本發明屬于微納加工制備領域，具體涉及活體生物材料制備技術，尤其涉及一種基于冰刻技術實現活體生物材料表面微納米結構的加工工藝。

背景技術：

1、利用微納加工技術可以在各種平面襯底上進行精細結構的加工，在集成電路制造、傳感技術、微機電系統和納米材料制備等領域都有廣泛的應用。

2、目前主流的微納加工技術包括：光子光刻、雙光子聚合、納米壓印、電子束刻蝕、掃描探針直寫和電子束誘導沉積。然而，目前還沒有一種微納加工方法可以直接在活體生物體表面進行微納米結構的加工制造。因為活體生物表面凹凸不平，現行的加工方法大多無法在不平整的表面進行加工，且現行的加工技術中都包含了活體生物不能承受的操作，例如刻蝕、高溫烘烤、有毒的有機溶劑、強電子輻射和真空等。

3、冰光刻技術是一種新型的微納加工方法，其利用冰作為電子束抗蝕劑，已被證明是一種具有廣闊前景的微納制造方法。公開號為us?8,790,863,b2的美國專利文獻(公開日：2014.07.29)公開了以水冰為前驅體的冰刻方法。該技術中的冷凍過程與冰薄膜的存在會降低電子輻射對襯底的損傷，該方法對生物樣品的加工有著突出的優勢。然而，到目前為止，并未有冰光刻技術直接在生物樣品上進行加工的應用。直接在生物樣品上進行微納結構的加工，可能會促進在微納尺度上利用光、電、熱、磁場等多種物理手段對生物進行精準高效地影響、檢測和操控。

技術實現思路

1、本發明提供了一種基于冰刻技術實現活體生物材料表面微納米結構的加工方法。該方法工藝步驟簡單，可原位加工，加工精度較高，生物相容性好，可以處理脆弱且凹凸不平的活體生物樣品。

2、本發明提供一種用于活體生物表面的微納加工方法，包括：根據待加工生物樣品的特性，引誘其進入強抗逆性狀態，利用冰刻方法在活體生物表面加工微納圖案；加工完成后對處于強抗逆性狀態的生物樣品進行復活操作，實現活體生物表面的微納加工。

3、作為優選，根據生物樣品在其強抗逆性狀態下的承受程度，確定微納加工過程中的基底材料、前驅體材料、抽真空速率、真空度、降溫升溫速度、冰層厚度、電子束曝光參數。

4、本發明提供了一種用于活體生物表面的微納加工方法，包括：根據待加工生物樣品的特性，引誘其進入強抗逆性狀態，根據該狀態生物的承受程度，確定加工過程中的基底材料、抽真空速率、真空度、降溫升溫速度、最低溫度、冰層厚度、電子束曝光參數，用電子束曝光附著在樣品表面的前驅體材料，從而達到在活體生物表面加工微納圖案的目的，最后針對生物樣品的特性提供適宜條件，生物樣品就會帶著定制的結構活動起來。

