專利名稱：一種甘藍種子遺傳純度的快速鑒定方法
技術領域：
本發明涉及一種甘藍種子遺傳純度的快速鑒定方法，利用ISSR和SSR分子標記技術進行甘藍品種新夏50種子遺傳純度的檢測，屬于生物技術領域。
背景技術：
蔬菜雜種制種過程中，母本系自交的種子常混雜于F1中，嚴重影響種子的質量和純度。目前甘藍雜交種子主要是利用自交不親和系或雄性不育系制種，但是由于自交不親和性本身的缺陷以及雄性不育的微粉問題常常會導致母本自交產生假雜種(Crockett，P.A.，Bhalla，P.L.，Lee，C.K.，Singh，M.B..RAPD analysis of seed purity in a commerical hybrid cabbage(Brassica oleracea var.capitata)cultivar.Genome 2000，43，317-321.)，這將給育種工作者、生產銷售者及購買者帶來不必要的損失。因此，在雜種種子銷售用于生產之前，對雜種一代種子的遺傳純度進行準確鑒定是極其重要的。
對甘藍品種的純度檢測目前主要有田間形態學鑒定、同工酶鑒定，但田間形態學鑒定需要播種育苗，移栽入大田中，然后對形態特征進行觀察，耗時長，工作量大，受季節影響，費用高。且有時由于甘藍假雜種與真雜種之間形態學的差異表現不是很明顯，在苗期及成株期不容易鑒別，尤其當親本之間遺傳基礎很近時，更加不易鑒別。同工酶分析易受到環境和所取材料部位的影響，且對于一些親本遺傳差異較小的雜交品種，同工酶有時難以進行純度檢測與品種鑒定，準確度不高(柳李旺，侯喜林，龔義勤，張玉明，王開榮，鄭軍飛.分子標記技術在蔬菜作物品種鑒定與純度檢測中的作用.分子植物育種，2004，2(4)563～568.)。基于PCR技術的ISSR和SSR分子標記技術經體系優化和操作程序優化，穩定性好，且成本較低，準確可靠，簡便快速的優點，成為甘藍品種種子純度鑒定的首選技術之一。

發明內容
技術問題本發明的目的是提出甘藍品種‘新夏50’種子遺傳純度的快速鑒定方法，篩選出能夠在一代雜種中產生具有父母本特異標記條帶且不受環境影響的分子標記，用于鑒定甘藍商品種子的遺傳純度，可以大大提高純度鑒定的效率，從而為其種子純度的快速鑒定建立起高效準確的質量控制方法。
技術方案甘藍品種‘新夏50’種子純度的快速鑒定方法，包括以下步驟(1)提取甘藍新夏50幼苗基因組DNA；(2)采用任一種特征性引物ISSR引物NAUISR1034AGAGAGAGAGAGAGAGAA或SSR引物組合NAUSSR1011正引物GCAAACGATTTGTTTACCCGNAUSSR1011反引物CGTGTAGGGTGATCTAGATGGG
以甘藍‘新夏50’基因組DNA為模板；進行PCR擴增；(3)將擴增后的DNA片段，分別進行瓊脂糖和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；(4)只有同時具有親本特異條帶的單株才為真正的雜交種，缺少其中的任意一個條帶即被記為假雜種，對電泳結果進行分析，計算其種子純度，其中ISSR引物NAUISR1034產生大小為600 bp的母本特異標記NAUISR1034600，產生大小為1900 bp的父本特異標記NAUISR10341900；SSR引物NAUSSR1011產生大小為210bp的母本特異標記NAUSSR1011210，產生大小為260bp的父本特異標記NAUSSR1011260。
上述PCR擴增程序為ISSR-PCR反應體系含20ng基因組DNA，2.5mmol·L-1MgCl2，0.156mmol·L-1dNTPs，0.5umol·L-1ISSR引物NAUISR1034，0.64U Taq DNA聚合酶。PCR擴增程序94℃3min，94℃30S，55℃1min，72℃1.5min，35個循環，72℃10min延伸，4℃保存；SSR-PCR反應體系含20ng基因組DNA，2.0mmol·L-1MgCl2，0.2mmol·L-1dNTPs，0.5umol·L-1正引物和0.5umol·L-1反引物，0.5U TaqDNA聚合酶；PCR擴增程序95℃2min，94℃40S，60℃45S，72℃1min，32個循環，72℃7min延伸，4℃保存。
不同分子量與序列差異的DNA片段在電泳圖譜上分布于不同的位置，通過比較和分析DNA片段序列差異形成的多態性擴增片段及電泳圖譜的位置差異，進行對甘藍‘新夏50’雜種遺傳純度的鑒定。有益效果本發明的檢測方法，具有準確性高，不受被測樣品環境的影響，成本低，且可在整個生長季節都可檢測等優點。能夠在1～2周內準確地鑒定出種子遺傳純度。


