專利名稱：扶正化瘀植物藥中五味子原料指紋圖譜質量控制方法
技術領域：
本發明屬五味子原料質量控制方法領域，特別是涉及一種扶正化瘀植物藥中五味子原料指紋圖譜質量控制方法。
背景技術：
五味子(Fructus Schisandrae chinensis)為木蘭科(Magnoliaceae)五味子屬植物五味子[Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.]的干燥成熟果實。五味子又名烏梅子、山花椒、軟棗子，因其具有甘、酸、辛、苦、咸五味而得名，最早載于《神農本草經》，并被列為上品，《圖經本草》中也有記載。
《中國植物志》描述五味子為落葉木質藤本，除幼葉背面被柔毛及芽鱗具緣毛外余無毛。花多為單性，花單生或叢生葉腋，雄花花梗長5-25毫米，花被粉白色或粉紅色，6～9片；雄蕊長約2毫米，花藥長約1.5毫米，無花絲或外3枚雄蕊具極短花絲，藥隔凹入或稍凸出鈍尖頭，雄蕊5(6)枚，互相靠貼，直立排列于長約0.5毫米的柱狀花托的頂端，形成近倒卵圓形雄蕊群；雌花花梗長17-38毫米，花被片和雄花相似，雌蕊群橢圓形，長2-4毫米，離生心皮17～40。聚合果長1.5-8.5厘米，聚合果柄長1.5-6.5厘米；小漿果近球形或倒卵圓形，成熟時紅色。種子1～2，腎形，淡褐色有光澤。花期5～7月，果期7～10月。
五味子自然生長于海拔1700m以下的溝谷、山坡、林緣及溪旁灌木中。分布于東北、華北、內蒙古、寧夏及河南等地。在溫帶、暖溫帶或亞熱帶山地皆有分布。喜陰涼濕潤氣候，喜光照，耐寒，不耐水浸，需適度隱蔽，幼苗期尤忌烈日照射。以選疏松、肥沃、富含腐殖質的微酸性或中性壤土栽培為宜。適宜生長的氣候條件一般為年均氣溫0～14℃，年降雨量500～1000毫米，最冷月均溫-3℃～-22℃，最熱月均溫20℃～28℃。
五味子當前野生與人工栽培并存，主產于東北、河北、山西、陜西、寧夏、山東及內蒙古等省區。
五味子主要以果實入藥，《中國藥典》記載五味子藥材呈不規則的球形或扁球形，直徑5～8mm。表面紅色、紫紅色或暗紅色，皺縮，顯油潤，果肉柔軟，有的表面呈黑紅色或出現“白霜”。種子1～2，腎形，表面棕黃色，有光澤，種皮薄而脆。果肉氣微，味酸；種子破碎后，有香氣，味辛，微苦。
五味子以果實和種子入藥，有效成分為木脂素類化合物，還含有萜類、有機酸等化學成分。主要成分分述如下
a.木脂素類化合物目前，已從五味子屬植物中分離出40余種木脂素化合物單體，其中五味子中含有32種。在這40余種化合物中，已發現有明確藥理作用的有10種，五味子中有其中的7種，分別為五味子甲素(Schizandrin A)、五味子乙素(Schizandrin B)、五味子丙素(Schizandrin C)、五味子醇甲(Schizandrol A)、五味子醇乙(Schizandrol B)、五味子酯甲(Schisantherin A)和五味子酯乙(Schisantherin B)，均屬于木脂素成分中的聯苯環辛烯類。以及五味子酚、表-加巴辛、安五脂素、6-O-苯甲酰戈米辛O、戈米辛N、白芷酰基戈米辛H。
木脂素類中生理活性研究較多的是對肝臟有作用的成分。對五味子7種有效成分藥理研究和臨床證明，均有降低肝炎患者血清谷丙轉氨酶水平的作用，其中以五味子酯乙作用最強，其次為醇乙、丙素、乙素、甲素、酯甲和醇甲。五味子降酶機理主要是對肝細胞的保護作用，能促進損傷肝細胞的修復或抑制肝細胞病變，使細胞膜發生某種機能性改變，通透性降低，從而使漏到血漿中的轉氨酶減少，對轉氨酶的合成并無抑制作用。此外，還發現五味子木脂素成分具有抗氧化作用，以五味子乙素的抗氧化活性最強。
