空氣。上述所有的區間都可以實現，不止端點和中點能實現，在此特別說明。最后應說明的是以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解其依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明實施例技術方案的精神和范圍。
權利要求
1.一種微擬球藻培養基，其特征在于該微擬球藻培養基配方如下NaN03 7 . 5Xl(T2g,KH2PO4 I X l(T2g，NaHCO3 5X KT1g,檸檬酸鐵(FeC6H5O7. 5H20) 2X l(T4g，VB12 5 X10_7g, VB1I X 10_4g，VH 5X 10_7g，九二 0植物生長刺激素(赤霉素)5國際單位，人尿2mL，消毒海水IOOOmL0
2.如權利要求I所述的微擬球藻培養基，其特征在于還包括微量兀素O.55 2. 25ml/L，所述微量元素配方為磷酸二氫鈉32 40g/L、硫酸銅I. 2 3. 2g/L、硫酸鋅4. 2 6.2g/L、氯化鈷4 6g/L、氯化錳30 45g/L加水定容至1L。
3.如權利要求2所述的微擬球藻培養基，其特征在于所述微量元素溶液中加入120 140g/L的磷酸二氫鈉溶液。
4.如權利要求2所述的微擬球藻培養基，其特征在于所述微量元素溶液中加入乙二胺四乙酸二鈉3 10g/L。
5.如權利要求I所述的微擬球藻培養基的三級培養方法，其特征在于包括如下步驟 1)一級培養容器為5000mL三角燒瓶,燒瓶用洗液洗漆、晾干、120°C恒溫消毒；培養用的海水比重I. 015 I. 018，鹽度30 32，經過經脫脂棉過濾、煮沸、冷卻后加入營養鹽；室內培養，室溫20-26°C，室內自然光+輔助日光燈管光源照射，光強3000-10000LX，光暗周期=14L:10D，指數增長期藻種接種，接種密度300-350X 104Cell/mL，不充氣。培養期間每天搖動6次，密度達3000X 104cell/mL，即轉入二級培養。
2)二級培養容器為50L白塑料桶，白塑料桶刷干凈、漂白粉消毒后用消毒水沖干凈備用。二級培養用的海水經漂白粉消毒、硫代硫酸鈉處理后加入營養鹽；將一級培養的藻液按I 10的比例接種到白桶。室內培養，室溫20-26°C，室內自然光+輔助日光燈管光源照射，光強3000-10000LX，光暗周期=14L:10D，充氣培養，充氣量以能將藻細胞沖起懸浮即可。
3)三級培養容器為水泥池。面積20-30m2，池深50cm，水深20_30cm，內貼白色瓷磚，三級培養用水經漂白粉消毒、硫代硫酸鈉處理。將二級培養的藻液作藻種轉入水泥池培養，室外培養，自然光照射，充氣，接種密度200-300X IO4ceIΙ/mL，培養至密度達2000-3000 X IO4Cel 1/mL 即可收獲。
6.如權利要求5所述的微擬球藻培養基的三級培養方法，其特征在于包括在步驟2)中充氣培養時同時施加臭氧。
7.如權利要求5-6所述的微擬球藻培養基的三級培養方法,其特征在于臭氧的濃度為O.5微克/升空氣 O. 8微克/升空氣。
全文摘要
本發明提供了一種微擬球藻培養基配方及三級培養方法，配方如下NaNO3 7.5×10-2g，KH2PO4 1×10-2g，NaHCO3 5×10-1g，檸檬酸鐵(FeC6H5O7.5H2O)2×10-4g，VB12 5×10-7g，VB1 1×10-4g，VH 5×10-7g，九二0植物生長刺激素(即赤霉素)5國際單位，人尿2mL，消毒海水1000mL。實驗結果表明，使用優化培養基并采用三級培養微擬球藻具有生長速度快、產量高、成本低、易于操作、不易污染的優點。
文檔編號C12R1/89GK102851211SQ20121029890
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月22日 優先權日2012年8月22日
發明者王培磊 申請人:王培磊