本發明屬于免疫檢驗技術領域，具體涉及一種檢測人超敏C反應蛋白用微流控紙芯片及其制備方法和試劑盒。

背景技術：

C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)，是Tillet和Francis于1930年在急性大葉性肺炎患者血清中發現的，因其在鈣離子存在時能和肺炎雙球菌細胞壁的C多糖起沉淀反應而得名，是相對分子質量為115-140KD的血清β球蛋白。關于CRP的研究已經有70多年的歷史，傳統觀點認為CRP是一種非特異的炎癥標志物。CRP在臨床上主要用于評價感染、組織損傷和炎癥性疾病，同時為炎癥性疾病的診斷提供數據支持，也可為疾病的治療和監控提供診療信息。

隨著檢測技術的進步，采用超敏感方法檢測到的CRP被稱為超敏CRP(HS-CRP)。近年來，大量的文章研究顯示，HS-CRP在冠心病、中風、心肌梗死、周圍血管栓塞等疾病診斷和預測中發揮越來越重要的作用。在由慢性炎癥引發心血管疾病的獨立危險因素中CRP的作用已被證實，及時監測CRP的水平變化對心血管疾病的干預及預后起重要作用，且CRP水平越高，發生心腦血管的危險性就越大。因此歐美等發達國家已將HS-CRP作為預防心血管疾病的相對獨立的一個新的篩查指標。有學者認為CRP是心血管疾病危險評估的“金標準”，是心血管疾病強有力的預示因子與危險因子。

目前在臨床上常規測定CRP的主要方法有放射免疫法、免疫比濁法、膠體金免疫層析法以及ELISA法等。放射免疫法結果較準確，線性范圍較寬，靈敏度可達3ng/mL，但是操作繁瑣且存在同位素污染問題，已逐漸被其它方法所代替。免疫比濁法目前應用廣泛，但其檢測靈敏度較低約為5μg/mL，且通常需要自動生化分析儀和自動化免疫測定儀等大型儀器，操作復雜耗時長，所需樣本量大。膠體金免疫層析法具有快速、便捷、價廉及適合單人份操作等優點，但是只能定性或半定量檢測，易出現誤判，靈敏度低。而ELISA法檢測CRP的檢測靈敏度達到10～39ng/ml(專利號為CN201110257767.9，CN201510673472.8和CN201510673472.8)。目前還沒有針對CRP的高靈敏度快速檢測的試紙裝置。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種檢測人超敏C反應蛋白用微流控紙芯片及其制備方法和試劑盒，使所述微流控紙芯片具有較高的檢測靈敏度。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種檢測人超敏C反應蛋白用微流控紙芯片的制備方法，包括以下步驟：

1)在電腦上設計紙芯片的圖案；

2)用噴蠟打印機將圖案打印到空白的紙芯片上，圓形圖案區域為檢測區；

3)將所述步驟2)得到的紙芯片進行烘烤后冷卻，得到預處理紙芯片；

4)在所述步驟3)得到的預處理紙芯片的檢測區包被超敏C反應蛋白一抗溶液后依次干燥、洗滌，得到包被紙芯片；所述超敏C反應蛋白一抗溶液的包被濃度為10～100μg/ml；

5)用封閉液封閉所述步驟4)中得到的包被紙芯片的檢測區，封閉后的紙芯片經孵育，洗滌和干燥，得到檢測人超敏C反應蛋白用微流控紙芯片。

優選的，所述步驟1)中圖案的形狀包括圓形或矩形；所述圖案按照矩陣排列；所述紙芯片上圖案的個數包括24、48或96個；相鄰圖案的中心之間的距離為15～20mm；每個圖案的面積為70～90mm²。

優選的，所述步驟3)中烘烤溫度為100～120℃；烘烤的時間優選為10～40s。

優選的，所述步驟4)中超敏C反應蛋白一抗溶液的包被濃度為20～80ug/ml。

優選的，所述步驟4)和步驟5)中干燥的溫度獨立為20～30℃；干燥的時間為5～20min。

優選的，所述步驟4)和5)中洗滌用洗滌液為PBST緩沖液；所述PBST緩沖液為含有體積濃度0.05％Tween-20的PBS緩沖液；PBS緩沖液的pH值為7.2～7.4。