圖1是甘藍‘新夏50’及其親本的DNA片段引物NAUISR1034的ISSR電泳圖譜；圖2是甘藍‘新夏50’及其親本的DNA片段引物NAUSSR1011的SSR電泳圖譜。
1母本；2父本；3雜種；M是用于糾正實驗偏差的標準分子量。
具體實施例方式
首先從DNA提取、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳檢測等環節對現有ISSR和SSR技術進行優化，建立了一套快速準確的適于甘藍雜種遺傳純度檢測的ISSR和SSR操作程序如下(1)DNA提取參考Liu，L.W.，W.Z.Guo，X.F.Zhu，and T.Z.Zhang.Inheritance and fine mapping of fertilityrestoration for cytoplasmic male sterility in Gossypium hirsutum L.Theor.Appl.Gene.2003，106461-469.所述CTAB法并加以改進。在甘藍‘新夏50’兩葉一心時取幼嫩葉片約0.2g，經液氮研磨，加入500μlCTAB裂解液(2％CTAB，2M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HCl(pH＝8.0)與0.2％的β-巰基乙醇)轉入1.5ml離心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷卻，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合物后輕輕搖晃，將乳狀物離心12000r/min，8～10min，上清液用氯仿/異戊醇(24∶1)抽提1～2次，加入預冷異丙醇后4℃冰箱靜置3小時以上，收集絮狀DNA用70％乙醇洗滌，干燥后溶于TE中備用。利用紫外分光度計進行DNA純度分析和定量檢測。
(2)標記分析ISSR反應體系含20ng基因組DNA，2.5mmol·L-1MgCl2，0.156mmol·L-1dNTPs，0.5umol·L-1引物NAUISR1034，0.64U Taq DNA聚合酶。在PTC-100熱循環儀上進行PCR擴增，擴增程序為94℃3min，94℃30S，55℃1min，72℃1.5min，35個循環，72℃10min延伸，4℃保存。SSR反應體系含20ng基因組DNA，2.0mmol·L-1MgCl2，0.2mmol·L-1dNTPs，0.5umol·L-1正引物和0.5umol·L-1反引物，0.5U Taq DNA聚合酶；在PTC-100熱循環儀上進行PCR擴增，擴增程序為95℃2min，94℃40S，60℃45S，72℃1min，32個循環，72℃7min延伸，4℃保存。
(3)擴增產物檢測ISSR-PCR擴增產物采用含有溴化乙錠(EB)的1.2％瓊脂糖凝膠電泳。采用1×TAE電泳緩沖液(1L中含有0.242g Tris，0.057ml冰醋酸，0.2ml 0.25mol/L EDTA pH8.0)。擴增后的DNA樣品加入4ul 6×加樣緩沖液(含有0.25％溴酚藍、30％蔗糖)，混勻后用移液器加樣，在120V恒壓條件進行電泳0.8-1小時，以擴增的DNA條帶充分展開為止。
SSR-PCR擴增產物采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。25mL凝膠中含有Arc∶Bis(29∶1)6.65mL，5×TBE 5mL，TEMED 20uL，10％AP 0.3mL。PCR產物在6％的聚丙烯酰胺凝膠上分離。預電泳50-60V 30min；120V電泳2-2.2小時。凝膠采用0.5％冰醋酸，10％的乙醇固定12-20min；0.2％AgNO3溶液染色10-20min；蒸餾水洗滌兩次后于顯影液(1.5％NaOH，0.4％甲醛，0.002％Na2S2O3)顯影；最后放于0.75％Na2CO3保存。
(4)特征性引物的篩選適用于甘藍品種‘新夏50’種子遺傳純度鑒定的ISSR和SSR引物應具有以下兩個特征①要求引物本身多態性信息量要高，從而具有較強的鑒別假雜種的能力；②在甘藍雜交種及其雙親表現多態性，從而可以鑒別雜交種中最常見的自交苗。從72個ISSR引物和44對SSR引物中篩選出多態性高、帶型清晰、重復性好的ISSR引物50個和SSR引物16對，作為甘藍優良品種種子遺傳純度鑒定的核心引物；從核心引物中進一步篩選出在甘藍新夏50雜種圖譜中具有父本、母本特異條帶的特征性引物，并通過田間常規鑒定與室內鑒定比較，驗證引物可靠性，確定出可以應用于甘藍新夏50遺傳純度鑒定的特征引物2個NAUISR1034和NAUSSR1011，引物NAUISR1034產生母本標記NAUISR1034600，及父本標記NAUISR10341900(圖1)；引物NAUSSR1011產生母本標記NAUSSR1011210，及父本標記NAUSSR1011260(圖2)。
