本發明涉及一種去除污水中抗生素抗性基因的方法。屬于污水凈化處理技術領域。

背景技術：

目前，抗生素在醫療、養殖及制藥等行業中的濫用不斷加重，導致了細菌對抗生素產生抗性，為細菌性疾病的防控和治療帶來極大困難?？股乜剐曰?Antibiotic resistance genes,ARGs)作為一種新型環境污染物，是細菌獲得抗性的重要因素之一，ARGs的產生主要來自基因的誘導突變和水平轉移。環境中的誘變劑如抗生素、重金屬等會誘導細菌突變產生ARGs，這類獲得抗性的抗性細菌將在不同環境介質間進行增殖和傳播?？剐约毦鶖y帶的ARGs通過轉化、轉導和接合等基因的水平轉移作用，與質粒、轉座子、整合子、嵌合基因等可移動基因元件結合，從而在種內、種間傳播擴散。ARGs具有可遷移性和持久存在性，在環境中難以被降解和去除，而ARGs進入食物鏈后會借助微生物作為載體，在食物鏈不同層級間轉移擴增，對宿主生物造成潛在危害。污水處理系統是ARGs進入自然環境的主要途徑和潛在存儲庫。有效去除污水中ARGs是實現污水再生回用的關鍵問題，污水再生回用是全球范圍內水資源持續利用重要策略。在控制抗生素抗性傳播，和避免抗生素抗性的潛在生態風險方面發揮重要作用。

我國是抗生素生產和使用大國，抗生素生產、醫院、養殖產生的廢水和市政污水中ARGs檢出豐度較高，現有城鎮污水處理廠多采用傳統活性污泥法等傳統污水處理技術，其處理目標主要定位于碳氮磷等常規污染物的去除，對污水中ARGs的去除能力十分有限，部分種類的ARGs檢出率、豐度和多樣性甚至有所升高。在污水處理廠中未能去除的ARGs通過出水排放進入受納水體，我國不同水體和水環境中已檢出了較高濃度ARGs。

現有去除污水中ARGs的技術主要包括：基于紫外和氯化的消毒技術，通過投加鋁鹽和鐵鹽實現的混凝沉淀技術，混凝沉淀與消毒聯合處理，以及一些流程復雜的復合處理技術(包括“混凝沉淀-生化處理-過氧乙酸消毒-高壓CO₂消毒-納米二氧化鈦催化-沉淀”和“格柵過濾-沉淀分離-Fenton氧化-UV/H₂O₂氧化-消毒”等)。這些現有技術都需要增設大量水處理單元、設備，并需投加大量化學藥劑，極大地增加了處理成本、占地面積和運行管理難度；同時，當進水的水量和水質波動較大時，如未及時調整消毒劑的劑量或者混凝劑的投加量，處理流程的出水存在ARGs泄露風險；另外，為達到較好的ARGs去除效果而向污水廠二級出水中過多投加化學藥劑，將會對收納水體造成二次污染。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種處理效果好、運行簡便穩定的去除污水中抗生素抗性基因工藝。用該方法解決了目前污水凈化處理工藝對于ARGs去除存在的處理效果欠佳、處理成本高、運行管理復雜等難題。

為了達到上述目的，本發明通過對現有污水廠的調查，發現膜生物反應器(MBR)較長的固體停留時間和較高的活性污泥濃度等特點，都十分有助于處理難降解污染物。此外膜組件的膜截留作用和膜污染物的吸附作用能有效攔截小分子污染物。本發明采用生物處理和膜技術聯合工藝去除污水中ARGs，通過優化調控MBR生物過程和運行參數，達到較好的ARGs去除效果。

本發明具體步驟如下：

A，構建缺氧/好氧-膜生物反應器(A/O-MBR)，向缺氧/好氧-膜生物反應器(A/O-MBR)接種城市污水處理廠曝氣池中活性污泥后，采用人工配制模擬城市污水進水中待測ARGs相對豐度為1.11拷貝數/16S rRNA序列條數，啟動缺氧/好氧-膜生物反應器運行；

上述步驟A中的構建缺氧/好氧-膜生物反應器(A/O-MBR)，缺氧/好氧-膜生物反應器中缺氧區和好氧區的有效容積之比為2：1；在A/O-MBR系統出水泵前增加真空壓力表；好氧區內的膜組件使用孔徑為0.1μm的聚偏氟乙烯平板膜，采用浸沒式運行方式，膜組件下方設置底部穿孔曝氣管，膜組件中部位置設置微孔曝氣頭構成供氧方式，控制曝氣的氣：水＝50：1；使用蠕動泵作為抽吸動力將待處理污水從膜的兩側跨膜抽吸進入膜內部，膜過濾后出水通過真空壓力表以恒定膜通量和間歇循環方式出水，每一個間歇循環為過濾10min，停歇2min；