5、一種用于活體生物表面的微納加工方法，包括如下步驟：

6、(1)誘導生物樣品進入強抗逆性狀態，令其附著在基底材料上；

7、(2)將準備好的生物樣品和基底一同放入掃描電子顯微鏡的腔體內，將基底和生物樣品共同降溫并保持低溫；

8、(3)將前驅體材料以氣相狀態通入腔體，前驅體材料在生物樣品的表面形成冰薄膜；

9、(4)用電子束對步驟(3)中的冰薄膜進行曝光；

10、(5)升溫去除未被曝光的冰薄膜，得到表面帶有結構的生物樣品；

11、(6)將樣品從掃描電子顯微鏡的腔體中取出，為生物樣品創造適宜條件，即生物樣品對應的復活條件，生物樣品帶著定制的微納結構進入活躍狀態。

12、本發明中，所述的活體生物樣品為緩步動物門、極端嗜寒菌和其他在休眠、假死、隱生狀態下可以抵抗干燥、低溫和真空環境的生物。

13、本發明中，所述生物樣品的選擇需要進行文獻調研并進行預實驗判斷其是否可以承受實驗操作環境。

14、為達在活體生物表面制作微納圖案的目的，本發明需要在預實驗后，確定適合的加工參數。本發明中，所述對生物樣品的預實驗需要根據實際選擇的掃描電鏡的工作環境確定。例如：若選擇環境掃描電子顯微鏡，需要在預實驗中判斷處于強抗逆性狀態下的生物是否可以至少承受1kpa的真空環境、生物體內水分含量低于活躍狀態的30％的狀態下是否可以存活大于5小時、處于強抗逆性狀態下的生物體是否可以承受時間約5s的1kev電壓的電子輻射、該生物是否可以承受該掃描電子顯微鏡的抽真空速率。進一步，例如對緩步動物，若選擇場發射掃描電子顯微鏡，應在預實驗中判斷其處于強抗逆性狀態下可以承受高于6*10-7mba的真空度、其含水量低于活躍狀態的10％的狀態下可以存活大于5小時、處于強抗逆性狀態下的緩步動可以承受時間約5s的1kev電壓的電子輻射、可以承受的抽真空速率約為3mbar/s。

15、本發明中，所述生物樣品優選為緩步動物門內的物種。

16、本發明中，所述生物樣品活躍狀態的長度為50um-1000um。優選為200um-500um。

17、本發明中步驟(1)中，所述強抗逆性狀態指的是生物樣品進入具有更強的抵抗干燥、真空、冷凍能力的狀態。例如：緩步動物在缺水隱生的狀態下，具有極強的抵抗真空、干燥、冷凍、電子輻射的能力，所以對于緩步動物其強抗逆性狀態可以選擇缺水隱生的狀態。

18、本發明中步驟(1)中，所述基底材料有利于生物樣品附著、可以輔助生物樣品順利進入和保持強抗逆性狀態。例如：針對緩步動物，可以選擇疏松多孔且親水性較強的材料，疏松多孔的結構可以輔助活躍狀態的緩步動物爬行，親水性較強且疏松多孔的結構可以保證緩步動物在進入缺水隱生狀態的過程中以較慢的速度排出體內的水分，提高其進入缺水隱生狀態的成功率。

19、本發明中步驟(1)中，所述基底材料應具有良好的導熱性，以便其在步驟(2)中可以輔助生物樣品進行快速均勻降溫。

20、本發明中步驟(1)中，所述基底材料應具有良好的導電性，以便其在步驟(3)中可以輔助定位生物樣品并減少電荷累積。

21、即作為優選，所述基底材料為可以輔助生物樣品順利進入和保持強抗逆性狀態、具有一定的導電性保證其在掃描電鏡的觀察下不會產生電荷積累、具有一定的導熱性以保證生物樣品可以快速均勻地降至低溫的材料。

22、本發明中，所述基底材料由疏松多孔的親水性支撐體以及負載在該支撐體上的導電組份組成；所述導電組份包括硅、鉑、金、鍺、鈦、鉻、釩、鎢、銀、鈀、鋁、錳、鋅、銅、鎘、錫、鐵、鉛、銻、鎳、鈷、鉍、二氧化鈦、亞硒化鋅、氮化鎵、砷化鎵、砷化銦、硫化鋅、硫化鎘、亞硒化鎘、氧化鋅、磷化鎵、氮化鈦、氧化鎂、氧化鎘、氧化鋁、二氧化硅、氮化硅、磷化銦、鋁摻雜氧化鋅、氧化銦錫、碳納米管、石墨烯中的任意一種或多種；所述親水性支撐體為尼龍微孔濾膜、樹脂、聚四氟乙烯、聚酯膜中的任意一種或多種的組合。

23、本發明中步驟(1)中，所述基底材料的優選為石墨烯、碳納米管和樹脂材料的結合。比如可以選擇市購或自行制備的碳紙等。

24、本發明中，基底材料的厚度優選為100um-300um。

25、本發明中，所述的掃描電子顯微鏡為場發射掃描電子顯微鏡、環境掃描電子顯微鏡、低溫掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、球差矯正透射電子顯微鏡中的一種，具體根據生物可以承受的真空度和脫水程度選擇合適的掃描電子顯微鏡。例如：針對緩步動物樣品，可以選擇場發射掃描電子顯微鏡和環境掃描電子顯微鏡。

