專利名稱：含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體及其構建方法
技術領域：
本發明涉及慢病毒表達載體，尤其是一種含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體及其構建方法
背景技術：
c-erbB2/HER2/neu編碼產物pl85eAB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，屬于表皮生長因子受體(EGFR)家族成員。C-erbB2/HER-2/neu基因的擴增和pl85ertB2蛋白的過度表達見于多種惡性腫瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、子宮內膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺癌。pl85eAB2過度表達提示腫瘤預后差，如轉移、復發、易耐藥及存活期短等。pl85ertB2作為腫瘤抗原，是一個理想的腫瘤治療靶點。美國食品及藥物管理局(FDA)已于1998年10月正式批準將一株抗pl85ertB2人源化抗體Trastuzumab (商品名Herceptin)用于臨床治療pl85erbB2高表達的轉移性乳腺癌。但是，國外進口抗體藥物價格昂貴，如何開發出擁有自主知識產權的抗pl85OTbB2基因工程抗體對于國內患者具有十分重要的實際意義，其中，表達載體構建尤為關鍵。目前構建載體表達抗體分子的主要方式有三類一是將輕、重鏈基因分別連接至不同表達載體；二是輕、重鏈基因在同一載體上但處于不同的表達單元；三是以內部核糖體進入位點(IRES)連接輕、重鏈，使輕重鏈處于同一表達單元。但是，這些方式存在一些缺陷，如被表達的基因起始效率低，啟動子之間相互干擾，上游基因與下游基因的表達不平衡等，造成輕、重鏈表達水平存在顯著差異，導致完整抗體分子表達水平較低。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體及其構建方法，為今后抗pl85MbB2嵌合抗體的基礎研究及臨床應用奠定了基礎。含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體，該載體是pWPI/H-F2A-L，其中H和L分別是抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體重鏈基因(SEQ. ID. No. 2)和抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體輕鏈基因(SEQ. ID. No. I), F2A是弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽(SEQ. ID. No. 15)。抗P 185eAB2人鼠嵌合抗體重鏈基因由鼠抗人P 185ertB2單抗重鏈可變區基因vH(SEQ. ID. No. 13)和人 IgGl 的重鏈恒定區基因 Y I (SEQ. ID. No. 14)連接而成 ^pl85ertB2人鼠嵌合抗體輕鏈基因由鼠抗人pl85ertB2單抗輕鏈可變區基因vL(SEQ. ID. No. 16)和人IgGl的輕鏈恒定區基因K (SEQ. ID. No. 17)連接而成。上述含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體的構建方法用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶Furin/ 口蹄疫病毒2A多肽F/2A連接人鼠嵌合抗體的重鏈和輕鏈，形成一個開放閱讀框0RF，插入慢病毒表達載體pWPI，即得。
