專利名稱：利用親和柱分析全蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)組技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種利用親和柱分析全蛋白的
方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)行使生物功能的分子載體。生物樣品中全蛋白的分析鑒定對(duì) 闡明生物功能、生理狀態(tài)和疾病的發(fā)生發(fā)展和治療具有重要作用。生物樣品常含有數(shù)千種 蛋白，一般情況下，不超過(guò)二十種的高豐度蛋白占蛋白總量的99%，而數(shù)千種低豐度蛋白 占蛋白總量不到1%，高豐度蛋白與低豐度蛋白的豐度范圍高達(dá)9個(gè)數(shù)量級(jí)。基于鳥槍法 (shot-g皿strategy)的生物質(zhì)譜可簡(jiǎn)捷快速鑒定生物樣品中多種蛋白。但由于質(zhì)譜儀器本 身檢測(cè)能力、檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)蛋白豐度范圍的限制，樣品中高豐度蛋白易于掩蓋低豐度 蛋白的檢測(cè)信號(hào)，低豐度蛋白漏檢率高。現(xiàn)有技術(shù)手段無(wú)法簡(jiǎn)單快捷地分析鑒定生物樣品 中全蛋白，尤其是漏檢低豐度蛋白。 經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，在質(zhì)譜鑒定之前進(jìn)行預(yù)分離可以改善樣品中低 豐度蛋白的檢出幾率，常用傳統(tǒng)多維液相色譜、多維電泳預(yù)分離方法以及剔出高豐度蛋 白的予頁(yè)處理方法(Gao等，Large scale depletion of the high-abundance proteins and analysisof middle—and low—abundance proteins in human liver proteome bymultidimensional liquid chromatography. Proteomics 8(2008) :939 947.)與質(zhì)譜
聯(lián)用改善了低豐度蛋白的檢出幾率。但在實(shí)際操作中，大規(guī)模剔除高豐度蛋白，傳統(tǒng)多維液 相色譜和常用多維電泳預(yù)分離方法操作復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力，工作量大，不利于疏水蛋白、極大 和極小分子量蛋白、極高等電點(diǎn)和極低等電點(diǎn)蛋白以及膜蛋白的分析。而且大規(guī)模剔除高 豐度蛋白的操作需要首先分析鑒定高豐度蛋白，再制備相應(yīng)蛋白抗體，操作時(shí)間長(zhǎng)，工作量 大，操作繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種利用親和柱分析全蛋白的方 法。本發(fā)明的方法可克服高豐度蛋白淹沒(méi)低豐度蛋白信號(hào)的技術(shù)不足，提高極端性質(zhì)蛋白 檢出率。 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟
步驟一，合成親和分離材料，得到親和分離材料庫(kù)； 步驟二，提取生物樣品全蛋白，從步驟一所得的親和分離材料庫(kù)中篩選出吸附蛋 白種類占全蛋白20 80%的親和材料組合； 步驟三，從步驟二所得親和材料組合中選擇一種或多種分別填充親和柱，之后利 用所得親和柱，采用級(jí)聯(lián)組合分析方法、串聯(lián)組合分析方法、或者級(jí)聯(lián)與串聯(lián)混合的組合分 析方法分析生物樣品全蛋白，得到多組蛋白復(fù)雜度簡(jiǎn)化的樣品； 步驟四，對(duì)步驟三所得樣品分別進(jìn)行胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析，進(jìn)而完成生物樣品全蛋白的全蛋白分析。 步驟一中，所述親和分離材料庫(kù)具體為以如下組合中的氨基化合物為 配體，采用以環(huán)氧氯丙烷為骨架的單氨基化合物配體合成法合成相應(yīng)的親和分離 材料；以如下組合中的氨基化合物為配體，采用以三氯三氮嗪為骨架的雙氨基化 合物配體合成法合成相應(yīng)的親和分離材料；所有合成的親和分離材料構(gòu)成親和分 離材料庫(kù)；所述氨基化合物的組合為3-amino-l-propanol、2-phenethylamine、 acrylamide、3， 5—dinitroaniline、3—methoxypropylamine、2_methy1—5—nitroaniline、 ethanolamine、2， 4一dichloroaniline、 ethylenediamine、2—aminobenzothiazole、 4_methyl_3_nitroaniline、3_methyl_o_phenylenediamine、 octylamine、2，
5- dichloroaniline、 propylamine、4， 4' -thiodiani 1 ine、 1， 4-phenylenediamine、 4，4-diaminodiphenylmethane、 o-toluidine、4，4' -oxydianiline、 p-toluidine、2，
6- dimethylaniline、2， 4， 6-trichloroaniline、4， 4-methylene-bis (2-chloroani1i ne) 、 m-toluidine、4-aminobipheny1、2， 3-dichloroaniline、4-aminobenzoic acid、 methyl 2-aminobenzoate、4， 4' _methylene_bis(2-methylani1ine)、 m-anisidine、 4—aminoazobenzene、 o-anisidine、 aniline、2，4_diamino_6_methylphenol、4_amino_2， 6—dinitrotoluene、l—naphthylamine、 isopropylamine、2，4—diaminotoluene、 benzidine、3' _aminoacetophenone、4_methyl_m_phenylenediamine、2， 4一dimethylaniline、4一isopropylaniline、2， 4一dinitroani1ine、 benzylamine、 4' -aminoacetophenone、4-methyl_o_phenylenediamine、2，6-dichloroaniline、 p_anisidine、2， 6-diethylaniline、 o_aminoazotoluene、4_amino_2_nitrophenol、 l_amino_2_naphthol_4_sulfonic