(5)雜種種子遺傳純度的判定2個特征引物均能在雜種中鑒定出父母本特異互補條帶，ISSR引物NAUISR1034產生大小為600bp的母本特異標記NAUISR1034600，及大小為1900bp的父本特異標記NAUISR10341900(圖1)；SSR引物NAUSSR1011產生大小為210 bp的母本特異標記NAUSSR1011210，及大小為260bp的父本特異標記NAUSSR1011260(圖2)。這1個ISSR標記和1個SSR標記在多次重復中表現穩定，可有效用于鑒定甘藍雜交種種子的純度。應用這2個特征引物分別對雜種幼苗中一定數量(100株以上)的單株進行遺傳純度的鑒定。只有能同時檢測到父母本特異標記的甘藍雜種單株才能視為真雜種，缺少其中任意一條帶即認為是假雜種。通過應用特征引物NAUISR1034和NAUSSR1011對雜種單株標記基因型進行分析，將兩特征引物檢測獲得的純度結果的平均值記為甘藍雜種種子的遺傳純度。ISSR和SSR分子標記技術方法簡便，經濟實用，適合用于甘藍的品種鑒定和種子純度檢測，并且利用復合標記分析可以更加準確地進行甘藍雜種種子的純度鑒定。
其中ISSR引物NAUISR1034，其含義為“NAU”代表“南京農業大學”；“ISR”代表ISSR引物，“1034”代表實驗室引物編號；SSR引物代號NAUSSR1011，其含義是“NAU”代表“南京農業大學”；“SSR”代表簡單重復序列標記引物，“1011”代表實驗室引物編號。
權利要求
1.甘藍品種‘新夏50’種子遺傳純度的鑒定方法，包括以下步驟(1)提取甘藍幼苗基因組DNA；(2)采用ISSR引物NAUISR1034AGAGAGAGAGAGAGAGAA和SSR引物NAUSSR1011正向引物GCAAACGATTTGTTTACCCGNAUSSR1011反向引物CGTGTAGGGTGATCTAGATGGG以甘藍基因組DNA為模板，進行PCR擴增；(3)將擴增后的DNA片段，分別進行瓊脂糖(ISSR擴增產物)和非變性聚丙烯酰胺凝膠(SSR擴增產物)電泳檢測；(4)對電泳結果進行分析，只有同時具有親本特異條帶的單株才為真正的雜交種，缺少其中的任意一個條帶即記為假雜種，計算其種子純度，其中ISSR引物NAUISR1034產生大小為600bp的母本特異標記NAUISR1034600，產生大小為1900bp的父本特異標記NAUISR10341900；SSR引物NAUSSR1011產生大小為210bp的母本特異標記NAUSSR1011210，產生大小為260bp的父本特異標記NAUSSR1011260。
2.根據權利要求1所述的甘藍品種‘新夏50’種子純度的鑒定方法，其特征在于，PCR擴增程序為ISSR-PCR反應體系含20ng基因組DNA，2.5mmol·L-1MgCl2，0.156mmol·L-1dNTPs，0.5μmol·、L-1ISSR引物NAUISR1034，0.64U Taq DNA聚合酶。PCR擴增程序94℃3min，94℃30S，55℃1min，72℃1.5min，35個循環，72℃10min延伸，4℃保存；SSR-PCR反應體系含20ng基因組DNA，2.0mmol·L-1MgCl2，0.2mmol·L-1dNTPs，0.5 μ mol·L-1正向引物和0.5μmol·L-1反向引物，0.5U Taq DNA聚合酶；PCR擴增程序95℃2min，94℃40S，60℃45S，72℃1min，32個循環，72℃7min延伸，4℃保存。
全文摘要
本發明公開了一種甘藍種子遺傳純度的快速鑒定方法，屬于生物技術領域。其步驟是提取甘藍基因組DNA，利用篩選出的特征引物NAUISR1034和NAUSSR1011進行PCR擴增，將擴增后的DNA片段分別進行瓊脂糖凝膠和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別電泳0.8－1和2－2.2小時后，拍攝電泳圖譜。通過比較和分析電泳圖譜中DNA片段序列差異形成的多態性擴增片段大小與位置差異，進行甘藍“新夏50”雜種遺傳純度的鑒定。本發明的檢測方法具有標記穩定，準確性高，不受被測樣品生長階段與環境影響，成本低，且可在整個生長季節都可進行等優點。
文檔編號G01N21/84GK101017152SQ20071002004
公開日2007年8月15日 申請日期2007年2月9日 優先權日2007年2月9日
發明者柳李旺, 劉廣, 龔義勤, 歸為民 申請人:南京農業大學