上述步驟A中的接種污泥取自上海市曲陽污水處理廠曝氣池，接種污泥MLSS(g/L)為4.8，VSS(g/L)為3.70，SVI(mL/g)為162.5，DO(mg/L)為6.4～6.5，pH為3.5～4.5，溫度(℃)為25±1；

上述步驟A中的進水采用人工配制模擬城市污水，以乙酸鈉為碳源，氯化銨為氮源，磷酸二氫鉀為磷源，控制COD為350～400mg/L、總氮為30～50mg/L、總磷濃度為10mg/L，人工模擬污水具體組分：780mg/L CH₃COONa，230mg/L NH₄Cl，43mg/L KH₂PO₄，8mg/L FeSO₄，102mg/L MgSO₄，42mg/L CaCl₂和0.5mL/L微量元素液(每升微量元素液中含有0.2g H₃BO₃，0.2g CoCl₂·6H₂O，0.06g CuSO₄·5H₂O，2g FeCl₃·6H₂O，0.22g MnCl₂·2H₂O，0.2g ZnSO₄·7H₂O，0.06g KI，0.12g NiCl₂)；人工配置污水中ARGs豐度平均為1.26×10⁸拷貝數/mL。

B，定期檢測系統的污染物去除率，調整運行參數，穩定A/O-MBR運行狀態，控制膜通量為15L/m²/h，污泥停留時間設為60d，水力停留時間設為6h，好氧區MBR池懸浮固體濃度MLSS為8～12g/L，活性污泥從好氧區至缺氧區內回流比為250～300％，反應運行溫度控制在25±1℃，缺氧區攪拌轉速為200～250r/min；當真空壓力表壓差到達40kPa時，關閉蠕動泵停止進水，作為一個過濾周期，將膜組件換洗，先進行物理清洗，再用0.5％NaClO進行化學清洗，減小膜面污染物濃度；

C，檢測膜面污染物組分，其中細菌溶解性微生物代謝產物(Soluble Microbial Products，SMP)組分濃度為20～35mg/m²，細菌胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)組分濃度為150～300mg/m²時，既能保證膜生物反應器較高的出水流量，同時也能達到強化ARGs吸附攔截的效果，出水中ARGs豐度下降2～5個數量級，ARGs去除率高達93.7％；

本發明的有益效果是：

(1)本發明通過將膜技術和生物處理技術結合，使污水中的ARGs一方面能夠被MBR中活性污泥吸附降解，另一方面，MBR膜面適量污染物能夠較好地吸附并攔截ARGs，避免小分子胞外游離ARGs穿透膜孔泄露于出水中，可有效去除污水中ARGs污染，避免受納水體的ARGs污染；

(2)本發明通過檢測MBR膜面污染物中各組分的濃度，確定了膜面有機污染物對強化去除污水中ARGs所需的最佳濃度，較好保證了ARGs去除效果，彌補了傳統活性污泥法出水中存在較高ARGs泄露風險的不足，避免了現有高級處理工藝的流程復雜、化學藥劑投量大、運行管理復雜等弊端；

(3)本發明整個工藝流程操作運行簡單，易于實現，且自動化程度高，便于工業化應用，相比于現有ARGs去除工藝，本發明在處理流程的運行管理方面更加便捷高效，且無需額外投加化學藥劑，降低了污水處理過程中的二次污染，且有效節省了運行管理費用。

(4)該方法重點處理新型環境污染物ARGs，符合污水深度處理與回用的需求，符合促進經濟、社會和環境可持續發展的國家重大需求，利用膜生物反應器技術在污水處理中的應用有效去除污水中ARGs，為污水深度處理和水質安全保障提供理論支持和技術保障。

附圖說明

圖1是本發明去除污水中ARGs的處理工藝流程圖；

圖2是本發明目標抗性基因相對豐度的沿程分布圖。

具體實施方式

A，構建本發明缺氧/好氧-膜生物反應器(A/O-MBR)，A/O-MBR反應器運行工況如表1；

表1 A/O-MBR器運行工況

向A/O-MBR中接種取自上海市曲陽污水處理廠曝氣池中活性污泥，接種污泥基本性質指標見表2。

表2接種污泥基本性質指標

進水采用人工配制模擬城市污水(進水中待測ARGs相對豐度為1.11拷貝數/16S rRNA序列條數)，通過調整曝氣流量、膜通量、固體停留時間等運行參數，穩定A/O-MBR的運行狀態；