acid、2， 6-dinitroaniline、2， 4一diaminoanisole、 2—aminophenol、 o-dianisidine、2_amino_3_nitrophenol、2—aminobenzimidazole、 2_aminopyridine、6_amino caproic acid、2—naphthylamine、2—furfurylamine、 2_methoxy_5_methylaniline、5_aminoisophthalic acid、2—nitroaniline、 4—phthalazinedione、3—aminopyridine、 cyclohexylamine、2_methy1—3—nitroaniline、 1—aminoanthraquinone、3_aminophenol、4—aminosalicy1ic acid、4_aminophenol、 arginine、2_methyl_4_nitroaniline、2_aminoterephthaiic acid、3_nitroaniline、 9-aminoacridine、4-nitroaniline、 tryptamine、2_methyl_6_nitroani1ine禾卩3， 3' -dichlorobenzidine。 步驟三中，所述親和分離材料組合具體為分別以1，6-己二胺、色胺和6-氨基己 酸為配體，采用以環(huán)氧氯丙烷為骨架的單氨基化合物配體合成法合成的相應(yīng)的親和分析材 料；分別以丁胺和十一胺、乙二胺和L-精氨酸、苯胺和氨基醋酸、對(duì)氨基苯脒鹽酸鹽和L-脯 氨酸、芐胺和酪胺、以及間氨基酚和間苯二胺為配體，采用以三氯三氮嗪為骨架的雙氨基化 合物配體合成法合成的相應(yīng)的親和分離材料；上述得到的9種親和材料組成親和分離材料 組合。 步驟三中，所述級(jí)聯(lián)組合分析方法具體為取生物樣品全蛋白，通過(guò)第一根親和柱 吸附洗脫，得到流穿和洗脫兩組樣品；將流穿和洗脫兩組樣品分別通過(guò)第二根親和柱，各自 再次得到流穿和洗脫兩組樣品，此時(shí)共有四組樣品；依次類推，當(dāng)通過(guò)第n根親和柱后，共 得到2n組樣品；所述n為> 2的自然數(shù)。
優(yōu)選地，所述n為> 3的自然數(shù)。 步驟三中，所述串聯(lián)組合分析方法具體為取生物樣品全蛋白，通過(guò)第一根親和柱 吸附洗脫，得到流穿和洗脫兩組樣品；流穿組樣品通過(guò)第二根親和柱吸附洗脫，得到流穿和 洗脫兩組樣品，共三組樣品；依次類推，將每一次得到的流穿組樣品再次通過(guò)親和柱吸附洗 脫，得到與之相應(yīng)的流穿和洗脫兩組樣品，在通過(guò)第m根親和柱后，共得到m+l組樣品；所述 m為^ 3的自然數(shù)。 優(yōu)選地，所述m為> 5的自然數(shù)。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明設(shè)計(jì)合成具有結(jié)構(gòu)多樣性 的親和配體的分離材料庫(kù)，利用親和材料對(duì)不同類別蛋白吸附特異不同的性質(zhì)，通過(guò)幾種 親和材料柱的串聯(lián)組合和(或)級(jí)聯(lián)組合進(jìn)行生物樣品中的復(fù)雜蛋白的簡(jiǎn)化分組；本發(fā)明 的方法流程簡(jiǎn)單，不需要大型儀器設(shè)備，易于自動(dòng)化，只需要3 6小時(shí)就可以完成蛋白分 組，相比傳統(tǒng)的SDS-PAGE、兩維電泳、兩維液相色譜法，時(shí)間大大縮短；親和柱組合分組對(duì) 蛋白樣品復(fù)雜度簡(jiǎn)化后，在LC-MS/MS分析對(duì)多肽的分離可以只采用一維C18反相分離，免 用了離子交換步驟，進(jìn)而可節(jié)省幾個(gè)小時(shí)；親和柱組合分組后檢出蛋白數(shù)量比分組前提高 60 150% ，檢出蛋白對(duì)原始樣檢出蛋白覆蓋率高達(dá)80 90%以上，比現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道檢出 的蛋白數(shù)提高很多。


圖1親和組合分組系統(tǒng)工作流程示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前 提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的 條件。
本實(shí)施例中涉及到的實(shí)驗(yàn)，操作過(guò)程如下
(1)組織蛋白提取 用剪刀切碎樣品組織(如是微生物細(xì)胞，則離心后收獲菌體)，然后用pH為7. 0 含O. l麗aCl的磷酸鹽緩沖液充分洗滌并濾干，然后按每克組織10ml比例加裂解緩沖液 (0. 5mol/L醋酸，10mmol/L EDTA， 1. 0mmol/L PMSF， pH2. 8)，機(jī)械組織勻槳機(jī)勻槳，4。C下用 5000g離心10min，收集上清，然后超聲處理(400W，超3秒，停2秒，共800秒)，紗布過(guò)濾， 調(diào)PH到中性，再用17000g離心15min，收集上清液，分裝好，-7(TC保存?zhèn)溆谩?
(2)蛋白樣品的胰蛋白酶(trypsin)消化 分離后樣品透析除鹽并濃縮，制成凍干樣品。10 50ii g凍干樣品重溶于還原溶 液(6Mguanidine hydrochloride, 50mM Tris-HCl，3mM DTT， pH8，30ii 1)，于60。C培育1小 時(shí)；還原完后加入1. 5 iil的1M iodoacetamide，在暗處室溫烷基化處理30分鐘；然后加入 270ul的50mM ammonium bicarbonate buffer (pH 8. 5)將鹽濃度降低，遂力口入O. 5 5 u g 的活化胰蛋白酶(trypsin) ，37t:過(guò)夜。胰蛋白酶(trypsin)消化后的肽混和物凍干保存。
(3) LC-MS/MS分析
6
5 10 ii g重溶的胰蛋白酶消化肽混和物首先上樣到Zorbax 300 SB-C18 p印tidetraps (Agilent Technologies, Wilmington, DE)脫鹽；然后對(duì)肽混禾口物 在Zorbax300SB-C18反相毛細(xì)管層析柱(100踐inner diameter X 15cm， Agilent Technologies)上進(jìn)行反向?qū)游龇蛛x，流速設(shè)定為500nl/min，先用4 50% B的直線梯度 (A :0.1% (v/v)formic acid ;B :84% (v/v)acetonitrile and 0.1% (v/v)formic acid) 洗50分鐘，接著一個(gè)50 100% B梯度洗4分，100% B梯度維持10分。自動(dòng)收集的峰在 線上樣到Fi皿iganLTQ離子阱質(zhì)譜儀(single li固r quadrupole ion tr即)進(jìn)行肽鑒定。 收集一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，自動(dòng)形成肽質(zhì)譜文件。LC-MS/MS完成每個(gè)樣品的肽質(zhì)譜原始文 件，利用Sequest軟件設(shè)定條件針對(duì)組織蛋白所屬來(lái)源的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜庫(kù)，跟已知蛋 白序列理論多肽序列比對(duì)分析進(jìn)行匹配，從而找出樣品內(nèi)可能具有的非冗余可信蛋白。為 了避免錯(cuò)誤匹配，采用ISB/SPC Proteomics Tools-TPP V4. 2過(guò)濾錯(cuò)誤匹配，肽的p值設(shè)定 為大于等于0. 9，蛋白置信度設(shè)定為95%以上。