b.萜類化合物萜類化合物主要存在于五味子的揮發油中，五味子莖葉、果實和種子均含有豐富的揮發油。秦波等人從五味子的揮發油中鑒定出32個組分，主要是單萜類、含氧單萜類、倍半萜類和含氧倍半萜類，其中以倍半萜類物質最多。柯銘清報道五味子揮發油具鎮咳功效，其效力是可待因的75％c.其他成分五味子果實含有檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸等多種有機酸，有明顯的祛痰作用。此外，在五味子果實中還發現了甾醇，維生素C、E，樹脂，鞣質及鐵、錳、硅、磷等礦物質。北五味子干燥成熟果實中還含有葡萄糖等7種單糖、17種氨基酸及16種微量元素，具有抗衰老作用。
五味子的有效成分木脂素類化合物主要來源于五味子的果實和種子，傳統的提取方法有醇提取、氯仿提取和水提取等溶劑提取法。近幾年法多索溶劑系統提取，超臨界CO2提取技術以及微波輔助提取方法。劉本等[2]進行了以法多索溶劑提取五味子中五味子甲素的研究，并與10％甲醇調節的超臨界CO2的提取率進行比較。與10％甲醇調節的超臨界CO2的提取率相比較，法多索溶劑可得到約94％的提取回收率。周慶華[3]，楊蘇蓓[4]，向智敏等[5]皆考察了超臨界CO2提取方法對提取效率，并對提取條件進行了優化。黃惠華等[6]研究了五味子果實中五味子醇甲的微波輔助提取方法，考察了各種提取條件，得到了最佳的微波輔助提取工藝。其他提取方法如滲漉法，超聲法也有相關報道。
五味子木脂素類化學成分的分離檢測方法主要有分光光度法[7]~[11]，高效液相色譜法[12]~[22]，薄層色譜法[23]~[24]，其中應用最多的分析方法是高效液相色譜法。另外有文獻[25]報道了應用GC-MS法以及CEC法對五味子木脂素類化學成分的分離檢測。在中國藥典(2005)規定了五味子醇甲的HPLC的測定方法。
關于五味子指紋圖譜研究，陳洪軒等人[26]，施佳平[27]，馮雪松等人[28]，殷放宙等人[29]皆對五味子醇溶性成分的指紋圖譜進行了研究，并以木脂素類成分五味子醇甲，五味子甲素，五味子乙素為對照品。而李延利等人[30]，馮偉等人[31]對五味子水溶性成分的指紋圖譜進行了研究。范卓文等人[32]則考察了五味子藥材不同提取方法的指紋圖譜，五味子藥材分別經氯仿，甲醇，乙醇，50％乙醇，水提取以及CO2超臨界萃取。
目前關于五味子的質量控制主要是單個或某幾個成分為主，不能反應藥材的整體特征，指紋圖譜提供了這樣一個方法，將常規的單一指標成分或活性成分為質量控制的指標提升到一個新的階段，用色譜的指紋特征，和通過指紋圖譜得到的量化參數，更有效地鑒別真偽，控制質量。
關于五味子藥材的指紋圖譜也有一些研究報道，但都不是很完善，沒有應用于生產中藥材的質量控制。同時根據五味子現有的化學成分和藥理臨床研究資料，以及扶正化瘀藥理研究以有效成分的研究成果，確定需要表征的活性部位和主要活性成分為木脂素類，因此要求能全面地體現五味子藥材中木脂素類成分的整體特征。采用液質聯用技術對指紋圖譜中的主要色譜峰進行了歸屬，保證了五味子中有效成分在指紋圖譜中被充分體現。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種扶正化瘀植物藥制劑中五味子原料指紋圖譜質量控制方法，該方法能全面控制原料藥材的質量，確保產品的質量穩定。
本發明的技術方案如下一種扶正化瘀植物藥中五味子原料指紋圖譜質量控制方法，包括下列步驟(1)提取五味子供試品稱取0.5g五味子藥材粉末，加入20ml 80％甲醇，稱定重量，超聲提取20-50min，補足所失重量，經0.23-0.45μm微孔濾膜過濾，得供試品溶液；(2)梯度洗脫流動相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，水和乙腈為流動相進行洗脫流動相，色譜柱為Eclipse；流動相A相為水，B相為乙腈；梯度洗脫0-40min，40-80％B；流速0.8-1.2ml/min；檢測波長210-280nm；柱溫20-40℃；進樣量10-20ul。
梯度洗脫條件為

(3)標準指紋圖譜的建立選取10批不同批號的樣品，進行高效液相色譜指紋圖譜分析。對合適樣品的HPLC指紋圖譜中所有峰進行比較，確定了10個共有峰，并按出峰時間先后次序進行編號(圖1)。
在共有峰里選取了7個特征峰，分別為1號峰五味子醇甲、3號峰五味子醇乙、4號峰戈米辛N/異構體、6號峰五味子甲素、7號峰、和8號峰戈米辛N/異構體、9號峰五味子乙素。其中五味子乙素是一個重要活性成分。
根據LC-MS-MS的鑒定結果，五味子的高效液相色譜指紋圖譜表達了木脂素的分布特性。選取含量較高的五味子醇甲作為指標成分峰。
經過對遼寧、黑龍江、吉林多個產地十批樣品的五味子藥材指紋圖譜的研究，按照以下原則選取一批五味子藥材的指紋圖譜作為對照指紋圖譜(圖1)結合藥效實驗情況，優先考慮確定療效的藥材的指紋圖譜。將指紋圖譜和定量測定結果進行對照比較，剔除特別不合理的樣品，優先考慮含量在平均值附近的樣品的指紋圖譜。結合指紋圖譜和定量結果，選取特征峰分離較好，峰的保留時間和峰高適宜、峰型(峰的形狀和峰高比例)較典型的指紋圖譜。優先選取基線平穩、信噪比好的指紋圖譜；(4)指紋圖譜的質量控制A.樣品真偽的鑒別根據公式計算十批藥材指紋圖譜中各特征峰的相對保留時間RRT(RRT＝特征峰的保留時間/指標峰的保留時間)，結合兩個實驗室的驗證結果，確定了各特征峰的相對保留時間和范圍(表1)。
6個指紋圖譜鑒別峰相對保留時間五味子醇甲1.00、五味子醇乙1.25、五味子素N/異構體1.63、五味子甲素1.88、五味子素N/異構體3.18、五味子乙素3.27。
表1 五味子藥材HPLC指紋圖譜鑒別峰相對保留時間及范圍


根據實驗條件對待測樣品進行測定，得出樣品的HPLC色譜圖，計算各特征峰的相對保留時間，并與所列對照指紋圖譜和相對保留時間表進行比較。如各特征峰均存在，而且相對保留時間(RRT)吻合，則可確定為該原料。
B.樣品質量評價采用中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件(國家藥典委員會)，將樣品的HPLC指紋圖譜與對照指紋圖譜(或對照品共有模式指紋圖譜)進行比較。以10個共有峰計算得到的相似度應不得小于0.9。
表2 特征峰的相對保留時間與相對峰面積

*RRT(相對保留時間)＝特征峰的保留時間/指標峰的保留時間*RPA(相對峰面積)＝特征峰的峰面積/指標峰的峰面積

所述步驟2色譜柱為Eclipse(150×4.6mm，5μm)；流速1.0ml/min；檢測波長254nm；柱溫35℃；進樣量20ul。
所述步驟4在指紋圖譜測定條件確定后，通過對至少三批樣品進行測定，計算相關參數，并在此基礎上提出高效液相色譜系統的適用參數條件。即五味子醇甲對照品溶液(100μg/ml)的色譜峰面積重現性(RSD)不高于3％，保留時間重現性(RSD)不高于2％；五味子醇甲和相鄰峰的分離度不小于1.0；色譜柱柱效以五味子醇甲計不少于30,000塊理論塔板數。
本發明的另一技術方案如下一種扶正化瘀植物藥中五味子原料的種植采收方法，包括下列步驟(1)五味子藥材的規范化種植東北五味子翌年春季(4月上旬)，取出放在室溫15-20℃左右的室中催芽，幾天后種子裂口，胚芽剛剛露出，即可播種。起苗時要從苗床的一端開始，用尖鍬沿要系層下面將苗起出。一般在4月下旬至5月上旬移栽；春節為防春旱，一般一周噴灌一次(視土壤熵情而定)。追肥原則是以腐熟的農家肥為主，輔以化肥。五味子枝條春、夏、秋三季均可修剪。五味子是藤本植物，不能獨立生長，移植后第二年即應搭架。
(2)五味子藥材的規范化采收五味子秋季收獲，在秋季(一般在每年9月初至霜降前后)果實變軟而富有彈性，外觀呈紅色或紫紅色時，適時采收。采收在晴天或陰天，用枝剪沿果穗根部剪下，放入干凈的筐中。曬干或陰干。若收獲量大或遇雨天可用微火烘，采收回的果穗放在果棧上，清除枝葉、果梗及其他雜質。將果棧放入烘中的架子上，加溫至50℃左右，烘至半干左右時降溫至30℃左右，當達到八成干時(水分含量25％左右)，將五味子挪到室外曬至全干。
本發明的有益效果如下1、五味子藥材的指紋圖譜能全面地體現五味子藥材中木脂素類成分的整體特征。采用液質聯用技術對指紋圖譜中的主要色譜峰進行了歸屬，保證了五味子中有效成分在指紋圖譜中被充分體現。
2、考察了供試品溶液的穩定性，結果表明，在室溫下，24小時之內，五味子供試品溶液保持穩定。同時考察公司貯藏的樣品在1年內的穩定性，發現相似度大于0.9。精密度和重復性試驗，都表明相似度在0.99以上。
3、將指紋圖譜與藥材GAP基地的建設結合起來，在藥材生產中就開始控制藥材的質量，這樣保證了指紋圖譜的實施，指導GAP基地的建設，并真正運用于藥材質量控制。
4、經過對東北五味子藥材基地十批五味子藥材的指紋圖譜相似度進行計算，發現藥材相似度大于0.9-1.0之間。說明建立的五味子指紋圖譜質控方法，靈敏度高，重復性好，專屬性強，操作簡便，方法可靠，可以五味子質量進行科學，有效的評價證實能夠運用于實際生產中質量控制，滿足藥材鑒別和質量控制的需求。
5.藥材質量的穩定，同時也保證的扶正化瘀制劑質量的穩定可控。


圖1典型的五味子高效液相色譜指紋圖譜圖2五味子樣品的指紋圖譜
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
實施例1五味子藥材中國東北(10批)儀器

稱取0.5g五味子藥材粉末，加入20ml 80％甲醇，稱定重量，超聲提取50min，補足所失重量，經0.45μm微孔濾膜過濾，得供試品溶液。色譜條件柱溫35℃，檢測波長254nm，進樣量20μl，色譜柱Eclipse(150×4.6mm，5μm)，洗脫條件(見表1)表1 洗脫條件

在指紋圖譜測定條件確定后，通過對至少三批樣品進行測定，計算相關參數，并在此基礎上提出高效液相色譜系統的適用參數條件。即五味子醇甲對照品溶液(100μg/ml)的色譜峰面積重現性(RSD)不高于3％，保留時間重現性(RSD)不高于2％；五味子醇甲和相鄰峰的分離度不小于1.0；色譜柱柱效以五味子醇甲計不少于15,000塊理論塔板數。
通過對十批五味子藥材的相似度進行計算，發現藥材相似度大于0.9-1.0之間。說明建立的五味子指紋圖譜質控方法，操作簡便，方法可靠，證實能夠運用于實際生產中質量控制，滿足藥材鑒別和質量控制的需求。
一批五味子藥材樣品指紋圖譜圖見圖2，特征峰的相對保留時間與相對峰面積見表2。
權利要求
1.一種扶正化瘀植物藥中五味子原料指紋圖譜質量控制方法，包括下列步驟(1)提取五味子稱取0.5g五味子藥材粉末，加入20ml 80％甲醇，稱定重量，超聲提取20-50min，補足所失重量，經0.23-0.45μm微孔濾膜過濾，得供試品溶液；(2)梯度洗脫流動相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，水和乙腈為流動相進行梯度洗脫，色譜柱為Eclipse；流動相A相為水，B相為乙腈；梯度洗脫0-40min，60-20％A，40-80％B；流速0.8-1.2ml/min；檢測波長210-280nm；柱溫20-40℃；進樣量10-20ul；(3)標準指紋圖譜的建立確定了10個共有峰，選取了7個特征峰，為1號峰五味子醇甲、3號峰五味子醇乙、4號峰戈米辛N/異構體、6號峰五味子甲素、7號峰、和8號峰戈米辛N/異構體、9號峰五味子乙素，其中五味子乙素是一個重要活性成分；選取含量較高的五味子醇甲作為指標成分峰；優先考慮確定療效的藥材的指紋圖譜。優先考慮含量在平均值附近的樣品的指紋圖譜。結合指紋圖譜和定量結果，選取特征峰分離較好，峰的保留時間和峰高適宜、峰型較典型的指紋圖譜。優先選取基線平穩、信噪比好的指紋圖譜；(4)指紋圖譜的質量控制a.樣品真偽的鑒別
6個指紋圖譜鑒別峰相對保留時間五味子醇甲1.00、五味子醇乙1.25、戈米辛N/異構體1.63、五味子甲素1.88、戈米辛N/異構體3.18、五味子乙素3.27；b.樣品質量評價將樣品的HPLC指紋圖譜與對照指紋圖譜比較。以共有峰計算得到的相似度應不得小于0.9。
2.根據權利要求1所述的扶正化瘀植物藥中五味子原料指紋圖譜質量控制方法，其特征在于所述步驟2色譜柱為Eclipse(150×4.6mm，5μm)；流速1.0ml/min；檢測波長254nm；柱溫35℃；進樣量10-20ul。
3.根據權利要求1所述的扶正化瘀植物藥中五味子原料指紋圖譜質量控制方法，其特征在于所述步驟4在指紋圖譜測定條件確定后，通過對至少三批樣品進行測定，五味子醇甲對照品溶液(100μg/ml)的色譜峰面積重現性(RSD)不高于3％，保留時間重現性(RSD)不高于2％；五味子醇甲和相鄰峰的分離度不小于1.0；色譜柱柱效以五味子醇甲計不少于30,000塊理論塔板數。
4.根據權利要求1所述的扶正化瘀植物藥中五味子原料指紋圖譜質量控制方法，其特征在于所述的五味子種植采收方法，包括下列步驟(1)五味子藥材的規范化種植東北五味子翌年春季4月上旬，取出放在室溫15-20℃左右的室中催芽，種子裂口，胚芽露出即可播種，起苗時要從苗床的一端開始，用尖鍬沿要系層下面將苗起出，在4月下旬至5月上旬移栽；春季一周噴灌一次，農家肥為主輔以化肥。枝條春、夏、秋三季均修剪，移植后第二年應搭架；(2)五味子藥材的規范化采收五味子秋季采收在晴天或陰天，用枝剪沿果穗根部剪下，曬干或陰干；采收回的果穗放在果棧上，放入烘中的架子上，加溫至50℃烘至半干左右時降溫至30℃，達水分含量25％時室外曬至全干。
全文摘要
本發明涉及扶正化瘀植物藥中五味子原料指紋圖譜質量控制方法，包括(1)取0.5g五味子，超聲提取50min過濾；(2)梯度洗脫流動相色譜柱為Eclipse；0－40min，60－20％A，40－80％B；流速0.8－1.2ml/min；波長210－280nm，柱溫20－40℃；進樣量10－20ul；(3)標準指紋圖譜的建立1號峰五味子醇甲、3號峰五味子醇乙、4號峰戈米辛N/異構體、6號峰五味子甲素、7號峰和8號峰戈米辛N/異構體、9號峰五味子乙素；(4)指紋圖譜的質量控制指紋圖譜鑒別峰相對保留時間五味子醇甲1.00、五味子醇乙1.25、戈米辛N/異構體1.63、五味子甲素1.88、戈米辛N/異構體3.18、五味子乙素3.27；(5)五味子種植采收方法；本發明能全面控制原料的質量，確保產品的質量穩定。
文檔編號G01N30/00GK101040909SQ20071004033
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月29日 優先權日2007年4月29日
發明者胡坪, 潘一峰 申請人:上海現代中醫藥技術發展有限公司