本實施例以人工合成模擬城市生活污水作為凈化對象(進水中待測ARGs相對豐度為1.11拷貝數/16S rRNA序列條數)，包括以下步驟：

(1)采用實時定量熒光PCR檢測處理流程中不同處理單元的目標抗性基因相對豐度(ARGs拷貝數/16S rRNA序列條數)；

(2)檢測膜面有機污染物中各組分濃度，結合ARGs相對豐度，確定膜面有機污染物對強化去除污水中ARGs所需的最佳濃度；

(3)通過調整固體停留時間(SRT)、曝氣流量、膜通量等運行參數，以及膜組件物理清洗和化學清洗頻率等方式，使膜面污染物濃度最長時間地保持在去除ARGs所需的最佳濃度，從而強化系統對于ARGs的去除效果。

所述步驟A中采用膜組件下方設置底部穿孔曝氣管，膜組件中部位置設置微孔曝氣頭的供氧方式，控制曝氣的氣水比為50：1左右。

所述步驟A中的聚偏氟乙烯PVDF平板式膜組件采用浸沒式運行方式，使用蠕動泵作為抽吸動力，將進水從膜的兩側跨膜抽吸進入膜內部，并沿著抽吸管以恒定流量的方式出水。采用間歇出水方式：過濾10min，停歇2min。

所述步驟A中反應器進水采用人工配制模擬城市污水，以乙酸鈉為碳源，氯化銨為氮源，磷酸二氫鉀為磷源，控制COD、總氮和總磷濃度為350～400mg/L、30～50mg/L和10mg/L，人工模擬污水具體組分：780mg/L CH₃COONa，230mg/L NH₄Cl，43mg/L KH₂PO₄，8mg/L FeSO₄，102mg/L MgSO₄，42mg/L CaCl₂和0.5mL/L微量元素液(每升微量元素液中含有0.2g H₃BO₃，0.2g CoCl₂·6H₂O，0.06g CuSO₄·5H2O，2g FeCl₃·6H₂O，0.22g MnCl₂·2H₂O，0.2g ZnSO₄·7H₂O，0.06g KI，0.12g NiCl₂)；人工配置污水中待測ARGs豐度約為1.26×10⁸拷貝數/mL，待測ARGs相對豐度為1.11拷貝數/16S rRNA序列條數。

所述步驟A中，在A/O-MBR出水泵前安裝真空壓力表，以40kPa作為跨膜壓差上限，當壓差到達40kPa時，關閉MBR系統的抽吸動力裝置蠕動泵，作為一個過濾周期。換洗的膜首先進行物理清洗，再用0.5％NaClO進行化學清洗。

所述步驟A中，A/O-MBR運行工況具體情況如下：膜組件的膜通量為15L/m²/h，固體停留時間SRT設為60d，水力停留時間HRT設為6h，好氧區懸浮固體濃度MLSS為8～12g/L，活性污泥從好氧區回流至缺氧區的內回流比為250～300％，反應運行溫度控制在25±1℃，缺氧區攪拌轉速為200～250r/min。

可以通過調整活性污泥的固體停留時間(SRT)、膜組件的物理清洗及化學清洗頻率，優化控制系統膜面污染的程度。SMP(細菌溶解性微生物代謝產物)組分濃度為20～35mg/m²，細菌胞外聚合物(EPS)組分濃度為150～300mg/m²，系統既能保證較高的出水流量，同時也能達到強化ARGs吸附攔截的效果。

對上述實施例的結果進行檢測分析，各類待測抗性基因的分析結果如圖2。

(1)ARGs定量

沿程檢測污水處理流程的不同單元中各類待測ARGs豐度變化情況，取樣點設置在：進水口、缺氧區活性污泥、好氧區活性污泥、膜面污染物的泥餅層、膜片、出水口，具體檢測分析方法如下。

1)DNA提取

DNA提取按照Fast DNA^TM Spin Kit for soil試劑盒廠家提供方法進行，具體步驟如下：

a)將凍干污泥樣品或剪碎的濾膜放入裂解管E管中(Lysing Matrix E tube)，加入978μL磷酸鹽緩沖液(Sodium Phosphate Buffer)和122μL MT緩沖液(MT Buffer)，使用渦旋振蕩儀將混合液震蕩混勻；

b)將E管于14000×g離心力下離心10min，將上清液轉移至2mL離心管中，加入250μL蛋白質沉淀溶液(Protein Precipitation Solution)，并將離心管上下顛倒10次以混勻；