(4)比較分析分組前后檢出的蛋白數(shù)量 將親和柱組合分組的所有組分檢出的蛋白合并，并剔出掉重復(fù)部分，可以統(tǒng)計(jì)出 總共檢出的蛋白數(shù)，并可以找出只在某一個(gè)組分里出現(xiàn)的蛋白。跟未分組的原始樣品相比， 分組后檢出蛋白數(shù)可以提高60 150%，分組后檢出蛋白對(duì)原始樣檢出蛋白覆蓋率高達(dá) 80 90%以上。只在特定組分出現(xiàn)的蛋白在總蛋白中占比40 80%。
實(shí)施例1 以環(huán)氧氯丙烷為骨架的親和材料合成 取S印harose CL-4B (100克)用10倍體積的去離子水洗滌，抽干成濕餅狀；然后 懸浮于50ml活化緩沖液(1M Na0H， 2. 5g硼氫化鈉，10ml環(huán)氧氯丙烷)，在攪拌下6(TC恒溫 反應(yīng)2小時(shí)，等pH接近7. 0時(shí)停止反應(yīng)，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下用10倍體積 的蒸餾水洗滌，環(huán)氧氯丙烷活化的S印harose 4B分裝于可密封的玻璃瓶中(20g/瓶)。
取各種氨基化合物0. 5g(見(jiàn)表1)溶解于25mL 0. 1M氫氧化鈉/L 二氧六環(huán)中，分 別加入到盛有活化的S印harose 4B的瓶中，貼好標(biāo)簽，在攪拌下于6(TC反應(yīng)24h。加入lmL 巰基乙醇，繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，10倍體積的蒸餾水充分洗滌至pH中性，體積分?jǐn)?shù)為20%的乙 醇中保存待用。這種方法用于合成單氨基化合物配體，按不同氨基化合物數(shù)字編號(hào)命名為 Am， m為氨基化合物數(shù)字編號(hào)。如，A6、 A84分別為用1， 6-己二胺和6-氨基己酸連接到活 化的S印harose 4B上構(gòu)建而成的兩種單氨基親和配體。
表l親和配體合成中使用的氨基化合物
氨基化合物 氨基化合物 3_amino_l_propanol acryl咖ide 3-methoxypropyl咖ine ethanol咖ine ethylenediamine 4_methyl_3_nitro￡iniline octylamine propylamine 1， 4-phenylenedi咖ine o—toluidine
2， 5-dichloroaniline 4， 4' 一thiodianiline
2， 4一dichloroaniline 2—aminobenzothiazole
4， 4一di咖inodiphenylmethane 4， 4' 一oxydianiline
p-toluidine2， 6-dimethylaniline2， 4， 6-trichloroaniline4， 4_methylene_bis(2-chloroaniline)m—toluidine4一aminobiphenyl2， 3-dichloroaniline4一aminobenzoic acidmethyl 2-aminobenzoate4， 4' -methylene-bis(2-methylaniline)m—anisidine4一膽ino3zobenzeneo-anisidine肌iline2， 4_diamino_6_methylphenol4_amino_2， 6-dinitrotoluenel一n即hthyl咖ineisopropylamine2， 4一di咖inotoluenebenzidine3'-咖inoacetophenone4_methyl_m_phenylenediamine2， 4-dimethylaniline4_i sopropylani1ine2， 4-dinitroanilinebenzylamine4'-咖inoacetophenone4_methyl_o_phenylenediamine2， 6-dichloroanilinep-anisidine2， 6-diethylanilineo—aminoazotoluene4一咖ino-2-nitropheno1l一膽ino-2-n即hthol-4一sulfonic acid2， 6-dinitroaniline2， 4_diaminoanisole2-aminopheno1o-dianisidine2-咖ino-3-nitropheno12-aminobenzimidazole2-咖inopyridine6-amino c即roic acid2-n即hthyl咖ine2-furfurylamine2_methoxy_5_methylani1ine5-aminoisophthalic acid2-nitroaniline4一phthalazinedione3-咖inopyridinecyclohexylamine2-methyl-3-nitroani1inel—aminoanthraquinone3-aminopheno14一aminosalicylic acid4一咖inopheno1arginine2-methyl-4一nitroani1ine2-aminoter印hthalic acid
3-nitroaniline9一aminoacridine
4一nitroanilinetryptamine
2-methyl-6-nitroani1ine3，3' -dichlorobenzidine實(shí)施例2以三氯三氮嗪為骨架的仿生配基的合成
100克環(huán)氧氯丙烷活化的S印harose CL 4B介質(zhì)懸浮于350ml去離子水，然后加入150ml35% (v/v)氨水，在攪拌(200r/min)下30。C恒溫12小時(shí)。NH廠S印haroseCL-4 B懸 浮在350ml50% (v/v)冰浴丙酮溶液中，隨后將8g三氯三氮嗪溶于80ml _201:預(yù)冷丙酮， 快速加入介質(zhì)懸浮液，用飽和NaHC03維持pH在6. 5 8. 0之間，O 4t:繼續(xù)攪拌2小時(shí) 停止反應(yīng)。
用3倍介質(zhì)體積的丙酮，丙酮去離子水(體積比i : i)，去離子水，順序洗滌反