優選的，所述步驟5)中封閉液為含有質量濃度5％BSA的PBST緩沖液；PBST緩沖液的pH值為7.2～7.4。

優選的，所述步驟5)中孵育的時間為5～20min；孵育的溫度為20～30℃。

本發明提供了所述的方法制備的檢測人超敏C反應蛋白的微流控紙芯片，由紙芯片、附著在紙芯片疏水區域上的蠟和附著在紙芯片親水區域的人超敏C反應蛋白抗體組成；所述疏水區域將親水區域包圍。

本發明還提供了一種檢測人超敏C反應蛋白用試劑盒，包括權利要求1～8任意一項所述的方法制備的微流控紙芯片或權利要求9所述的微流控紙芯片，0.5～5μg/ml生物素標記的人超敏C反應蛋白二抗、0.5～2μg/ml HRP-鏈霉親和素、化學發光底物液、人超敏C反應蛋白標準品。

本發明提供了一種檢測人超敏C反應蛋白用微流控紙芯片的制備方法，1)在電腦上設計紙芯片的圖案；2)用噴蠟打印機將圖案打印到空白的紙芯片上，圓形圖案區域為檢測區；3)將所述步驟2)得到的紙芯片進行烘烤后冷卻，得到預處理紙芯片；4)在所述步驟3)得到的預處理紙芯片的檢測區包被超敏C反應蛋白一抗溶液后依次干燥、洗滌，得到包被紙芯片；所述超敏C反應蛋白一抗溶液的包被濃度為10～100μg/ml；5)用封閉液封閉所述步驟4)中得到的包被紙芯片的檢測區，封閉后的紙芯片經孵育，洗滌和干燥，得到檢測人超敏C反應蛋白用微流控紙芯片。本發明提供的所述方法操作簡單、重復性好，適合工業批量生產。

本發明提供的方法制備的紙芯片作為一種新型的檢測技術具有價格低廉、可便攜式、生物相容性好、簡單快速、試劑消耗量小和設計靈活等特點，已顯示出其在POCT診斷平臺的強大生命力；同時所述紙芯片保存時間長，在4℃至少可以保存6周。

本發明提供的試劑盒是在紙芯片的化學發光免疫分析(CLIA)法中，引入了生物素-親和素系統來放大信號，提高了紙芯片的檢測信噪比，從而提高檢測靈敏度。檢測的靈敏度可達0.5ng/mL，遠遠超過用于快速檢測的免疫層析試紙的靈敏度至少一個數量級以上；接近部分HS-CRP ELISA試劑盒的檢測性能。該靈敏度可以滿足對于預防心血管疾病的POCT快速檢測的需要。

進一步的，本發明提供的試劑盒，通過進一步限定兩種抗體的濃度和種類，實現了紙芯片在生物大分子的應用。本發明首次將微流控紙芯片用于檢測CRP。

附圖說明

圖1為微流控紙芯片的示意圖；

圖2為測量靈敏度的標準曲線；

圖3為紙芯片與ELISA試劑盒CRP檢測結果的相關性。

具體實施方式

本發明提供了一種檢測人超敏C反應蛋白用微流控紙芯片的制備方法，包括以下步驟：

1)在電腦上設計紙芯片的圖案；

2)用噴蠟打印機將圖案打印到空白的紙芯片上，圓形圖案區域為檢測區；

3)將所述步驟2)得到的紙芯片進行烘烤后冷卻，得到預處理紙芯片；

4)在所述步驟3)得到的預處理紙芯片的檢測區包被超敏C反應蛋白一抗溶液后依次干燥、洗滌，得到包被紙芯片；所述超敏C反應蛋白一抗溶液的包被濃度為10～100μg/ml

5)用封閉液封閉所述步驟4)中得到的包被紙芯片的檢測區，封閉后的紙芯片經孵育，洗滌和干燥，得到檢測人超敏C反應蛋白用微流控紙芯片。

本發明首先在在電腦上設計紙芯片圖案。

本發明中，所述紙芯片優選Whatman^TM1號層析紙。

本發明中，所述設計的方法優選采用Adobe illustrator繪圖軟件進行設計。

本發明中，所述圖案的形狀優選包括圓形或矩形。所述圖案優選按照矩陣排列。所述紙芯片上圖案的個數沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的方案即可。本發明實施例中，設計的紙芯片圖案的個數包括24(4×6)、48(6×8)或96(8×12)個。相鄰圖案的中心之間的距離優選為15～20mm，更優選為18；每個圖案的面積優選為25～30mm²；當所述圖案為圓形時，所述圓形直徑優選為5～6mm。所述圖案為親水區域；紙芯片上親水區域以外的區域為疏水區域。