上述含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體的構建方法包括以下步驟<1>抗P185ertB2人鼠嵌合抗體重、輕鏈基因的擴增 用小量質粒抽提試劑盒抽提含有抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗體輕、重鏈基因的質粒pWPI/H-IRES-L，并以此為模板，在DNA Taq酶作用下分別用H-A和gammal-B、L-A和Kappa-B擴增出嵌合重鏈基因H和嵌合輕鏈基因L ;擴增條件為94°C預變性5min，94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，35個循環，最后72°C延伸IOmin ;PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收目的基因； <2>全長嵌合抗體H-F2A-L的構建①接頭片段F2A的合成該片段由3部分構成含NsiI酶切位點的嵌合重鏈H的3’端序列、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及含PvuII酶切位點的嵌合輕鏈L的5’端序列；②中間質粒pUC57/F2A的構建將接頭片段F2A插入到pUC57質粒的BamH I和Xba I之間，獲得中間質粒pUC57/F2A ；③含有嵌合輕鏈的質粒PUC57/F2A-L的構建用BamH I和Xba I雙酶切質粒PUC57/F2A，酶切產物經I %的瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒分別回收接頭片段F2A和載體片段PUC57 ;進而用Pvu II酶切接頭片段F2A，獲得5’端為BamH I酶切位點和3’端為Pvu II酶切位點的接頭片段F2A ;用Pvu II和Xba I雙酶切嵌合輕鏈L，獲得5’端為Pvu II酶切位點和3’端為Xba I位點的輕鏈片段L ;然后，將這兩個片段用T4DNA連接酶連接后克隆入載體PUC57，獲得含有嵌合輕鏈的質粒pUC57/F2A-L ；④片段H-F2A-L的拼接用BamH I酶和Xba I酶切pUC57/F2A_L，獲得片段F2A-L ;進而用Nsi I酶切片段F2A-L，獲得5’端為Nsi I酶切位點和3’端為Xba I酶切位點的片段F2A-L ;用BamH I和Nsi I雙酶切嵌合重鏈H，獲得5’端為BamH I酶切位點和3’端為Nsi I位點的重鏈片段H ;通過T4DNA連接酶與片段F2A-L相連，獲得5’端為BamHI酶切位點和3’端為Xba I位點的嵌合抗體全長片段H-F2A-L(SEQ. ID. No. 3)；<3>慢病毒表達質粒pwpI/H-F2A_L的構建將純化回收的片段H-F2A-L，用DNA末端補平試劑盒補平兩端；同時用PmeI酶切慢病毒表達質粒PWPI，經SAP去磷酸化后，用T4DNA連接酶與H-F2A-L連接，連接產物轉化DH-5a感受態細菌，抽提質粒后用載體測序引物EFl a和重鏈下游引物gammal-B作PCR，篩選正向插入陽性克隆PWPI/H-F2A-L，并進行測序驗證，即得；上述各引物為H-A(SEQ. ID. No. 4) :5，-CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTC T-3，，gammal-B (SEQ. ID. No. 5) :5，_ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AG_3，L-A(SEQ. ID. No. 6) :5，-TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTC T-3，，Kappa-B (SEQ. ID. No. 7) :5，_GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3，:EFl a (SEQ. ID. No. 8) :5，-TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3，。口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)的多妝 2A 基因編碼一種自剪切蛋白。兩個外源基因之間以2A序列連接形成一個完整的ORF，翻譯時融合蛋白可在編碼2A區域的C端被2A切開，將融合蛋白切割分離為兩個獨立的蛋白，FMDV 2A短基因序列和2A高效的自剪切效率使之成為構建多順反子載體的有效工具。Jianmin F.等人在腺相關病毒表達載體中利用有自我剪切能力的弗林蛋白酶(Furin)/ 口蹄疫病毒2A多肽(F/2A)同時表達單克隆抗體DClOl的重鏈和輕鏈，從而實現了全長抗體在體內持續高效的表達，并取得了顯著的抗腫瘤效果。本發明在嵌合抗體輕、重鏈之間弓I入F/2A序列和慢病毒表達系統對輕、重鏈進行共表達，并與含IRES的嵌合抗體慢病毒表達載體進行比較，結果表明由F/2A介導的嵌合抗體的表達水平要高于由IRES介導的嵌合抗體。本發明為獲得高表達水平的完整抗體展示了新的構建策略，也為抗pl85OTbB2基因工程抗體的研究開辟了新的途徑。


圖I是本發明重組慢病毒表達載體PWPI/H-F2A-L的構建策略圖。圖2是抗人pl85ertB2單抗嵌合輕、重鏈基因的PCR產物電泳圖，圖中M DNA markerDL2000,1 5嵌合輕鏈基因(L)，6 10嵌合重鏈基因(H)。圖3 是片段 H-F2A-L 電泳圖，圖中M DNA marker DL10000,1 片段 H-F2A-L。圖4是慢病毒表達質粒pWPI/H-F2A-L的PCR鑒定電泳圖，圖中M DNA markerDL10000,1 3pffPI/H-F2A-L質粒，4pWPI質粒，5和7載體引物EFla與重鏈下游引物gamma I -B對正向連接質粒的PCR擴增條帶,6和8載體引物EFI a與重鏈下游弓丨物gamma I -B對反向連接質粒的PCR擴增條帶。圖5是慢病毒三質粒共轉染293T細胞綠色熒光蛋白表達的顯微鏡觀察圖，圖中A、C、E分別為熒光下pWPI/H-F2A-L組、pWPI/H-IRES-L組、pWPI組，B、D、F分別為可見光下 pWPI/H-F2A-L 組、pWPI/H-IRES-L 組、pWPI 組。圖6是3種慢病毒的轉染效率流式細胞儀檢測圖，圖中A、B、C分別是轉染pWPI/H-F2A-L、pWPI/H-IRES-L、pWPI 的 293T 細胞，D 是未轉染的 293T 細胞。圖7是RT-PCR鑒定嵌合抗體的輕、重鏈的表達電泳圖，圖中1嵌合抗體H_F2A_L的輕鏈基因，2嵌合抗體H-IRES-L的輕鏈基因，3嵌合抗體H-F2A-L的重鏈Fd片段，4嵌合抗體H-IRES-L的重鏈Fd片段。
具體實施例方式含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體及其構建方法研究I材料與方法I. I質粒、菌株和細胞三質粒慢病毒系統由表達質粒pWPI、結構質粒pCMV-dR 8. 74和封套質粒pMD2G組成，為加拿大渥太華大學臨床腫瘤中心實驗室惠贈。含F/2A序列的質粒pUC57/F2A由上海生工公司構建。轉化用大腸桿菌DH-5a、含有抗pl85OTbB2人鼠嵌合輕、重鏈基因的質粒pWPI/H-IRES-L、293T細胞均由為廣西壯族自治區腫瘤防治研究所保存。 I. 2工具酶和主要試劑限制酶BamH I, Pvu II, Nsi I, Xba I, Pme I、T4DNA連接酶等均購自紐英倫生物技術公司。Taq DNA聚合酶、小量質粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、DNA末端補平試劑盒均購自Genstar公司。DNA marker、奸堿性磷酸酶(SAP)購自大連寶生物工程有限公司。Ε. Z. N. A.⑧無內毒素質粒提取試劑盒購自OMEGA公司；RIzol試劑購自Invitrogen公司。羊抗人K抗體、羊抗人IgG Fc-HRP、兔抗羊IgG-HRP購自Sigma公司。逆轉錄試劑盒購自MBI Fermentas公司。100mL/L胎牛血清購自四季青生物公司。PCR引物合成及產物測序由Invitrogen公司合成。I. 3 引物擴增嵌合抗體重鏈基因的引物為H-A(SEQ. ID. No. 4) :5，-CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTCT-3’ (含 BamH I 酶切位點 GGA TCC)，gammal-B (SEQ. ID. No. 5) :5，_ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AG_3， ；擴增嵌合抗體輕鏈基因的引物為L-A(SEQ. ID. No. 6) :5，-TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTCT-3，，Kappa-B (SEQ. ID. No. 7) :5，-GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3’(含Xba I 酶切位點 TCT AGT)；pWPI質粒克隆位點如的測序引物為EFl a (SEQ. ID. No. 8) :5，-TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3，；用于檢測抗人pl85ertB2嵌合抗體重鏈mRNA表達的引物為H-F(SEQ. ID. No. 9) :5’ -AAG TCC AAC TGC AGC AGT CTG G-3’H-R(SEQ. ID. No. 10) :5，-CTC GGG GCT GCC CTT TGG-3’ ；用于檢測抗人pl85ertB2嵌合抗體輕鏈mRNA表達的引物為L-F(SEQ. ID. No. 11) :5，-GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA-3，，L-R(SEQ. ID. No. 12) :5，-CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3，。I. 4抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗體重、輕鏈基因的擴增用小量質粒抽提試劑盒抽提含有抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗體輕、重鏈基因的質粒pWPI/H-IRES-L，并以此為模板，在DNA Taq酶作用下分別用H-A和gammal-B、L-A和Kappa-B擴增出嵌合重鏈基因H和嵌合輕鏈基因L ;擴增條件為94°C預變性5min，94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，35個循環，最后72°C延伸IOmin ;PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收目的基因。I. 5全長嵌合抗體H-F2A-L的構建I. 5. I接頭片段F2A的合成由上海生工公司合成接頭片段F2A，該片段由3部分構成嵌合重鏈H的3’端序列(含Nsi I酶切位點)、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及嵌合輕鏈L的5’端序列(含PvuII酶切位點的)；I. 5. 2中間質粒pUC57/F2A的構建將接頭片段F2A插入到pUC57質粒的BamH I和Xba I之間，構建中間質粒pUC57/F2A ；I. 5. 3含有嵌合輕鏈的質粒PUC57/F2A-L的構建
用BamH I和Xba I雙酶切質粒pUC57/F2A，酶切產物經I %的瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒分別回收接頭片段F2A和載體片段pUC57 ;進而用Pvu II酶切接頭片段F2A，獲得5’端為BamH I酶切位點和3’端為Pvu II酶切位點的接頭片段F2A ;用Pvu II和Xba I雙酶切嵌合輕鏈L，獲得5’端為Pvu II酶切位點和3’端為Xba I位點的輕鏈片段L ;然后，將這兩個片段用T4DNA連接酶連接后克隆入載體pUC57，獲得含有嵌合輕鏈的質粒 pUC57/F2A-L ；
I. 5. 4 片段 H-F2A-L 的拼接用BamH I酶和Xba I酶切pUC57/F2A_L，獲得片段F2A-L ;進而用Nsi I酶切片段F2A-L，獲得5’端為Nsi I酶切位點和3’端為Xba I酶切位點的片段F2A-L ;用BamH I和Nsi I雙酶切嵌合重鏈H，獲得5’端為BamH I酶切位點和3’端為Nsi I位點的重鏈片段H ;通過T4DNA連接酶與片段F2A-L相連，獲得5’端為BamH I酶切位點和3’端為Xba I位點的嵌合抗體全長片段H-F2A-L ；I. 6慢病毒表達質粒pWPI/H-F2A-L的構建將純化回收的片段H-F2A-L，用DNA末端補平試劑盒補平兩端。同時用PmeI酶切慢病毒表達質粒PWPI，經SAP去磷酸化后，用T4DNA連接酶與H-F2A-L連接，連接產物轉化DH-5a感受態細菌，抽提質粒后用載體測序引物EFl a和重鏈下游引物gammal-B作PCR，篩選正向插入陽性克隆PWPI/H-F2A-L，并進行測序驗證。慢病毒表達質粒pWPI/H-F2A_L的構建策略見圖I。I. 7慢病毒的包裝及病毒滴度測定用磷酸鈣沉淀法將慢病毒pWPI/H-F2A-L載體、pCMV_dR8. 74、pMD2. G共轉染293T細胞。48h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。72h收集轉染后的病毒上清，以O. 45 μ m濾器過濾，獲得的培養液上清則含有攜帶H-F2A-L的重組病毒。同時分別轉染pWPI/H-IRES-L+pCMVdR8. 74+pMD2. G 和 pWPI+pCMVdR8. 74+pMD2. G (空載載體對照)進入 293T 細胞作比較。在6孔板中分別接種2 X IO5的293T細胞，將所收集的上清按10'10'10'10'10_5、10_6倍稀釋，將Iml稀釋后的上清分別加入到相應的孔中。48h后在熒光顯微鏡下觀察各濃度孔中GFP的表達情況并計數表達GFP的細胞個數，乘以相應的稀釋倍數即可得到病
毒滴度。I. 8重組慢病毒感染293T細胞的轉導效率檢測用重組慢病毒按Hanawa H的方法(Comparison of various envelope proteinsfor their ability to pseudotype lentiviral vectors and transduce primitivehematopoietic cells from human blood[J]. Mol Ther, 2002, 5 :242-251)分別感染 293T細胞，分為實驗一組(PWPI/H-F2A-L)、實驗二組(pWPI/H-IRES-L)和對照組(pWPI)，重組病毒感染48h后，用流式細胞儀檢測GFP陽性細胞百分數將I X IO6細胞離心沉淀，用PBS洗二次將細胞重新懸浮于Iml PBS中，盡可能吹打成單個細胞，在流式細胞儀上統計GFP陽性細胞數，檢測慢病毒感染效率(轉基因效率)，以未感染重組慢病毒的293T細胞為陰性對照。I. 9嵌合抗體在293T細胞中的表達I. 9. IRT-PCR檢測嵌合抗體的表達
再次用3種慢病毒分別感染3組293T細胞，收集重復感染后的293T細胞，提取總RNA，反轉錄成cDNA，用RT-PCR分別鑒定嵌合抗體H-F2A-L和H-IRES-L的穩定表達。以H-F為5'端引物，以H-R為3'端引物擴增人-鼠嵌合抗體重鏈Fd片段；以L-F為5'端引物，以L-R為3'端引物擴增人-鼠嵌合抗體輕鏈。I. 9. 2ELISA法檢測嵌合抗體的表達以lmg/L羊抗人κ鏈抗體包被酶標板，4°C過夜，50g/L BSA封閉液37°C封閉2h后，分別加入重組慢病毒(pWPI/H-F2A-L、pWPI/H-IRES -L和pWPI)感染后的293T細胞培養上清液，同時以未感染的293T細胞上清為陰性對照。37°C孵育2h，經常規洗滌，加入羊抗人IgG Fe片段-HRP酶標抗體孵育，OPD顯色，室溫避光反應5min，酶聯免疫儀測定A490值，檢測細胞是否分泌人-鼠嵌合抗體。計量數據采用平均數土標準差表示，采用DPS 7. 05統計軟件進行方差分析。2 結果2. I抗人pl85OTbB2單抗嵌合重鏈基因⑶和嵌合輕鏈基因(L)的擴增用引物H-A和gammal-B、L-A和Kappa-B，分別從質粒pWPI/H-IRES-L中擴增出pl85OTbB2單抗的嵌合重鏈基因(H)和嵌合輕鏈基因(L)。經I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，H和L這兩條特異性條帶與理論值一致，大小分別為2100bp和810bp左右(如圖2)。2. 2全長嵌合抗體H-F2A-L的構建利用構建的中間質粒PUC57/F2A和擴增出的嵌合重鏈基因H、嵌合輕鏈基因L，經過多步酶切、連接，最終獲得嵌合抗體全長片段H-F2A-L，純化回收、電泳后可見大約為3000bp的條帶(圖3)。2. 3慢病毒表達質粒pWPI/H-F2A-L的構建用PmeI酶切慢病毒表達質粒pWPI，將片段H_F2A_L末端補平后插入克隆位點。為了確保H-F2A-L基因連接方向的正確，以pWPI載體上的引物EFla和重鏈下游引物gammal-B作PCR，若插入的基因是正向的，PCR應擴增出大小為2400bp的片段，若基因插入方向是反向的，則PCR擴增不出條帶(圖4)。測序結果顯示成功構建了含F/2A序列的抗pl85erbB2人鼠嵌合抗體全長基因的慢病毒表達載體pWPI/H-F2A-L。2. 4慢病毒的包裝及病毒滴度測定用慢病毒系統三質粒共轉染293T包裝細胞，48h后在熒光顯微鏡下觀察，三個實驗組均可見大量的綠色熒光蛋白GFP的表達(圖5)，說明構建的包裝細胞系能夠有效地產生慢病毒。將轉染72h后的包裝細胞上清液再感染293T細胞(此時293T作為靶細胞)，48h后測定6孔板中慢病毒的滴度，結果對照空載體pWPI組的病毒滴度最高，為2. I X IO6TU/mL, pffPI/H-F2A-L組的病毒滴度次之，為4. 3X105TU/mL ;而pWPI/H-IRES-L組的病毒滴度最低，為 3. 5X105TU/mL。2. 5基因轉導效率的檢測結果用3種重組慢病毒分別感染293T細胞，48h后通過流式細胞儀檢測GFP陽性細胞百分數。結果顯示，PWPI/H-F2A-L組的陽性細胞率為87. 68%,pffPI/H-IRES-L組的陽性細胞率為79. 08%,而空載體pWPI組的陽性細胞率最高，為95. 51 %，未感染慢病毒的293T陰性細胞沒有熒光表達(圖6)。可見當空載體pWPI中插入嵌合抗體基因后，慢病毒的轉染效率會下降，而轉導嵌合抗體H-F2A-L基因的效率要高于轉導嵌合抗體H-IRES-L基因的效率。2.6嵌合抗體輕、重鏈基因mRNA的表達經RT-PCR 檢測，轉染 pWPI/H-F2A-L 的 293T 細胞和轉染 pWPI/H-IRES-L 的 293T細胞后均有嵌合輕鏈基因和嵌合重鏈基因的表達(圖7)。2. 7嵌合抗體的表達采用夾心ELISA法測定4組細胞(轉染pWPI/H-F2A_L的293T細胞、轉染pWPI/H-IRES-L的293T細胞、轉染pWPI的293T細胞和未轉染的293T細胞)上清中嵌合抗體的表達。結果顯示，轉染PWPI/H-F2A-L的細胞上清和轉染pWPI/H-IRES-L的細胞上清為陽性反應，而轉染空載體pWPI的細胞上清為陰性反應(表I)。這表明無論是F/2A元件還是IRES元件連接的重、輕鏈都能夠在293T細胞中表達，而且都能夠正確地組裝成有活性的抗體，很好地分泌到細胞外。其中，由F/2A介導的嵌合抗體的表達水平要高于由IRES介導的嵌合抗體。表I ELISA分析嵌合抗體的表達
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轉染 pWPI/H-F2A-L 的細胞上清 2.485 ±0.030 a A 轉染 pWPI/H-IRES-L 的細胞上清 2.007 ±0.096 b B 轉染pWPI的細胞上清 0.334±0.248 c C 未轉染的細胞上清_0.299±0.095_c_C3 討論erbB2作為腫瘤發生的癌基因，在20% 30%的乳腺癌中過表達，在25% 32%的卵巢癌中過表達，是與乳腺癌、卵巢癌的侵襲轉移及預后密切相關的基因之一。針對pl85OTbB2胞外區抗原的抗pl85OTbB2抗體，顯示了良好的抗腫瘤療效。為了克服鼠單克隆抗體在人體治療中出現的問題，經典的基因工程抗體技術將人源抗體恒定區替代鼠抗體的恒定區，即構建人鼠嵌合抗體。嵌合抗體不僅保留了親本抗體的特異性和親和力，大大降低了人抗鼠抗體(HAMA)反應，而且其人源Fe段可激發抗體介導的細胞毒(ADCC)作用和補體介導的細胞毒(CDC)效應，從而增加其對腫瘤細胞的殺傷效果。構建嵌合抗體表達盒的策略，既有將輕、重鏈分別構建于不同表達載體的，也有將輕、重鏈串聯于同一表達載體的。據報道，雙順反子載體不僅可以將輕、重鏈的表達進行偶聯，而且還能夠提高抗體的表達水平。常用的表達雙順反子的元件為內部核糖體進入位點(IRES)或自剪切多肽2A，它們的作用機理分別為①IRES元件具有不依賴帽子結構而獨立募集核糖體的功能，進而可啟動下游基因的翻譯2A元件則可在翻譯過程中形成的高級結構對核糖體肽基轉移酶中心造成空間位阻，導致無法形成正常的肽鏈連接，但同時核糖體卻能繼續翻譯下游蛋白，從而形成一種類似蛋白水解酶的作用將前后兩個蛋白順式“切開”。由于兩者作用機理的差異，導致它們在多順反子表達中發揮的實際效果也存在明顯的特點，因此在實際應用中通常需要構建兩種或多種不同的表達載體來進行比較，才能找到最合適的表達方案。2005年，Jianmin F等人通過利用弗林蛋白酶(Furin)酶切位點和2A自剪切多肽(F/2A)連接抗體的輕鏈和重鏈，構建腺相關病毒表達載體。Furin是真核生物細胞中一種重要的內切蛋白酶。Furin能識別特定的氨基酸序列，對分泌途徑中許多重要的多肽和蛋白的前體進行剪切加工，使之具有生物活性。