專利名稱：用膠體金免疫層析試驗檢測伏馬毒素的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物檢測工程技術領域的方法，具體是一種用膠體金免疫層析試驗檢測 伏馬毒素的方法。
背景技術：
伏馬毒素(Fumonisins)是串珠鐮刀菌在一定濕度和溫度條件下繁殖所產生的次級代謝 產物，在全世界范圍內分布廣泛。1988年，Gelderblom等首次從串珠鐮刀菌培養液中分離出 伏馬毒素。伏馬毒素能夠對玉米及其制品造成污染，而且在以谷物為原料的一些產品中如面 條、啤酒、調味品，甚至在蘆筍中也檢測到了伏馬毒素。據報道，伏馬毒素與馬腦白質軟化 癥，豬的肺水腫癥候群，大鼠肝癌等疾病有關。除上述疾病外，在南非的特蘭斯凱地區和中 國林縣地區研究發現，食用伏馬毒素污染的玉米制品與人類食道癌相關。串珠鐮刀菌產生的 毒素已經被國際癌癥研究會(International Agency for Research on Cancer, IARC)劃 分到2B類一可能的人類致癌物。加入WT0之后，農產品及相關食品的國際貿易量日益增加， 隨之對進出口產品的生物安全性的要求也越來越高，為了保證這類產品的順利上市和食用者 的健康，出入境檢疫、海關、生產企業、監督部門等部門迫切需要一種特異、快速、簡便的 伏馬毒素檢測方法。
膠體金免疫層析試驗的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的膠體金標記。固定在 NC膜上的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，膠體金標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性， 又有示蹤的功能。在測定時，通常受檢樣品(測定其中的抗體或抗原)通過毛細作用向前移 行與金標墊上的抗原或抗體起反應。繼續向前移行，與固定在T線(檢測線)抗原或抗體結合 形成免疫復合物被截留而顯色，約為一條寬為lmm的棕紅色條帶，多余的金標抗體繼續向前 移動，與固定在C線(質控線)的二抗結合被截留而顯色，約為一條寬為lmm的棕紅色條帶。 此時T線形成金標復合物與標本中受檢物質的量呈一定的比例，故可根據T線呈現的顏色深淺 進行定性或半定量分析。
關于伏馬毒素的檢測國內外已建立了多種方法。目前檢測伏馬毒素的方法主要為高效液 相色譜法(HPLC)，在全球范圍內的玉米及其制品的調査中，90%以上的實驗室用的都是 HPLC法。由于伏馬毒素本身既沒有特異的紫外吸收基團，同時也沒有熒光特性，但在一定條件下伏馬毒素可同某些物質反應形成具有熒光的衍生物，因此熒光衍生劑和衍生方法的選擇 與HPLC檢測伏馬毒素的準確度和靈敏性有密切關系。此外該法需要對檢測樣品進行嚴格的預 處理，還需要高效液相色譜儀等貴重儀器，同時要求有專業的操作人員，不利于現場常規檢 測使用。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種用膠體金免疫層析試驗快速檢測伏馬 毒素的方法。本發明的方法檢測特異性強，準確率高；檢測速度快，所需時間短，只需5 IO分鐘。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括具體步驟如下
步驟一，將伏馬毒素半抗原通過戊二醛法分別與KLH (血藍蛋白)和0VA (卵清白蛋白) 偶聯；
步驟二，利用步驟一所得伏馬毒素-KLH偶聯物，采用常規方法制備抗伏馬毒素的單克隆 抗體；
步驟三，用檸檬酸三鈉還原法制備40nm的膠體金，用該膠體金標記經過透析除鹽處理的 抗伏馬毒素的單克隆抗體；
步驟四，將步驟三得到的單克隆抗體蛋白噴涂到金標墊上，將伏馬毒素-OVA偶聯物噴涂 到T線，兔抗鼠的單克隆抗體噴涂到C線，組裝成試紙條，干燥；
步驟五，將待測樣品用甲醇提取，離心，取上清，將上清滴入試紙條的樣本槽中，獲取 T線和C線的顯色，鑒定，得到結果。
步驟三中，所述膠體金的制備方法具體為將100ml的0.005。/。HAuCl4溶液加熱至沸騰， 之后加入O. 5 lml的P/。檸檬酸三鈉水溶液，煮沸7 10min，最后加三蒸水至100ml，制備得 到40nm的膠體金溶液；其中，百分數為重量體積百分數。
步驟三中，所述標記具體為在攪拌的條件下，向膠體金溶液中加入單克隆抗體，使其 終濃度達到40ug/mL， 25。C下孵育5min，用O. lmol/L K2C03調節膠體金溶液的pH為9. 0，然后 加入10。/。BSA至BSA的終濃度為0. 1%， 10000rpm離心20min，棄上清，再用O. OlmM pH為9. 0的 Tris緩沖液恢復，重復1次，之后將沉淀重懸于原體積的l/10的0.01mM pH為9. O的Tris緩沖 液中，最后加入10。/。BSA至BSA的終濃度為0. 1%， 4。C儲存備用；其中，百分數為重量體積百分 數。
步驟四中，所述干燥為37"C烘箱干燥。 步驟五中，所述甲醇為體積分數為80%的甲醇。步驟五中，所述離心為2500g離心15分鐘。
步驟五中，所述鑒定具體為在C線上出現棕紅色條帶，待測樣品中含伏馬毒素；在T線 和C線上均出現棕紅色條帶，待測樣品中不含伏馬毒素。
本發明的方法采用膠體金免疫層析試驗競爭結合法，以伏馬毒素的偶聯物伏馬毒素-OVA (抗原)固定T線，膠體金標記抗伏馬毒素的單克隆抗體附著于金標墊，兔抗鼠的多克隆 抗體固定C線，將樣品液滴入樣本槽，根據T線的顯色與否來判定結果，C線的顯色與否來判 定試紙條的本身質量。
與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果本發明檢測對象單一且針對性強，準確 率高；檢測速度快，所需時間短，只需5 10分鐘、不需經培訓的專業人員就可使用本發明 方法來檢測，便于基層推廣和運用；能快速、簡便、及時地檢測伏馬毒素。


圖l為實施例試紙條的結構圖； 圖2為實施例試紙條的鑒定結果其中a實施例試紙條的陽性結果圖；b為實施例試紙條的陰性結果圖。
具體實施例方式
以下對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施， 給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未 注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。
伏馬毒素具有多種衍生物，伏馬毒素B工(FBD在天然食品中的含量最多，所以實施例 以FB!為實例。本實例首先將FB!連接到OVA或KLH上獲得具有免疫原性的完全抗原，并通過透 析及超濾離心純化該抗原；將該KLH與FB!偶聯的抗原FBrKLH作為免疫原免疫Balb/C小鼠制 備單克隆抗體，并用OVA與FB^禹聯的抗原FBrOVA作為包被抗原采用間接酶聯免疫吸附實驗 測定抗FBi抗體效價；純化單克隆抗體；用l。/。(W/V)的檸檬酸三鈉還原法制備40nm的膠體金， 并標記純化的單克隆抗體蛋白；按金標單克隆抗體、FB廣OVA偶聯抗原、兔抗鼠多克隆抗體 噴涂金標墊、檢測線(T線)、質控線(C線)，然后組裝成試紙條，置37'C烘箱烘干，存放 -201:冰箱保存備用；檢測時，待試紙條于密封包裝中恢復至室溫后，將測試端插入樣品液 中，5 10分鐘觀察結果。實施例
1、 抗原的制備
① 免疫抗原的制備將lmlKLH (10mg/ml)放入透析袋，置于200ml含0. 2% (V/V)(戊 二醛(GA) ) PBS溶液中4。C透析16h，然后轉入PBS中透析8h除去未反應的GA。向KLH透析物 中加入lmgFBh 4"C反應16h。加入10mgTris，反應2h，封閉未反應的蛋白位點。最后用PBS 透析2 3d， -2(TC保存。
② 包被抗原的制備將2. 5mg卵清白蛋白(OVA)溶于O. lml0.01MPB緩沖液中，加入 10ul50% (V/V) GA，室溫攪拌過夜。4"C條件下用PBS透析過夜，除去多余GA。 0. 5mg伏馬毒 素(FBD溶于O. 2ml25% (V/V)乙醇，將其加入到激活的OVA透析物(約O. 15ml)中，加入 0. lmllM碳酸緩沖液(pH9.5) ， 4。C攪拌過夜。加入O. 05mllM賴氨酸(pH7) ， 4。C反應3h。 最后用PBS透析72h， 2次換液，-2(TC保存。
2、 單克隆抗體的制備
將FBrKLH完全抗原凍干粉溶解于PBS中，測定完全抗原中載體蛋白的濃度。將抗原與等 量的弗氏完全佐劑充分乳化，皮下注射免疫6周齡Balb/C小鼠，每只O. lml; 二免兩周后， 改用弗氏不完全佐劑，用同樣的方法和劑量，進行免疫；三免，操作同二免。免疫5天后眼 底靜脈采血測效價，效價達到1:10000以上時加強免疫腹腔注射不加佐劑的抗原O. lml，三 天后處死小鼠，取其脾臟，與骨髓瘤細胞融合。用間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞。通 過小鼠腹腔注射雜交瘤細胞來大量制備小鼠腹水，腹水經過過濾、離心初步純化后，采用辛 酸法和親和層析法純化腹水。
3、 膠體金的制備
先將100ml的0. 005% (W/V) HAuCU溶液加熱至沸騰，迅速加入O. 5 lml的1%檸檬酸三 鈉水溶液，開始有些藍色，然后淺藍、藍色，再加熱出現紅色，煮沸7 10min出現透明的酒 紅色，最后加三蒸水至100ml，就這樣制備了40nm的膠體金溶液。然后用電鏡鏡檢，確保制 備的金顆粒盡量使其大小一致，均勻，顆粒直徑在40nm左右，否則重新制備。
4、 單克隆抗體的標記
待標記的抗體蛋白用O. 005mol/L的氯化鈉溶液透析48小時除鹽，然后用制備好的40nm的 膠體金來標記多克隆抗體蛋白。具體步驟為①向攪拌中的膠體金溶液里迅速加入抗體蛋白 使其終濃度達到40ug/mL，室溫下孵育5min;②用0. lmol/L K2C03調節金溶液的pH為9. 0，然 后加入10。/。BSA至終濃度0. 1%來穩定膠體金溶液，反應5min;③10000rpm離心20min，棄上清 ，再用0.01mMTris (pH=9.0)的緩沖液恢復，重復1次，以除去未與金顆粒結合的抗體；④最后一次離心后將沉淀重懸于原體積的l/10的0.01mM Tris (pH=9.0)緩沖液中，最后加入 BSA至終濃度為O. 1%， NaN3至終濃度0. 02%， 4"C儲存備用。以上操作中應注意， 一切溶液中 不應含雜質微粒，可用高速離心或微孔濾膜預處理。
5、 膠體金試紙條的組裝
將標記好的單克隆抗體蛋白噴涂到金標墊上，噴涂FBrOVA偶聯抗原到T線，噴涂二抗到 C線，然后組裝好試紙條，37'C烘箱干燥，置4'C冰箱保存備用。試紙條的組裝順序如附圖l ，由下到上的順序為l為塑料底襯、2為硝酸纖維素膜、3為金標墊、4為樣品墊、5為吸水墊
6、 膠體金試紙條的使用及結果判定
把待檢樣品滴入試紙條的樣本槽中，由于毛細效應，液體的層析方向向上，若待檢液中 含FBh當待測液進入測試端時，由于毛細效應往前移動，FBi與金標墊上的金標單克隆抗體 (Au-Ab)形成Au-Ab- FBi二聯復合物，復合物在NC膜上繼續層析泳動，無法與檢測線(T 線)上的FBrOVA偶聯抗原結合而不能被固定在T線抗原截留下來，無法形成可見的棕紅色條 帶；Au-Ab- FB工復合物由于層析作用，繼續迀移向前，與固定在質控線(C線)上的兔抗鼠 多克隆抗體結合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶，進行定性判定；根據檢測線顯色深 淺程度來大概判定檢測到的FBi含量，屬于半定量，然后再結合酶聯免疫試驗進行定量，如 圖2中a所示。
若待測液不含FBh金標墊的金標鼠單克隆抗體繼續向前移動，則與檢測線(T線)的 FB廣OVA結合，形成Au-Ab-FB廣OVA而被截留，形成可見的棕紅色條帶，多余的金標單克隆體 繼續層析向上，與固定在質控線(C線)上的二抗結合形成二聯復合物而被截留下來，形成 可見的棕紅色條帶，如圖2中b所示。
可以看出，本實施例的方法可直接檢測樣品中的FBh不需要專業培訓，操作方便、快 速，5 10分鐘即可獲得結果，能快速、簡便、及時地檢測FBi的目的。
權利要求
1、一種用膠體金免疫層析試驗快速檢測伏馬毒素的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，將伏馬毒素半抗原通過戊二醛法分別與KLH和OVA偶聯；步驟二，利用步驟一所得伏馬毒素KLH偶聯物，采用常規方法制備抗伏馬毒素的單克隆抗體；步驟三，用檸檬酸三鈉還原法制備40nm的膠體金，用該膠體金標記經過透析除鹽處理的抗伏馬毒素的單克隆抗體；步驟四，將步驟三得到的單克隆抗體蛋白噴涂到金標墊上，將伏馬毒素-OVA偶聯物噴涂到T線，兔抗鼠的單克隆抗體噴涂到C線，組裝成試紙條，干燥；步驟五，將待測樣品用甲醇提取，離心，取上清，將上清滴入試紙條的樣本槽中，獲取T線和C線的顯色，鑒定，得到結果。
2、 根據權利要求l所述的用膠體金免疫層析試驗快速檢測伏馬毒素的方法，其特征是，步驟三中，所述膠體金的制備方法具體為將100ml的0.005。/。HAuC14溶液加熱至沸騰，之 后加入O. 5 lml的P/。檸檬酸三鈉水溶液，煮沸7 10min，最后加三蒸水至100ml，制備得到 40nm的膠體金溶液；其中，百分數為重量體積百分數。
3、 根據權利要求l所述的用膠體金免疫層析試驗快速檢測伏馬毒素的方法，其特征是，步驟三中，所述標記具體為在攪拌的條件下，向膠體金溶液中加入單克隆抗體，使其終 濃度達到40ug/mL， 25。C下孵育5min，用O. lmol/L K2C03調節膠體金溶液的pH為9. 0，然后加 入10。/。BSA至BSA的終濃度為0. 1%， 10000rpm離心20min，棄上清，再用O. OlmM pH為9. 0的Tris緩沖液恢復，重復1次，之后將沉淀重懸于原體積的l/10的0.01mM pH為9. O的Tris緩沖 液中，最后加入10。/。BSA至BSA的終濃度為0. 1%， 4。C儲存備用；其中，百分數為重量體積百分數。
4、 根據權利要求l所述的用膠體金免疫層析試驗快速檢測伏馬毒素的方法，其特征是 ，步驟四中，所述干燥為37"C烘箱干燥。
5、 根據權利要求l所述的用膠體金免疫層析試驗快速檢測伏馬毒素的方法，其特征是 ，步驟五中，所述甲醇為體積分數為80%的甲醇。
6、 根據權利要求l所述的用膠體金免疫層析試驗快速檢測伏馬毒素的方法，其特征是 ，步驟五中，所述離心為2500g離心15分鐘。
7、 根據權利要求l所述的用膠體金免疫層析試驗快速檢測伏馬毒素的方法，其特征是，步驟五中，所述鑒定具體為在C線上出現棕紅色條帶，說明待測樣品中含伏馬毒素；在 T線和C線上均出現棕紅色條帶，說明待測樣品中不含伏馬毒素。
全文摘要
一種生物檢測工程技術領域的用膠體金免疫層析試驗快速檢測伏馬毒素的方法，包括如下步驟將伏馬毒素半抗原通過戊二醛法分別與KLH和OVA偶聯；利用所得伏馬毒素-KLH偶聯物，采用常規方法制備抗伏馬毒素的單克隆抗體；用檸檬酸三鈉還原法制備40nm的膠體金，用該膠體金標記經過透析除鹽處理的抗伏馬毒素的單克隆抗體；將得到的單克隆抗體蛋白噴涂到金標墊上，將伏馬毒素-OVA偶聯物噴涂到T線，兔抗鼠的單克隆抗體噴涂到C線，組裝成試紙條，干燥；將待測樣品用甲醇提取，離心，取上清，將上清滴入試紙條的樣本槽中，獲取T線和C線的顯色，鑒定，得到結果。本發明的方法檢測特異性強，準確率高；檢測速度快，所需時間短，只需5～10分鐘。
文檔編號G01N33/577GK101661043SQ20091030779
公開日2010年3月3日 申請日期2009年9月27日 優先權日2009年9月27日
發明者嚴亞賢, 孫建和, 君 王, 王元凱 申請人:上海交通大學