應(yīng)，得二氯三氮嗪_氨基-S印harose CL 4B ;稱取20g 二氯三氮嗪-氨基-S印harose CL 4B，與溶解于一定量的蒸餾水中(20 50mL)5倍摩爾過(guò)量的氨基化合物(Rl)混勻，5(TC水 浴振蕩24小時(shí)，反應(yīng)過(guò)程中，用飽和NaHC03和lmol/L醋酸使溶液pH保持在7 7. 5之間， 10倍體積蒸餾水充分洗滌，抽干。然后與溶解于一定量蒸餾水(20 50mL)中的R2氨基 化合物(5倍摩爾過(guò)量)混合，95t:反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)過(guò)程中，用飽和NaHC03和lmol/L醋酸使溶液PH保持在6 7之間。最后10倍體積的蒸餾水充分洗滌三次，抽干，體積分?jǐn)?shù)為
20%的乙醇中保存待用。這種方法用于合成雙氨基化合物配體，按不同氨基化合物數(shù)字編
號(hào)命名為Am-n， m、 n為氨基化合物Rl和R2的數(shù)字編號(hào)，如A7_56， All-70，和A29_32。各
化合物編號(hào)分別為7 (乙二胺)、56 (L-精氨酸)11 (對(duì)氨基苯脒鹽酸鹽)、70 (L-脯氨酸)、
29(間氨基酚)、32(間苯二胺)。 實(shí)施例3 蛋白吸附性能評(píng)價(jià)與挑選 對(duì)親和分離材料庫(kù)吸附蛋白性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇吸附蛋白種類占全蛋白20至 80%的親和柱。 首先，將合成好的配體介質(zhì)取1ml分別裝填到層析柱中，寫好標(biāo)簽，用15ml平衡緩 沖液(pH7. O，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸鹽緩沖液)充分洗滌平衡；然后取1 4mg組織蛋 白上樣，柱上結(jié)合30分鐘，用10 20ml平衡緩沖液洗去未結(jié)合蛋白(通過(guò)蛋白紫外檢測(cè)儀 監(jiān)控，直到基線平)；最后用3ml洗脫緩沖液(pH12，10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上 結(jié)合蛋白，立即調(diào)節(jié)pH中性。收集的各個(gè)配體結(jié)合的蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，通 過(guò)電泳膠考馬斯亮藍(lán)染色的圖譜比對(duì)分析，從條帶分布就可以找出差異大的配體介質(zhì)。通 過(guò)每個(gè)親和介質(zhì)吸附蛋白后的洗脫樣品的LC-MS/MS質(zhì)譜分析可以確定每個(gè)親和介質(zhì)吸附 的具體蛋白種類，從而比較這些親和介質(zhì)的蛋白吸附差異。
符合吸附蛋白種類占全蛋白20至80%的親和柱有 A6， A84， A15分別為用環(huán)氧化學(xué)把編號(hào)化合物連接到層析基質(zhì)的親和分離材料；
Al-4， A7-56, A8_54， All_70， A25-35和A29-32,分別為兩種編號(hào)的化合物通過(guò)三 氯三氮嗪骨架連接到層析基質(zhì)的親和分離材料。各化合物編號(hào)分別為1(丁胺)、4(十一 胺)、6(1,6-己二胺)、7(乙二胺)、8(苯胺)、11(對(duì)氨基苯脒鹽酸鹽)、15(色胺)、25(芐 胺)、29 (間氨基酚)、32 (間苯二胺)、35 (酪胺)、54 (氨基醋酸)、56 (L-精氨酸)、70 (L-脯 氨酸)、84(6-氨基己酸)； lmg人血清蛋白過(guò)Al-4、A6、A7-56、A8-54、All-70、A15、A25-35、A29-32和A84九根 親和材料后，按上述條件得到的9份柱上結(jié)合蛋白樣品分別trypsin消化，LC-MS/MS分析， Sequest搜庫(kù)過(guò)濾鑒定的非冗余可信蛋白。Al-4、 A6、 A7_56、 A8_54、 All_70、 A15、 A25_35、 A29-32和A84九份柱上結(jié)合蛋白樣品中鑒定的非冗余可信蛋白組數(shù)量分別為19、46、10、 25、41、27、17、38和44種，其中各柱專一吸附(不與其它重復(fù))的蛋白數(shù)量分別為1、7、1、 1、12、1、2、6和6種，主要是低豐度蛋白。 2mg小鼠睪丸組織蛋白過(guò)Al-4、A6、A7-56、A8-54、All-70、A15、A25-35、A29-32和 A84九根親和材料后，按上述條件得到的9份柱上結(jié)合蛋白樣品分別trypsin消化，LC-MS/ MS分析，Sequest搜庫(kù)過(guò)濾鑒定的非冗余可信蛋白。Al_4、 A6、 A7_56、 A8_54、 All_70、 A15、 A25-35、A29-32和A84九份柱上結(jié)合小鼠睪丸蛋白樣品中鑒定的非冗余可信蛋白組數(shù)量分 別為111、173、120、196、93、151、287、106和86種，其中各柱專一吸附(不與其它重復(fù))的 蛋白數(shù)量分別為H、34、23、30、16、20、78、12和17種，差異吸附效應(yīng)明顯。9柱總共鑒定的 535個(gè)非冗余小鼠睪丸可信蛋白中，各柱專一吸附蛋白數(shù)量為242(45.2%)，在2、3、4、5、6、 7、8和9柱中重復(fù)出現(xiàn)的蛋白數(shù)量分別為105、59、44、30、33、12、4和6種。
實(shí)施例4
串聯(lián)分組1采用5種親和配體介質(zhì)A7-56，A84，A11-70，A6，和A29-32串聯(lián)組合分析大鼠肝組 織細(xì)胞溶質(zhì)部分(rat liver cytosol)全蛋白。串聯(lián)分組工作流程如圖IA所示。
步驟一，親和層析柱的串聯(lián)平衡 A7-56, A84， All_70， A6，和A29-32五根親和配體介質(zhì)各裝填1ml到層析柱(低端 和頂端封好墊片)，5個(gè)層析柱首尾依次串聯(lián)連接好。串聯(lián)層析柱首先用30ml平衡緩沖液 (pH7. O，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸鹽緩沖液)充分洗滌平衡。 步驟二，柱上結(jié)合取4mg大鼠肝細(xì)胞溶質(zhì)組織勻漿Fraction O，上樣到串聯(lián)柱， 柱上結(jié)合60分鐘，用40ml平衡緩沖液洗去未結(jié)合蛋白，通過(guò)蛋白紫外檢測(cè)儀監(jiān)控直到基線 平，并接收流穿蛋白，定義為Fraction 6。 步驟三，洗脫把五根串聯(lián)的層析介質(zhì)柱分開(kāi)，每根柱子單獨(dú)用3ml洗脫緩沖液 (pH12，10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上結(jié)合蛋白，立即調(diào)節(jié)pH中性，5根柱子的洗脫 接收液分別定義為Fractionl-Fraction5。 