通過2A片段自剪切和Furin酶切位點的酶切，實現了在一個表達載體和一個開放閱讀框中同時均衡地表達一個全長抗體的輕、重鏈，經F/2A的自動剪切，去除了連接輕、重鏈的所有外源序列，抗體表達水平達到了治療腫瘤的水平，克服了輕、重鏈構建在兩個載體中所導致的抗體表達匹配不完全的缺點，為全長抗體的表達提供了一個新的方法和技術。2011年，李蒙等利用F/2A構建重組抗死亡受體5 (DR5)全長人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體PWPXL-HF2AL，結果表明用F/2A多肽技術表達的人鼠嵌合抗體可在F/2A處自我剪切，人鼠嵌合抗體的輕、重鏈表達對稱并具有與其母本鼠源抗體相似的親和力和殺傷多種腫瘤細胞的活性。 在此基礎上，本發明利用F/2A構建重組抗pl85ertB2全長人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體pWPI/H-F2A-L，并且與已構建的另一雙順反子表達載體pWPI/H-IRES-L進行比較。結果表明，pffPI/H-F2A-L組的病毒滴度(4. 3X105TU/mL)高于pWPI/H-IRES-L組的病毒滴度(3. 5 X 105TU/mL)，而且前組病毒的感染效率(87. 68% )也高于后組的(79. 08% )。其原因可能是因為IRES的結構較大(約590bp)，而F/2A的結構小(84bp)，故F/2A可以緩解慢病毒載體PWPI裝載量的壓力，更有利于病毒的包裝和感染；ELISA檢測顯示，由F2A介導的嵌合抗體表達水平要高于由IRES介導的。其原因可能是因為IRES對位于其后的基因翻譯起始能力相對較弱，導致其下游基因的表達量僅是上游的20 % 50 %，而F/2A在維持上下游基因表達平衡性方面優于IRES元件，故由F/2A介導的嵌合抗體完整分子表達水平會較高。綜上所述，含F/2A的嵌合抗體表達盒,與含IRES的表達盒相比,更有利于慢病毒介導的基因轉移和嵌合抗體的表達。
權利要求
1.一種含F/2A序列的抗pl85MbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體，其特征在于該載體是PWPI/H-F2A-L,其中H和L分別是抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體重鏈基因和抗pl85eAB2人鼠嵌合抗體輕鏈基因，F2A是弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽。
2.根據權利要求I所述的含F/2A序列的抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體，其特征在于所述抗pl85eAB2人鼠嵌合抗體重鏈基因由鼠抗人pl85eAB2單抗重鏈可變區基因vH和人IgGl的重鏈恒定區基因Y I連接而成；所述抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體輕鏈基因由鼠抗人pl85eAB2單抗輕鏈可變區基因vL和人IgGl的輕鏈恒定區基因K連接而成。
3.根據權利要求I所述含F/2A序列的抗pl85 bB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體的構建方法，其特征在于用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶Furin/ 口蹄疫病毒2A多肽F/2A連接人鼠嵌合抗體的重鏈和輕鏈，形成一個開放閱讀框ORF，插入慢病毒表達載體pWPI，即得。
4.根據權利要求3所述含F/2A序列的抗pl85 bB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體的構建方法，其特征在于包括以下步驟 〈1>抗pl85MbB2人鼠嵌合抗體重、輕鏈基因的擴增 用小量質粒抽提試劑盒抽提含有抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗體輕、重鏈基因的質粒pWPI/H-IRES-L，并以此為模板，在DNA Taq酶作用下分別用H-A和gammal-B、L-A和Kappa-Β擴增出嵌合重鏈基因H和嵌合輕鏈基因L ;擴增條件為94°C預變性5min，94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，35個循環，最后72°C延伸IOmin ;PGR產物經I %的瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收目的基因； <2>全長嵌合抗體H-F2A-L的構建 ①接頭片段F2A的合成該片段由3部分構成含NsiI酶切位點的嵌合重鏈H的3’端序列、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及含Pvu II酶切位點的嵌合輕鏈L的5’端序列； ②中間質粒PUC57/F2A的構建將接頭片段F2A插入到pUC57質粒的BamHI和Xba I之間，獲得中間質粒PUC57/F2A ； ③含有嵌合輕鏈的質粒pUC57/F2A-L的構建用BamHI和Xba I雙酶切質粒pUC57/F2A，酶切產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒分別回收接頭片段F2A和載體片段PUC57 ;進而用Pvu II酶切接頭片段F2A，獲得5I酶切位點和3’端為PvuII酶切位點的接頭片段F2A;用Pvu II和Xba I雙酶切嵌合輕鏈L，獲得5’端為Pvu II酶切位點和3’端為Xba I位點的輕鏈片段L ;然后，將這兩個片段用T4DNA連接酶連接后克隆入載體PUC57，獲得含有嵌合輕鏈的質粒pUC57/F2A-L ； ④片段H-F2A-L的拼接用BamHI酶和Xba I酶切pUC57/F2A_L，獲得片段F2A-L ;進而用Nsi I酶切片段F2A-L，獲得5’端為Nsi I酶切位點和3’端為Xba I酶切位點的片段F2A-L ;用BamH I和Nsi I雙酶切嵌合重鏈H，獲得5’端為BamH I酶切位點和3’端為Nsi I位點的重鏈片段H ;通過T4DNA連接酶與片段F2A-L相連，獲得5’端為BamH I酶切位點和3’端為Xba I位點的嵌合抗體全長片段H-F2A-L ； <3>慢病毒表達質粒pwpI/H-F2A-L的構建 將純化回收的片段H-F2A-L，用DNA末端補平試劑盒補平兩端；同時用PmeI酶切慢病毒表達質粒pWPI，經SAP去磷酸化后，用T4DNA連接酶與H-F2A-L連接，連接產物轉化.DH-5a感受態細菌，抽提質粒后用載體測序引物EFl a和重鏈下游引物gammal-B作PCR，篩選正向插入陽性克隆PWPI/H-F2A-L，并進行測序驗證，即得； 所述各引物為H-A :5’ -CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC T-3’，gammal-B :5’ -ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AG-3’ ；L-A :5’ -TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC T-3’，Kappa-B :5’ -GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3’ ；EFl α :5’ -TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3’。
全文摘要
本發明公開了一種含F/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體及其構建方法，用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶(Furin)/口蹄疫病毒2A多肽(F/2A)連接人鼠嵌合抗體的重鏈和輕鏈，形成一個開放閱讀框(ORF)，插入慢病毒表達載體pWPI，構建重組抗p185erbB2全長人鼠嵌合抗體表達載體pWPI/H-F2A-L。經測序鑒定，pWPI/H-F2A-L與預期設計一致。重組慢病毒的感染效率分別為87.68％，感染293T細胞后，有嵌合重鏈和嵌合輕鏈的表達。與含IRES的嵌合抗體慢病毒表達載體進行比較，由F/2A介導的嵌合抗體的表達水平要高于由IRES介導的嵌合抗體，為今后抗p185erbB2工程抗體的研究奠定了基礎。
文檔編號C12N15/867GK102618583SQ20121008091
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月24日 優先權日2012年3月24日
發明者劉芳, 張瑋, 李力 申請人:廣西壯族自治區腫瘤防治研究所