26、本發明中步驟(2)中，所述溫度范圍為80-140k。例如90k、100k、110k、120k、130k、140k，以及以上數值之間的具體點值，出于簡明考慮和篇幅限制，本發明不再窮盡列舉所述范圍內包括的具體點值。

27、本發明中步驟(2)中，所述低溫范圍為生物樣品可以存活的溫度范圍且前驅體材料可以形成冰的形態；即所述低溫范圍為生物樣品可以存活的溫度范圍且在對應氣壓下的前驅體材料可以形成冰的形態。在滿足生物樣品可以存活的前提下，前驅體材料的結冰狀態優選為無定型冰。

28、本發明中步驟(2)中，作為優選，所述低溫范圍為120k-130k。

29、本發明中步驟(2)中降溫僅需對生物樣品進行降溫。為了對生物樣品起到保護作用、提高樣品整體的導電性和導熱性能，在實際操作中，將附著在基底材料上的生物樣品和基底一起放入掃描電子顯微鏡的腔室中的可移動樣品臺上。為了進一步減少電荷累積和增強降溫效率，優選碳導電膠、銅導電膠將基底材料粘貼到樣品臺表面。通過對樣品臺降溫達到降溫基底材料和生物樣品的目的。

30、本發明中步驟(2)中降溫速度和步驟(5)的升溫速度需要根據所選生物樣品的特性進行設置，保證生物樣品以合適的速度被冷凍和恢復，同時需考慮降溫升溫所需的時長和曝光所需時長的總和是否滿足生物在對應的掃描電子顯微鏡環境中的存活時長。這些均可通過預實驗來確定。比如對于緩步動物其降溫速度可以設置為前1.5小時降溫速度為1.3℃/min，隨后以0.5℃/min的速度降溫1h，最后以0.05℃/min的速度降溫至目標溫度，比如130k；對于緩步動物其升溫速度可以設置為1.5℃/min。

31、本發明中步驟(2)中在降溫方式上，可選擇利用液氮進行溫度傳遞或使用制冷芯片進行降溫。

32、本發明中步驟(2)中，降溫達到設置的最低溫度后，應至少保持十分鐘再進行下一步驟，保證生物樣品表面溫度均勻。

33、本發明中，冰刻方法采用的前驅體材料可以直接購買或自行制備，前驅體材料包括但不限于醚化合物、醇化合物、烴類化合物、醛化合物、酮化合物、羧基化合物中的任意一種或兩種及以上的組合。

34、進一步，所述前驅體材料包括但不限于如苯甲醚、苯乙醚、苯乙醇、正戊醇、苯甲酸、沒食子酸、辛烷、壬烷、十一烷、十四烷、苯甲烷、苯乙烷、苯乙烯、苯甲胺、苯甲醛、苯酚、苯胺、甲苯、乙苯、丁苯、二甲苯、三甲苯、對乙酰氨基酚、氯苯、氯甲苯、二氯苯、碘苯、溴苯、溴代苯乙烯、溴苯甲酸等有機物的任意一種或兩種及以上的組合。所述冰薄膜為前驅體材料冷凝后形成的固體薄膜。

35、本發明中，所述前驅體材料可以在低溫下凝華，在溫度均勻的凹凸不平的生物樣品表面形成均勻的冰薄膜，此處冰的形態優選為無定型。冰薄膜會在后續曝光過程中形成交聯結構，同時冰薄膜的存在削弱了電子束輻射對生物樣品的造成的危害，起到了一定的保護作用。

36、本發明中，冰薄膜的厚度與電子束曝光參數相互約束，可以由需要的圖案厚度確定電子束曝光參數，也可以由已知的電子束曝光參數確定最小厚度。

37、本發明中，所述冰薄膜的厚度大于等于對應電壓的電子在冰薄膜中的最大穿透深度的90％以最大程度保護樣品免受電子輻射損傷。例如：若選擇1kev的電壓進行圖案曝光，冰層厚度應設置為大于等于38nm；若選擇2kev的電壓進行圖案曝光，冰層厚度應設置為大于等于115nm；若選擇3kev的電壓進行圖案曝光，冰層厚度應設置為大于等于230nm，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉其余電壓值對應的冰層厚度范圍。具體厚度設置可以根據生物樣品的電子輻射耐受度進行調整。