步驟四，胰蛋白酶(trypsin)消化按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)程序分別消化原樣和串聯(lián)分配的 Fractionl-Fraction 6各組分。 步驟五，LC-MS/MS分析10 ii g重溶的原樣(Fraction 0)和串聯(lián)分配的六個(gè)組分 (Fraction 1 Fraction 6)肽混和物按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)程序肽分離、LC-MS/MS分析、搜庫(kù)過(guò)濾分 析。 步驟六，比較分析分組前后檢出的蛋白數(shù)量 將串聯(lián)分組的6個(gè)組分檢出的蛋白合并，并剔出掉重復(fù)部分，總共鑒定出665個(gè)大 鼠肝蛋白，而分組前的原始樣品中只檢出370個(gè)蛋白，分組后檢出的蛋白數(shù)提高了80%，分 組后檢出蛋白對(duì)原始樣檢出蛋白覆蓋率高達(dá)80% (291個(gè))。665個(gè)鑒定的大鼠肝蛋白中， 有430個(gè)蛋白只在特定組分出現(xiàn)而不與其它組分重復(fù)，在總蛋白中占比64. 7 % ，親和配體 特異性得到充分展示。串聯(lián)工作流程簡(jiǎn)單，不需要大型儀器設(shè)備，易于自動(dòng)化，只需要2 3小時(shí)就可以完成串聯(lián)分組工作，比傳統(tǒng)的SDS-PAGE、兩維電泳、兩維液相色譜需要的時(shí)間 大大縮短丄C-MS/MS分析時(shí)，因?yàn)榇?lián)親和柱組合分組對(duì)組織蛋白樣品的簡(jiǎn)化，對(duì)多肽的分 離也只需要采用一維的C18反相分離。
實(shí)施例5
串聯(lián)分組2 采用的組織材料為假單胞菌M18培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取液。采用的5個(gè)串聯(lián)配體介質(zhì)為A7-56，A84，All-70，A6，和A29-32。不同數(shù)字代表的
氨基化合物為7 (乙二胺)、56 (L-精氨酸)、84 (6-氨基己酸)、11 (對(duì)氨基苯脒鹽酸鹽)、
70 (L-脯氨酸)、6(1,6-己二胺)、29 (間氨基酚)、32 (間苯二胺)。 全蛋白分析的步驟 步驟一，親和層析柱的串聯(lián)平衡 A7-56, A84， All_70， A6，和A29-32五根親和配體介質(zhì)各裝填lml到層析柱(低端 和頂端封好墊片)，5個(gè)層析柱首尾依次串聯(lián)連接好。串聯(lián)層析柱首先用30ml平衡緩沖液 (pH7. 0，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸鹽緩沖液)充分洗滌平衡。 步驟二，柱上結(jié)合取8mg假單胞菌M18培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取液，上樣到親和串聯(lián)柱，
10柱上結(jié)合60分鐘，用40ml平衡緩沖液洗去未結(jié)合蛋白(通過(guò)蛋白紫外檢測(cè)儀監(jiān)控，直到基 線平)，接收流穿蛋白，定義為Fraction 6。 步驟三，洗脫把五根串聯(lián)的層析介質(zhì)柱分開(kāi)，每根柱子單獨(dú)用3ml洗脫緩沖液 (pH12，10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上結(jié)合蛋白，立即調(diào)節(jié)pH中性，5根柱子的洗脫 接收液分別定義為Fractionl-Fraction 5。 步驟四，胰蛋白酶(trypsin)消化按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)程序分別消化原樣和串聯(lián)分配的 Fractionl-Fraction 6個(gè)組分。
步驟五，LC-MS/MS分析 10 g重溶的上步各組分trypsin消化產(chǎn)物分別按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行肽分離、 LC-MS/MS分析、搜庫(kù)過(guò)濾分析。 步驟六，比較分析分組前后檢出的蛋白數(shù)量 將假單胞菌M18培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取液串聯(lián)分組的6個(gè)組分檢出的蛋白合并，并剔 出掉重復(fù)部分，總共檢出611個(gè)的假單胞菌蛋白，而未分組的原始樣品只檢出298個(gè)蛋白， 分組后檢出蛋白數(shù)提高了 105%。只在特定組分出現(xiàn)的蛋白數(shù)為450(即組分之間不重復(fù)的 蛋白)，在總蛋白中占比73.6%，親和配體特異性得到充分展示。
實(shí)施例6
級(jí)聯(lián)分組l 采用的組織材料為大鼠肝組織細(xì)胞溶質(zhì)部分(rat liver cytosol)，采用三層級(jí) 聯(lián)組合方式進(jìn)行親和柱組合分組，然后胰蛋白酶消化、LC-MS/MS分析。采用的3個(gè)級(jí)聯(lián)組 合的配體介質(zhì)為A15， A8-54和All-70。不同數(shù)字代表的氨基化合物為15(色胺)、8(苯 胺)、54 (甘氨酸)、11 (對(duì)氨基苯脒鹽酸鹽)、70 (L-脯氨酸)；級(jí)聯(lián)分組的工作流程如圖1B。
全蛋白分析的步驟
步驟一，親和層析柱的平衡 A15， A8-54和A11-70親和配體介質(zhì)各裝填0. 4ml到層析柱(低端和頂端封好墊 片，A15裝填1根，A8-54平行裝填2根，All-70平行裝填4根。每個(gè)層析柱首先用10ml平 衡緩沖液(PH 7. O，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸鹽緩沖液)充分洗滌平衡。
步驟二，第一級(jí)親和分組取4mg大鼠肝組織細(xì)胞溶質(zhì)組織提取液FO上樣到A15 親和柱，柱上結(jié)合30分鐘，用10ml平衡緩沖液洗去未結(jié)合蛋白(通過(guò)蛋白紫外檢測(cè)儀監(jiān) 控，直到基線平)，接收流穿蛋白，流穿組份定義為F卜lt)然后用2ml洗脫緩沖液(pH12， 10mMGlycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上結(jié)合蛋白，立即調(diào)節(jié)pH中性，洗脫組份定義為F卜2。此 步驟將原始樣品一分二到兩個(gè)不同的亞組份。 步驟三，第二級(jí)親和分組第一層親和柱組合分組的兩個(gè)組份巳—^F卜2分別上樣到 兩根平衡好的A8-54親和層析柱，柱上結(jié)合30分鐘，用10ml平衡緩沖液洗去未結(jié)合蛋白 (通過(guò)蛋白紫外檢測(cè)儀監(jiān)控，直到基線平)，接收流穿蛋白，兩個(gè)流穿組份分別定義為F2—工和 F2—3。然后用2ml洗脫緩沖液(pH12，10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上結(jié)合蛋白，立即 調(diào)節(jié)PH中性，兩個(gè)洗脫組份分別定義為F2—2和F2—4。此步驟將上步樣品二分四。