c)將2.0mL離心管于14000×g離心力下離心5min，將上清液轉移至10mL離心管中；

d)搖勻DNA結合溶液(Binding Matrix)后，吸取1.0mL混合液加入c)中的10mL離心管中；

e)將離心管上下顛倒2min后，靜置3min，使DNA附著于Binding Matrix上，并等待二氧化硅基質沉淀(這一步根據沉淀情況時間可以適當延長)；

f)小心去除500μL上清液，避免吸出沉淀物；

將剩余的上清液與沉淀物重新混勻，吸取600μL混合液至含SPIN^TM Filter的管中，以14000×g離心1min；

g)棄去收集管中的液體，重復上一步操作直至10mL離心管中的液體轉移離心完；

h)將SPIN^TM Filter置于新的2mL離心管中，加入500μL SEWS-M，用槍頭重新懸濁SPIN^TM Fliter管內顆粒，以14000×g離心1min；

i)再次將SPIN^TM Filter置于新的2mL離心管中，不加入任何溶液，然后以14000×g離心2min，離心后將SPIN^TM Fliter置于室溫下5min；

j)將SPIN^TM Fliter置于新的1.5mL離心管中，加入100μL DES溶液，靜置1min，以14000×g離心1min，收集下層離心管中的溶液即為提取并純化完成的DNA。

2)DNA純度和濃度檢測

使用微量蛋白質核酸分析儀NanoDrop2000測定所提取DNA樣品的純度和濃度。具體操作步驟如下：

a)打開NanoDrop2000工作界面，選擇核酸檢測方式；

b)系統完成自檢后，在上樣孔內加2.5μL DES溶液，蓋上蓋板，單擊blank調零；

c)用擦鏡紙擦干上樣孔后，在上樣孔內加2.5μL待測樣品，蓋上蓋板，單擊measure進行檢測，記錄其濃度值、OD260/OD280和OD260/OD230比值。

3)檢測所提取DNA樣品完整性

使用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA樣品完整性。

a)檢測前準備：將樣品在冰上融化后，充分混勻并離心，取2μL樣品進行檢測。

b)檢測參數：瓊脂糖凝膠濃度為1％瓊脂糖膠，檢測電壓為5V/cm，檢測時間為30min。

4)普通PCR及質粒制備

使用普通PCR擴增所提取DNA中的ARGs片段，利用瓊脂糖凝膠電泳觀測PCR產物中是否存在目標ARGs的擴增產物，對于含有目標ARGs的PCR產物進行純化后，進行質粒制備，所制備的質粒用于ARGs實時熒光定量PCR。普通PCR引物序列見下表1。

表1普通PCR引物序列表

5)ARGs實時熒光定量PCR

a)制備標準曲線樣品

構建好的質粒經測序鑒定無誤后，用紫外分光光度計測定質粒OD260值，并按下式換算質粒拷貝數：

質粒濃度換算公式(拷貝數/μL)＝質粒濃度(ng/μL)×6.02×10¹⁴/DNA分子量

將構建好的質粒10倍梯度稀釋后作為qPCR標準品，標準曲線一般包含4～6個標準點，通過預實驗分別選取標準品的10^-3～10^-7稀釋液用于制備標準曲線。各質粒標準參數見下表2。

表2質粒標準品參數

b)熒光定量PCR反應步驟

采用的25μL qPCR反應體系包括：12.5μL 2×Green qPCR Master Mix混合染料，上下游引物各0.5μL(10μM)，2μL DNA模版，9.5μL ddH₂O。把加好樣品的96孔板放在ABI 7500型熒光定量PCR儀中進行反應。反應后得到的結果可根據標準曲線計算出樣品中的每種ARGs濃度。在實時熒光定量PCR技術中，Ct值表示反應管內的突光信號到達設定的域值時所經歷的循環數，每個模板的Ct值與該模板的起始濃度的對數存在線性關系，起始濃度越高，Ct值越小。在利用已知起始濃度的標準品作出的標準曲線中，橫坐標代表PCR產物濃度，縱坐標代表Ct值。利用未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始濃度。數據分析由Step One Software(version2.0)完成。qPCR熱循環條件如下表3。

表3 qPCR熱循環條件

6)ARGs去除效果

系統進水中各類待測總ARGs豐度平均為1.26×10⁸拷貝數/mL(相對豐度為1.11拷貝數/16S rRNA序列條數)，出水中ARGs豐度平均為7.90×10⁶拷貝數/mL，去除率高達93.7％(以相對豐度計，為99.4％)，說明采用該發明能很好處理含ARGs的生活污水，出水ARGs豐度下降2～5個數量級。

(2)膜污染物組分檢測

在MBR膜污染的研究過程中，常將膜面有機污染物分為溶解性微生物代謝產物(Soluble Microbial Products，SMP)和胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)。SMP、EPS等膜面污染物的吸附和攔截作用有利于去除污水中的ARGs，強化了MBR對ARGs的去除效果。優選地，控制膜面有機污染物中SMP組分濃度為20～35mg/m²，EPS組分濃度為150～300mg/m²，既能保證較高的出水流量，同時也能達到強化ARGs吸附攔截的效果。

經分析可知：

(1)ARGs在各處理單元中的去除規律

根據分析結果可知(圖2)，從好氧區活性污泥到系統出水過程中，各類目標ARGs相對豐度基本呈下降趨勢，各類目標ARGs在整個污水處理流程中的總去除率高達93.7％。

污水中的ARGs在從反應器進水至MBR好氧區的生物處理流程中得到了一定的去除，但是去除效果不夠明顯；而在從膜面泥餅層至反應器出水的膜截留和膜面有機污染物吸附截留的處理流程中，ARGs豐度得以顯著下降，可見，生物處理、膜截留以及膜面有機污染物的吸附截留的結合能夠有效去除污水中的ARGs污染。

其中，部分種類ARGs(例如sulⅡ等)在膜面泥層中的相對豐度高于好氧區活性污泥中的相對豐度，可能是由于MBR好氧池的穿孔曝氣設備在膜面處形成較高濃度溶解氧，且膜面本身易吸附有機營養物質，使得部分攜帶ARGs的抗性菌在膜面上大量增殖，同時可移動基因元件促進了ARGs的水平轉移和擴增，繼而造成了ARGs相對豐度在膜面泥層處呈現不同程度升高。

(2)MBR好氧池污泥中ARGs與intI1相關性

細菌產生抗生素抗性的主要原因之一是通過基因水平轉移獲得外源性ARGs，大多數ARGs位于整合子、轉座子和質粒等可移動基因元件上。雖然整合子本身不能移動，但可整合到細菌的質?；蛉旧w上，促進ARGs在細菌種內和種間水平轉移。目前研究已發現至少5類整合子，其中質粒intI1最為常見。通過研究MBR好氧池污泥中ARGs與intI1相關性，可了解MBR好氧池污泥中ARGs的遷移性。

釆用Pearson單側檢驗法研究intI1相對豐度和目標ARGs豐度變化的相關性，結果詳見下表4。研究單個抗生素抗性基因相對豐度與intI1豐度之間的相關性發現，sulⅠ、tetC、tetX、ereA基因與intI1間均呈顯著正相關性(P<0.01)，其中tetX的Pearson相關性系數R值最大(R＝0.755)?；前奉恠ul、四環素類tet和總ARGs相對豐度與intI1豐度之間也均呈現顯著正相關性(P<0.01)，Pearson相關性系數R值分別為0.518、0.543和0.749，表明MBR好氧池活性污泥中ARGs的廣泛存在性和極高的可遷移性。

表4 MBR好氧池污泥中ARGs與intI1相關性

(3)ARGs相對豐度去除率與膜面污染物相關性

由于SMP和EPS含較多負電官能團(如SO₄^-、PO₄^3-、-COOH等)，且幾乎所有活性污泥表面電荷都為負電，因此SMP和EPS幾乎都帶負電。而DNA分子上既帶有負電的磷酸基團，腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶上的氨基又能被質子化而帶正電荷，在細菌代謝產物吸附DNA分子的過程中，MBR體系中的陽離子(如Ca²⁺、Mg²⁺)在DNA分子的磷酸基團與SMP和EPS負電荷之間起到橋接作用。膜污染物中SMP和EPS可能通過與微生物表面、胞外小分子DNA片段的靜電吸附和橋接作用強化對ARGs的吸附攔截。R語言Mantel檢驗分析膜面污染物組分濃度和ARGs相對豐度(拷貝數/16S rRNA序列條數)去除率的相關性結果詳見下表5，可以看出，膜面污染物中SMP和EPS的濃度與ARGs相對豐度去除率均呈顯著正相關(P<0.05，R>0)。分析結果表明該發明工藝不僅利用了MBR工藝在攔截小分子污染物和處理難降解污染物方面的固有優勢，而且充分掌握和有效利用膜污染物對ARGs的吸附攔截作用，對去除污水中ARGs污染提供了高效的處理方法。

表5目標ARGs相對豐度去除率與膜面污染物相關性分析結果

優選地，控制膜面有機污染物中SMP組分濃度為20～35mg/m²，EPS組分濃度為150～300mg/m²，系統既能保證較高的出水流量，同時也能達到強化ARGs吸附攔截的效果。