38、本發明中，所述冰薄膜的厚度為50nm-500nm。考慮到原位制作圖案的精度和對樣品的保護程度，優選為200nm-300nm。

39、本發明中，所述冰薄膜和電子束相互作用，冰薄膜材料中會發生化學鍵的斷裂和交聯，其中交聯程度大于斷裂程度，這些曝光過的區域在室溫下的狀態為固態，未曝光的區域在室溫下的狀態為氣態。冰薄膜和電子束發生反應后，冰薄膜的成分發生變化，碳元素的含量上升，這會削弱其毒性并增強其和碳基生物材料的相容性。

40、本發明中，所述步驟(4)按照定制的圖案對步驟(3)中的冰薄膜進行曝光，根據冰層厚度和圖案的灰度選擇不同的電壓和劑量進行曝光，得到表面帶有定制圖案結構的生物樣品。具體步驟包括：將定制圖案轉化為灰度圖，再將該灰度圖的信息轉化為計算機可讀代碼，根據對應前驅體冰薄膜在對應電壓下的曝光劑量和厚度的關系曲線圖定制曝光參數，根據圖案信息進行曝光。

41、本發明中，所述步驟(4)中，電子束能量范圍在1kev-30kev。例如1kev、2kev、3kev、4kev、5kev、10kev、15kev、20kev、25kev、30kev，以及以上數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

42、本發明中，所述步驟(4)中，根據生物樣品的電子輻射耐受度、冰薄膜對電子的能見度、冰層厚度。作為優選，電子束能量為低于5kev，具體的，電子束能量優選為1kev-5kev。

43、本發明中，所述步驟(4)中，所述的電子束曝光所需的面劑量為0.1mc/cm2?-50mc/cm2。例如0.1mc/cm2、0.2mc/cm2、0.3mc/cm2、0.4mc/cm2、0.5mc/cm2、1mc/cm2、2mc/cm2、3mc/cm2、4mc/cm2、5mc/cm2、10mc/cm2、20mc/cm2、30mc/cm2、40mc/cm2、50mc/cm2，以及以上數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

44、本發明中，所述步驟(4)中，根據優選的最大電子束能量和前驅體的曝光對比度曲線的對應飽和劑量將劑量范圍優選為1mc/cm2-10mc/cm2。

45、本發明中，所述電子束曝光時間、駐留時間，可以根據實際圖案要求確定。具體可借助計算機根據加工圖案的形狀計算得出。

46、步驟(4)中需要根據生物樣品的電子輻射耐受度和冰層厚度選擇電壓進行原位觀察，根據生物樣品的電子輻射耐受度和冰層厚度權衡選擇合適的電子束電壓和劑量進行曝光。

47、步驟(5)所述升溫去除冰薄膜的方式為升華去除。此過程不涉及固相到液相的轉變，氣相狀態的前驅體由泵抽離腔體。

48、步驟(6)所述適宜條件為使得該生物樣品可以自主移動的溫度、濕度、滲透壓、氣壓環境。例如：針對缺水隱生狀態的緩步動物，為其提供25℃的溫度、雙蒸水液體環境、常壓環境即可輔助其從隱生狀態轉換為活躍狀態。

49、作為優選，所述生物樣品為緩步動物門內的物種；所述強抗逆性狀態為緩步動物在缺水隱生的狀態；所述基底材料為石墨烯、碳納米管和樹脂材料的結合；所述低溫范圍為120k-130k；所述冰刻方法采用的電子束曝光所需的面劑量為0.1mc/cm2-10mc/cm2；電子束能量為1kev-5kev電壓對應的能量。

50、本發明提供的一種用于活體生物表面的微納加工方法，是一種工藝步驟簡單、可原位加工、分辨率高、生物相容性好的新型的微納加工方法。

51、本發明提供的微納加工方法，解決了現有微納加工方式不能直接在生物樣品上原位加工微納圖案的問題。具有工藝步驟簡單、可原位加工、精度較高、生物相容性好的優點，具有良好的應用前景，可能會促進在微納尺度上利用光、電、熱、磁場等多種物理手段對生物進行精準高效地影響、檢測和操控。