步驟四，第三級(jí)親和分組第二層親和柱組合分組的四個(gè)組份F2—pF2—2、F2—3、F2—4分 別上樣到四根平衡好的All-70親和層析柱，柱上結(jié)合30分鐘，用10ml平衡緩沖液洗去未 結(jié)合蛋白(通過(guò)蛋白紫外檢測(cè)儀監(jiān)控，直到基線平)，接收流穿蛋白，四個(gè)流穿組份分別定義為F3—p F3—3、 F3—5、 F3—7。然后用2ml洗脫緩沖液(pH12， 10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫 柱上結(jié)合蛋白，立即調(diào)節(jié)pH中性，四個(gè)洗脫組份分別定義為F3—2、F3—4、F3—6和F3—8。此步驟將 上步樣品四分八。 步驟五，胰蛋白酶(trypsin)消化FO、 F卜!、 F!—2、 F2—!、 F2—2、 F2—3、 F2—4、 F3—!、 F3—2、 F3—3、 F3-4、 F3—5、 F3—6、 F3—7和F3—8 —共15個(gè)樣品，通過(guò)透析除鹽并濃縮處理，制成凍干樣品。各取 50微克凍干樣品重溶于還原溶液(6M guanidine hydrochloride, 50mMTris_HCl， 3mM DTT， pH8， 30 ill)，按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)程序分別消化。
步驟六，LC-MS/MS分析 上步消化好的F0、p F卜2、 F2—p F2—2、 F2—3、 F2—4、 F3—" F3—2、 F3—3、 F3—4、 F3—5、 F3—6、 F3—7和 F3—8 —共15個(gè)組分按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)程序肽分離、LC-MS/MS分析、搜庫(kù)過(guò)濾分析。
步驟七，通過(guò)檢出的蛋白數(shù)量的比較分析級(jí)聯(lián)分組的效果 未分組的原始大鼠肝組織細(xì)胞溶質(zhì)部分(rat liver cytosol) F0中，鑒定得到391 個(gè)非冗余的可信大鼠肝蛋白。第一級(jí)親和層析得到的2個(gè)組分F卜工和F卜2中檢出的蛋白合 并，并剔出掉重復(fù)部分，總共檢出的蛋白數(shù)為499個(gè)，檢出的蛋白數(shù)提高了 27.6%。第二級(jí) 親和層析得到的的4個(gè)組分F2—p F2—2、 F2—3和F2—4中檢出的蛋白合并，并剔出掉重復(fù)部分，總 共檢出616個(gè)可信蛋白，跟未分組的FO相比提高了 57. 5% 。第三級(jí)親和層析得到的的8個(gè) 組分F3—p F3—2、 F3—3、 F3—4、 F3—5、 F3—6、 F3—7和F3—8中檢出的蛋白合并，并剔出掉重復(fù)部分，總共檢 出的738個(gè)可信蛋白，跟未分組的FO相比提高了提高了 88. 75% 。通過(guò)逐級(jí)分配，鑒定的蛋 白逐漸增加，級(jí)聯(lián)分組的效果是非常明顯。最終通過(guò)三級(jí)聯(lián)親和分組共檢出859個(gè)非冗余 的可信大鼠肝蛋白(蛋白組)，檢出的蛋白數(shù)提高了 119.6%，也比現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)量提 高1倍以上。未分組樣品中檢出的蛋白有93. 1% (364個(gè))在級(jí)聯(lián)分組后重現(xiàn)，一共檢出 495個(gè)新蛋白。該方法利用不同配體的級(jí)聯(lián)組合來(lái)分組大鼠肝組織細(xì)胞溶質(zhì)部分組織蛋白 樣品，工作流程簡(jiǎn)單，不需要大型儀器設(shè)備，易于自動(dòng)化，只需要3 4小時(shí)就可以完成級(jí)聯(lián) 分組工作，
實(shí)施例7
級(jí)聯(lián)分組2 采用的組織材料為小鼠睪丸組織提取液，采用三層級(jí)聯(lián)的組合方式進(jìn)行親和柱組
合分組，然后胰蛋白酶消化、LTQ-MS/MS分析。采用的3個(gè)級(jí)聯(lián)組合的配體介質(zhì)為A15， A8-54
和All-70。不同數(shù)字代表的氨基化合物為15 (色胺)、8 (苯胺)、54 (甘氨酸)、11 (對(duì)氨基
苯脒鹽酸鹽)、70(L-脯氨酸)。 全蛋白分析的步驟 步驟一，親和層析柱的平衡 A15， A8-54和A11-70親和配體介質(zhì)各裝填0. 4ml到層析柱(低端和頂端封好墊 片，A15裝填1根，A8-54平行裝填2根，All-70平行裝填4根。每個(gè)層析柱首先用10ml平 衡緩沖液(PH 7. O，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸鹽緩沖液)充分洗滌平衡。
步驟二，第一級(jí)親和分組取4mg小鼠睪丸組織提取液M0上樣到A15親和柱， 柱上結(jié)合30分鐘，用10ml平衡緩沖液洗去未結(jié)合蛋白(通過(guò)蛋白紫外檢測(cè)儀監(jiān)控，直 到基線平)，接收流穿蛋白，流穿組份定義為M1-1。然后用2ml洗脫緩沖液(pH12，10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上結(jié)合蛋白，立即調(diào)節(jié)pH中性，洗脫組份定義為M卜2。此步
12驟將原始樣品一分二到兩個(gè)不同的亞組份。 步驟三，第二級(jí)親和分組第一級(jí)親和分組的兩個(gè)組份M^p 2，分別上樣到兩根 平衡好的A8-54親和層析柱，柱上結(jié)合30分鐘，用10ml平衡緩沖液洗去未結(jié)合蛋白(通過(guò) 蛋白紫外檢測(cè)儀監(jiān)控，直到基線平)，接收流穿蛋白，兩個(gè)流穿組份分別定義為M2—工和M2—3。 然后用2ml洗脫緩沖液(pH12，10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上結(jié)合蛋白，立即調(diào)節(jié) pH中性，兩個(gè)洗脫組份分別定義為M2—2和M2—4。此步驟將上步樣品二分四。