在電腦上設計好紙芯片的圖案后，本發明用噴蠟打印機將圖案打印到空白的紙芯片上，圓形圖案為檢測區。

本發明對所述噴蠟打印機的種類沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的噴蠟打印機即可。本發明實施例中，所述噴蠟打印機的型號為施樂ColorQube8870。

得到附著有蠟的紙芯片后，本發明將所述得到的紙芯片進行烘烤后冷卻，得到預處理紙芯片。

本發明中，所述烘烤優選采用電子控溫儀器進行。所述電子控溫儀器的種類沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的電子控溫儀器即可。本發明中，所述烘烤溫度優選為100～120℃，更優選為105～115℃，最優選為110℃。所述烘烤的時間優選為10～40s，更優選為20～30s，最優選為25s。本發明中，所述烘烤的目的是將蠟均勻的附著在紙芯片上。

本發明中，所述冷卻的程度優選為紙芯片的溫度降至25～28℃。

得到預處理紙芯片后，本發明在所述預處理紙芯片的檢測區包被超敏C反應蛋白一抗溶液后依次干燥、洗滌，得到包被紙芯片；所述超敏C反應蛋白一抗溶液的包被濃度為10～100μg/ml。

本發明中，所述人超敏C反應蛋白一抗溶液的包被濃度優選為20～80μg/ml，更優選為40～60μg/ml，最優選為50μg/ml。本發明中，所述包被的方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的包被方法即可。本發明實施例中，所述包被的方法是將所述一抗溶液滴加到檢測區。本發明中，所述包被的時間優選為30～100min，更優選為60min。所述包被的體積優選為1～3mL/cm²。本發明中，所述人超敏C反應蛋白一抗溶液購自廣州萬孚生物技術股份有限公司。

本發明中，所述干燥的溫度獨立優選為20～30℃，更優選為25℃；干燥的時間為5～20min，更優選為10min。

本發明中，所述洗滌用洗滌液優選為PBST緩沖液；所述PBST緩沖液為含有體積濃度0.05％Tween-20的PBS緩沖液；PBS緩沖液的pH值優選為7.2-7.4。

得到的包被紙芯片后，本發明用封閉液封閉所述包被紙芯片的檢測區，封閉后的紙芯片經孵育，洗滌和干燥，得到檢測人超敏C反應蛋白用微流控紙芯片。

本發明中，所述封閉液優選為含有質量濃度5％BSA的PBS溶液；PBS緩沖液的pH值為7.2-7.4。

本發明中，所述孵育的時間優選為5～20min，更優選為10～15min；孵育的溫度優選為20～30℃，更優選為15℃。本發明中，洗滌的次數優選為2～3次。本發明中，洗滌用洗滌液為PBST緩沖液；所述PBST緩沖液為含有體積濃度0.05％Tween-20的PBS緩沖液；PBS緩沖液的pH值為7.2-7.4。

本發明中，所述干燥的溫度獨立優選為20～30℃，更優選為25℃；干燥的時間為5～20min，更優選為10min。

本發明提供了所述的方法制備的檢測人超敏C反應蛋白的微流控紙芯片，由紙芯片、附著在紙芯片疏水區域上的蠟和附著在紙芯片親水區域的人超敏C反應蛋白抗體組成；所述疏水區域將親水區域包圍。

本發明還提供了一種檢測人超敏C反應蛋白用試劑盒，包括上述方法制備的微流控紙芯片，0.5～5μg/ml生物素標記的人超敏C反應蛋白二抗溶液、0.5～2μg/ml HRP-鏈霉親和素、化學發光底物液、人超敏C反應蛋白標準品。

本發明提供的試劑盒包括上述方法制備的微流控紙芯片。

本發明提供的試劑盒包括生物素標記的人超敏C反應蛋白二抗溶液。本發明中，所述生物素標記的人超敏C反應蛋白二抗溶液的濃度為0.5～5μg/ml，優選為1.0～4μg/ml，更優選為1.5～3.0μg/ml，最優選為2.0μg/ml。所述生物素標記的人超敏C反應蛋白二抗溶液的制備方法優選采用生物素標記試劑盒將生物素和二抗體進行偶聯。

本發明中，所述生物素標記試劑盒的來源沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的生物素標記試劑盒即可。本發明實施例中，所述生物素標記試劑盒購thermo fisher公司。所述人超敏C反應蛋白二抗購自杭州啟泰生物技術有限公司。