步驟四，第三級(jí)親和分組第二級(jí)親和分組的四個(gè)組份M^pM2—2、M2—3和M^4，分別上 樣到四根平衡好的All-70親和層析柱，柱上結(jié)合30分鐘，用10ml平衡緩沖液洗去未結(jié)合 蛋白(通過(guò)蛋白紫外檢測(cè)儀監(jiān)控，直到基線平)，接收流穿蛋白，四個(gè)流穿組份分別定義為 Mh、 M3—3、 M3—5、 M3—7。然后用2ml洗脫緩沖液(pH12， 10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上 結(jié)合蛋白，立即調(diào)節(jié)pH中性，四個(gè)洗脫組份分別定義為M3—2、M3—4、M3—6和M3—8。 MO最終通過(guò)三 級(jí)聯(lián)分配成M3—p M3—2、 M3—3、 M3—4、 M3—5、 M3—6、 M3—7和M3—8八個(gè)亞分配組分。 步驟五，胰蛋白酶(trypsin)消化收集樣品MO、 M3—^ M3—2、 M3—3、 M3—4、 M3—5、 M3—6、 M3—7 和M3—8按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)程序消化。
步驟六，LC-MS/MS分析 上步消化處理好的MO、 M3—p M3—2、 M3—3、 M3—4、 M3—5、 M3—6、 M3—7和M3—8各10 ii g按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)
驗(yàn)程序肽分離、LC-MS/MS分析、搜庫(kù)過(guò)濾分析。 步驟七，通過(guò)檢出的蛋白數(shù)量的比較分析級(jí)聯(lián)分組的效果 未分組的原始小鼠睪丸組織M0中鑒定到526個(gè)非冗余的可信蛋白。M3—"M^2、M3—3、 M3—4、M3—5、M3—6、M3—7和M3—8八個(gè)組分檢出的蛋白合并，并剔出掉重復(fù)部分，總共檢出1378個(gè)非 冗余的小鼠睪丸蛋白，跟MO相比提高了 162%，比以前文獻(xiàn)報(bào)道的最大檢出數(shù)量也提高將 近173. 4%。 步驟八，本實(shí)施例建立的小鼠睪丸組織蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)特性分析 采用三層級(jí)聯(lián)親和分組與質(zhì)譜基于的蛋白組學(xué)分析建立了目前為止，最大的小 鼠睪丸蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(1378個(gè)蛋白)。在該數(shù)據(jù)庫(kù)中，鑒定的尺寸最小蛋白只有817Da，而 鑒定的最大分子量蛋白高達(dá)630. 35kDa，有12個(gè)(0. 87 % )鑒定蛋白分子量< 10kDa， 169(12. 26% )個(gè)鑒定蛋白分子量> lOOkDa，這都超出了現(xiàn)有小鼠睪丸蛋白組學(xué)研究中獲 得極端尺寸蛋白的極限。同時(shí)也鑒定得到38個(gè)蛋白(2.76%)的pl <4.5，51個(gè)蛋白 (3. 7% )的pl > 10，突破傳統(tǒng)2D-PAGE方法的極限。沒(méi)有通過(guò)特別的富集和處理方法，在小 鼠睪丸級(jí)聯(lián)親和分配組分中還鑒定到93個(gè)(6. 82% )疏水蛋白(GRAVY value > 0)，鑒定到 81個(gè)蛋白(5.88%)有1個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的TM domains。鑒定的小鼠睪丸組織蛋白有707個(gè) 集中分布于細(xì)胞溶質(zhì)、線粒體、細(xì)胞核和細(xì)胞膜四個(gè)主要的亞細(xì)胞器，占比66. 2%。級(jí)聯(lián)親 和分配鑒定的1378個(gè)小鼠睪丸蛋白中，有1157個(gè)蛋白(83.96%)在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)有GO 分子功能分類定義，其中481個(gè)蛋白(41. 57% )為各種催化活性的酶或酶亞基(包括氧化 還原酶、轉(zhuǎn)化酶、脂酶、水解酶、多聚酶、裂解酶、異構(gòu)酶等)，占比最大。其它功能蛋白包括分 子伴侶、核糖體蛋白、翻譯和轉(zhuǎn)錄因子、電子載體、核酸結(jié)合蛋白、金屬離子結(jié)合蛋白、酶調(diào) 節(jié)活性蛋白、發(fā)育蛋白、運(yùn)輸?shù)鞍住ⅠR達(dá)蛋白和結(jié)構(gòu)分子蛋白等。由于睪丸是生精的組織和 場(chǎng)所，我們對(duì)級(jí)聯(lián)親和分配中鑒定的1378個(gè)小鼠睪丸蛋白的功能分析找出了與生精及精 子發(fā)育相關(guān)的蛋白(IPI00118122， IPI00118783， IPI00118851， IPI00121394， IPI00123400，IPI00125705, IPI00127379, IPI00127431, IPI00131034, IPI00133708, IPI00227900, IPI00380504, IPI00406492, IPI00461359,IPI00138866, IPI00223935)。
權(quán)利要求
一種利用親和柱分析全蛋白的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，合成親和分離材料，得到親和分離材料庫(kù)；步驟二，提取生物樣品全蛋白，從步驟一所得的親和分離材料庫(kù)中篩選出吸附蛋白種類占全蛋白20～80％的親和材料組合；步驟三，從步驟二所得親和材料組合中選擇一種或多種分別填充親和柱，之后利用所得親和柱，采用級(jí)聯(lián)組合分析方法、串聯(lián)組合分析方法、或者級(jí)聯(lián)與串聯(lián)混合的組合分析方法分析生物樣品全蛋白，得到多組蛋白復(fù)雜度簡(jiǎn)化的樣品；步驟四，對(duì)步驟三所得樣品分別進(jìn)行胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析，進(jìn)而完成生物樣品全蛋白的全蛋白分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用親和柱分析全蛋白的方法，其特征是，步驟一中，所述 親和分離材料庫(kù)具體為以如下組合中的氨基化合物為配體，采用以環(huán)氧氯丙烷為骨架的 單氨基化合物配體合成法合成相應(yīng)的親和分離材料；以如下組合中的氨基化合物為配體， 采用以三氯三氮嗪為骨架的雙氨基化合物配體合成法合成相應(yīng)的親和分離材料；所有合成 的親和分離材料構(gòu)成親和分離材料庫(kù)；所述氨基化合物的組合為3-amino-l-propano1、 2—phenethylamine、 acrylamide、3， 5—dinitroaniline、3—methoxypropylamine、 2_methyl_5_nitroaniline、 ethanolamine、 2， 4一dichloroaniline、 ethylenediamine、 2_aminobenzothiazole、4_methyl_3_nitroaniline、3_methyl_o_phenylenediamine、 