本發明提供的試劑盒包括HRP-鏈霉親和素。所述HRP-鏈霉親和素的濃度為0.5～2μg/ml，優選為0.8～1.5μg/ml，更優選為1.0～1.2μg/ml。所述HRP-鏈霉親和素的來源沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的HRP-鏈霉親和素即可。本發明中，所述HRP-鏈霉親和素購自thermo fisher公司的Poly-HRPStreptavidin。

本發明提供的試劑盒包括化學發光底物液。化學發光底物液的種類沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的化學發光底物液即可。在本發明的實施例中，所述化學發光底物液購自密理博公司。

本發明提供的試劑盒包括人超敏C反應蛋白標準品。所述人超敏C反應蛋白標準品的濃度優選為0～100ng/ml。所述人超敏C反應蛋白標準品的來源優選為杭州啟泰生物技術有限公司。

在本發明中，所述試劑盒對人超敏C反應蛋白的檢測方法，包括以下步驟：

1)將5μl待測樣品滴加在紙芯片的檢測區，室溫孵育5min，緩沖液沖洗2次；

2)滴加5μl生物素標記的CRP二抗溶液，室溫孵育5min，緩沖液沖洗2次；

3)滴加5μl HRP-鏈霉親和素，室溫孵育5min，洗滌液沖洗2次；

4)滴加5μl化學發光底物液，在化學發光儀拍照；

5)用圖像分析軟件對化學發光儀拍攝的照片進行灰度分析，根據繪制標準曲線，計算得到待測樣品的準確CRP濃度。

標準曲線的獲取方法沒有特殊限制，按照樣品的檢測方法即可。

下面結合實施例對本發明提供的一種檢測人超敏C反應蛋白用微流控紙芯片及其制備方法和試劑盒進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護范圍的限定。

實施例1

利用Adobe illustrator繪圖軟件設計紙芯片的圓形，按照微孔板的排列方式設置圓形圖案，每隔一列設計紙芯片檢測區，紙芯片測定區的直徑為5mm，相鄰的圓形測定區之間的距離為18mm，繪制了4×6共24個檢測區(圖1微流控紙芯片的示意圖)。用施樂ColorQube8870噴蠟打印機在Whatman^TM1號層析紙上打印設計好的圖案。

用電子控溫儀器在110℃對蠟印的層析紙烘烤30s，目的是將打印的蠟烤化并使其均勻的滲透到層析紙的內部，從而在未被蠟浸染的部分形成親水的檢測區，取出層析紙，室溫冷卻。

在檢測區滴加5μl濃度為20μg/ml CRP一抗，室溫自然干燥10min，緩沖液沖洗2次；將10μl封閉液滴加在檢測區，室溫孵育10min，緩沖液沖洗2次；室溫干燥后，即完成了紙芯片的制備。

實施例2

利用Adobe illustrator繪圖軟件設計紙芯片的圓形，按照微孔板的排列方式設置圓形圖案，每隔一列設計紙芯片檢測區，紙芯片測定區的直徑為6mm，相鄰的圓形測定區之間的距離為20mm，繪制了6×8共48個檢測區(圖1微流控紙芯片的示意圖)。用施樂ColorQube8870噴蠟打印機在Whatman^TM1號層析紙上打印設計好的圖案。

用電子控溫儀器在100℃對蠟印的層析紙烘烤40s，目的是將打印的蠟烤化并使其均勻的滲透到層析紙的內部，從而在未被蠟浸染的部分形成親水的檢測區，取出層析紙，室溫冷卻。

在檢測區滴加5μl濃度為80ug/ml CRP一抗，室溫自然干燥15min，緩沖液沖洗2次；將10μl封閉液滴加在檢測區，室溫孵育10min，緩沖液沖洗2次；室溫干燥后，即完成了紙芯片的制備。

實施例3

利用Adobe illustrator繪圖軟件設計紙芯片的圓形，按照微孔板的排列方式設置圓形圖案，每隔一列設計紙芯片檢測區，紙芯片測定區的直徑為6mm，相鄰的圓形測定區之間的距離為15mm，繪制了9×12共96個檢測區。用施樂ColorQube8870噴蠟打印機在Whatman^TM1號層析紙上打印設計好的圖案。

用電子控溫儀器在120℃對蠟印的層析紙烘烤20s，目的是將打印的蠟烤化并使其均勻的滲透到層析紙的內部，從而在未被蠟浸染的部分形成親水的檢測區，取出層析紙，室溫冷卻。

在檢測區滴加5μl濃度為40μg/ml CRP一抗，室溫自然干燥15min，緩沖液沖洗2次；將10μl封閉液滴加在檢測區，室溫孵育15min，緩沖液沖洗2次；室溫干燥后，即完成了紙芯片的制備。

實施例4

利用Adobe illustrator繪圖軟件設計紙芯片的圓形，按照微孔板的排列方式設置圓形圖案，每隔一列設計紙芯片檢測區，紙芯片測定區的直徑為4mm，相鄰的圓形測定區之間的距離為15mm，繪制了9×12共96個檢測區。用施樂ColorQube8870噴蠟打印機在Whatman^TM1號層析紙上打印設計好的圖案。

用電子控溫儀器在120℃對蠟印的層析紙烘烤20s，目的是將打印的蠟烤化并使其均勻的滲透到層析紙的內部，從而在未被蠟浸染的部分形成親水的檢測區，取出層析紙，室溫冷卻。

在檢測區滴加5μl濃度為60μg/ml CRP一抗，室溫自然干燥12min，緩沖液沖洗2次；將10μl封閉液滴加在檢測區，室溫孵育12min，緩沖液沖洗2次；室溫干燥后，即完成了紙芯片的制備。

實施例5

利用Adobe illustrator繪圖軟件設計紙芯片的圓形，按照微孔板的排列方式設置圓形圖案，每隔一列設計紙芯片檢測區，紙芯片測定區的直徑為4mm，相鄰的圓形測定區之間的距離為15mm，繪制了9×12共48個檢測區。用施樂ColorQube8870噴蠟打印機在Whatman^TM1號層析紙上打印設計好的圖案。

用電子控溫儀器在120℃對蠟印的層析紙烘烤20s，目的是將打印的蠟烤化并使其均勻的滲透到層析紙的內部，從而在未被蠟浸染的部分形成親水的檢測區，取出層析紙，室溫冷卻。

在檢測區滴加5μl濃度為50μg/ml CRP一抗，室溫自然干燥20min，緩沖液沖洗2次；將10μl封閉液滴加在檢測區，室溫孵育20min，緩沖液沖洗2次；室溫干燥后，即完成了紙芯片的制備。

實施例6

標準曲線的建立：

將CRP標準品濃度分別稀釋為0、10、25、100ng/mL，將5μl不同濃度的CRP標準品，滴加在實施例5制備的紙芯片的檢測區上，室溫孵育5min，緩沖液沖洗2次；滴加5μl生物素標記的CRP二抗溶液，室溫孵育5min，緩沖液沖洗2次；滴加5μl HRP-鏈霉親和素，室溫孵育5min，緩沖液沖洗2次。滴加5μl化學發光底物液，用便攜式化學發光儀拍照，整個測定過程可在20min之內完成。用化學發光分析儀拍照，通過灰度分析獲得各反應區的相對發光值(RLU)。依據標準品繪制出標注曲線并得到方程，把待測品的相對發光值(RLU)代入方程，求得樣品的CRP濃度。

以CRP標準品各濃度(0、10、25、100ng/mL)為X，各標準品發光值為Y，進行線性擬合，繪制標準曲線如附圖2，擬合方程為y＝8.199x+102.669，相關系數為0.999。

用零濃度校準品，重復測定20次，得出20次測量結果的相對發光值(RLU)，計算其平均值(Mean)和標準差(SD)，Mean+2SD的RLU值代入擬合方程，對應的濃度值，即為本紙芯片檢測CRP的靈敏度0.41ng/mL。

實施例7

將實施例1～5制備的紙芯片用于精密度檢測，具體是按照實施例6中步驟進行操作。

低值標準品選擇12.5ng/mL，高值標準品選擇50ng/mL，分別計算批內和批間的變異系數(CV)。結果如表1所示。

表1 CRP紙芯片的精密度

注：批間指不同實施例制備得到的5個紙芯片；批內指同一芯片上不同檢測區的檢測值。

由表1中檢測數據可知，批內和批間CV均控制在10％以內，表明CRP紙芯片的精密度較好。

實施例8

與商業化ELISA試劑盒的相關性：

收集31份病人血清，把本發明制作的紙芯片測定值與診斷級ELISA試劑盒(Diagnostic Automation公司CRP ELISA試劑盒)的測定值進行對比。圖3為紙芯片與ELISA試劑盒CRP檢測結果的相關性，圖3表明，本發明制作的紙芯片測定值與診斷級ELISA試劑盒的測定值具有良好的相關性，相關系數r＝0.964(圖3)。此外，本發明提供的方法制備的紙芯片能夠用時在20min以內實現了快速檢測，比ELISA試劑盒的檢測時間縮短了40min。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。