octylamine、2，5-dichloroaniline、 propyl amine、4，4' -thiodianiline、1， 4-phenylenediamine、4， 4-diaminodiphenylmethane、 o-toluidine、4， 4' -oxydianiline、 p-toluidine、2， 6-dimethylaniline、2， 4， 6_trichloroaniline、4， 4_methylene_bis (2_c hloroaniline) 、 m_toluidine、4_aminobiphenyl、2， 3_dichloroaniline、4_aminobenzoic acid、 methyl 2—aminobenzoate4， 4' -methylene-bis (2-methylani 1 ine) 、 m_anisidine、4_aminoazobenzene、 o-anisidine、 aniline、2， 4_diamino_6_methylphenol、4_amino_2， 6_dinitrotoluene、l_naphthylamine、 isopropylamine、2，4—diaminotoluene、 benzidine、3' _aminoacetophenone、4_methyl_m_phenylenediamine、2， 4_dimethylaniline、4_isopropylaniline、2， 4一dinitroani1ine、 benzylamine、 4' -aminoacetophenone、4_methyl_o_phenylenediamine、2，6_dichloroaniline、 p_anisidine、2， 6_diethylaniline、 o_aminoazotoluene、4_amino_2_nitrophenol、 l_amino_2_naphthol_4_sulfonic acid、2， 6-dinitroaniline、2， 4一diaminoanisole、 2_aminophenol、 o_dianisidine、2_amino_3_nitrophenol、2_aminobenzimidazole、 2-aminopyridine、6—amino caproic acid、2_naphthylamine、2_furfurylamine、2_methoxy_5_methylani1ine 、 5_aminoi sophthaiic acid、2_nitroaniline、 4_phthalazinedione、3_aminopyridine、 cyclohexylamine、2_methyl_3_nitroaniline、l_aminoanthraquinone、3_aminophenol、 4一aminosalicylic acid、4_aminophenol、 arginine、2_methyl_4_nitroaniline、2_aminoterephthalic acid、3—nitroaniline、 9_aminoacridine、4_nitroaniline、 tryptamine、2_methyl_6_nitroaniline禾卩3，3' -dichlorobenzidine。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用親和柱分析全蛋白的方法，其特征是，步驟三中，所述親和分離材料組合具體為分別以1，6-己二胺、色胺和6-氨基己酸為配體，采用以環(huán)氧氯丙烷為骨架的單氨基化合物配體合成法合成的相應(yīng)的親和分析材料；分別以丁胺和十一胺、乙二胺和L-精氨酸、苯胺和氨基醋酸、對(duì)氨基苯脒鹽酸鹽和L-脯氨酸、芐胺和酪胺、以及間氨基酚和間苯二胺為配體，采用以三氯三氮嗪為骨架的雙氨基化合物配體合成法合成的相應(yīng)的親和分離材料；上述得到的9種親和材料組成親和分離材料組合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用親和柱分析全蛋白的方法，其特征是，步驟三中，所述級(jí)聯(lián)組合分析方法具體為取生物樣品全蛋白，通過(guò)第一根親和柱吸附洗脫，得到流穿和洗脫兩組樣品；將流穿和洗脫兩組樣品分別通過(guò)第二根親和柱，各自再次得到流穿和洗脫兩組樣品，此時(shí)共有四組樣品；依次類推，當(dāng)通過(guò)第n根親和柱后，共得到2n組樣品；所述n為> 2的自然數(shù)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用親和柱分析全蛋白的方法，其特征是，所述n為> 3的自然數(shù)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用親和柱分析全蛋白的方法，其特征是，步驟三中，所述串聯(lián)組合分析方法具體為取生物樣品全蛋白，通過(guò)第一根親和柱吸附洗脫，得到流穿和洗脫兩組樣品；流穿組樣品通過(guò)第二根親和柱吸附洗脫，得到流穿和洗脫兩組樣品，共三組樣品；依次類推，將每一次得到的流穿組樣品再次通過(guò)親和柱吸附洗脫，得到與之相應(yīng)的流穿和洗脫兩組樣品，在通過(guò)第m根親和柱后，共得到m+l組樣品；所述m為> 3的自然數(shù)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用親和柱分析全蛋白的方法，其特征是，所述m為> 5的自然數(shù)。
全文摘要
一種蛋白質(zhì)組技術(shù)領(lǐng)域的利用親和柱分析全蛋白的方法，包括如下步驟合成親和分離材料，得到親和分離材料庫(kù)；提取生物樣品全蛋白，從步驟一所得的親和分離材料庫(kù)中篩選出吸附蛋白種類占全蛋白20～80％的親和材料組合；從步驟二所得親和材料組合中選擇一種或多種分別填充親和柱，之后利用所得親和柱，采用級(jí)聯(lián)組合分析方法、串聯(lián)組合分析方法、或者級(jí)聯(lián)與串聯(lián)混合的組合分析方法分析生物樣品全蛋白，得到多組蛋白復(fù)雜度簡(jiǎn)化的樣品；對(duì)步驟三所得樣品分別進(jìn)行胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析，進(jìn)而完成生物樣品全蛋白的全蛋白分析。本發(fā)明的方法可克服高豐度蛋白淹沒(méi)低豐度蛋白信號(hào)的技術(shù)不足，提高極端性質(zhì)蛋白檢出率。
文檔編號(hào)G01N30/00GK101694485SQ20091030779
公開(kāi)日2010年4月14日 申請(qǐng)日期2009年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月27日
發(fā)明者李榮秀, 譚青喬 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué);