專利名稱：隱孢子蟲病毒衣殼蛋白抗體elisa檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種隱孢子蟲病毒衣殼蛋白抗體ELISA檢測(cè)方法及試劑盒，用于動(dòng)物及人隱孢子蟲感染血清抗體的檢測(cè)，本發(fā)明還公開了上述ELISA試劑盒的制備方法，屬于血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隱孢子蟲是普遍存在的胃腸道寄生性原蟲，能引起人類與家畜的腹瀉。含有隱孢子蟲卵囊的人類、家畜、寵物和野生動(dòng)物的糞便，直接威脅著人類飲用水安全，導(dǎo)致隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)。分子流行病學(xué)研究結(jié)果顯示出大多數(shù)人隱孢子蟲病是由人隱 ？包子蟲禾口微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum, C. parvum genotype II)弓|起的。目前，還沒有有效的方法治療人的隱孢子蟲感染。而現(xiàn)行的診斷方法直接鏡檢和染色鏡檢法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、檢出率低；間接熒光抗體試驗(yàn)和PCR方法對(duì)儀器設(shè)備和試劑的要求較高，因此建立一種快速、特異性較高且可直接判定結(jié)果的診斷方法是十分必要的。隱抱子蟲病毒(Cryptosporidium parvum virus, Cryspovirus, CSpV)是 1997 年Khramtsov在牛犢中分離出來的C. parvum卵囊中發(fā)現(xiàn)的，該病毒含有含長(zhǎng)的dsRNA (L-dsRNA)和短的dsRNA(S-dsRNA)，其中S-dsRNA編碼病毒衣殼蛋白。之后，Khramtsov 又發(fā)現(xiàn)所有C. hominis和C. parvum都含此dsRNA病毒，而Cryptosporidium其他種中不存在。因此可以把CSpV的分子特征和抗原特性作為檢測(cè)C. hominis和C. parvum卵囊的一個(gè)依據(jù)。而該病毒衣殼蛋白基因S-dsRNA就可作為對(duì)人具有感染性的隱孢子蟲(C. hominis 和C. parvum)與其它種類隱孢子蟲鑒別的一個(gè)分子標(biāo)記和含病毒蟲株的分離和鑒定的依據(jù)。目前尚無利用抗隱孢子蟲病毒檢測(cè)感染動(dòng)物血清中抗體的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種隱孢子蟲病毒衣殼蛋白血清中抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，解決了當(dāng)前糞便檢測(cè)靈敏度低、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的缺點(diǎn)，能檢測(cè)感染人的隱孢子蟲。本發(fā)明還提供了上述ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法，利用在大腸桿菌E. coli BL2KDE3)表達(dá)的S-dsRNA蛋白作為抗原，建立了檢測(cè)人的隱孢子蟲感染血清中抗體的間接ELISA方法。本發(fā)明的隱孢子蟲病毒衣殼蛋白血清中抗體ELISA檢測(cè)方法，其特征在于抗原為隱孢子蟲病毒衣殼重組蛋白，用于檢測(cè)血清中隱孢子蟲病毒抗體。本發(fā)明的隱孢子蟲病毒衣殼蛋白抗體間接ELISA檢測(cè)試劑盒，組成包括隱孢子蟲病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、隱孢子蟲病毒標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、酶標(biāo)二抗、包被病毒衣殼蛋白的酶標(biāo)板、底物顯色液、洗滌液、終止液、封閉液和酶標(biāo)物稀釋液及樣品稀釋液。上試劑盒的制備方法，其特征在于以隱孢子蟲病毒衣殼蛋白為抗原包被于酶標(biāo)板，隱孢子蟲病毒蛋白標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、底物顯色液、洗滌液、終止液、酶標(biāo)物稀釋液、樣品稀釋液和封閉液，組成ELISA試劑盒。所述抗原為隱孢子蟲病毒衣殼重組蛋白。本發(fā)明ELISA試劑盒檢測(cè)方法，包括以下步驟
(1)樣品前處理將被檢血清用樣品稀釋液1 200稀釋；
(2)用本發(fā)明的ELISA試劑盒檢測(cè)，向包被隱孢子蟲病毒衣殼重組蛋白的酶標(biāo)板孔中加入封閉液，再加入血清，孵育60分鐘，洗滌液洗滌，加入酶標(biāo)二抗，孵育60分鐘，洗滌液洗滌，加入顯色液孵育10分鐘，終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值；
(3)分析檢測(cè)結(jié)果
當(dāng)0D490nm ^ 0. 32時(shí)，樣品判定為陽性；當(dāng)0D490nm < 0. 268時(shí)，樣品判定為陰性。本發(fā)明的積極效果在于檢測(cè)的樣品為血清，檢測(cè)特異性高、靈敏度高、穩(wěn)定性好， 能檢測(cè)人隱孢子蟲的感染，適合于臨床的快速診斷和基層、農(nóng)村等流行病學(xué)調(diào)查大規(guī)模應(yīng)用。


圖1為重組蛋白的純化SDS-PAGE電泳圖中M:低分子量蛋白標(biāo)志物；1:純化的重組蛋白；M :DL 2000 Marker ；lanel :the protein purfiecL
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明的任何平行改變和改動(dòng)都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。實(shí)施例1
隱孢子蟲病毒衣殼蛋白CSpV表達(dá) 1材料和方法
1.1菌株隱孢子蟲病毒CSpV衣殼蛋白表達(dá)菌pET48a(+)-S。隱孢子蟲病毒CSpV衣殼蛋白的表達(dá)、純化及復(fù)性
將CSpV衣殼蛋白陽性表達(dá)菌按1 %的比例接種于500 mL LB培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)2 3 h，至菌液0D_nm值為0. 4 0. 6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h， 誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，收集菌液。按照Ni-NTA說明書進(jìn)行目的蛋白的純化。用含有8，6，4，2，0 mol/L尿素，0.5 mol/L L-Arg的PBS溶液進(jìn)行梯度透析復(fù)性。用BCA蛋白含量分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度。1.3鼠抗隱孢子蟲陽性血清的制備
取純化的2X107個(gè)微小隱孢子蟲卵囊溶于PBS中，超聲粉碎，期間間隔取樣，直至顯微鏡下看不見卵囊為止，12 000 r/min離心20 min，上清即為抗原。用BCA蛋白含量分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度。用該抗原腹腔免疫6只6、周齡的BALB/c小鼠(100 Pg/只)，按常規(guī)免疫程序制備陽性血清。結(jié)果
2. 1隱孢子蟲病毒CSpV衣殼蛋白的純化重組蛋白陽性表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，用Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白。純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，可見在37 ku處有一條單一的蛋白帶，見附圖1。實(shí)施例2
以重組蛋白為抗原建立檢測(cè)人的隱孢子蟲感染血清中抗體的間接ELISA方法 1材料和方法 1. 1、封閉劑的選擇
用重組蛋白包被酶標(biāo)板，4 0C過夜。以10 %胎牛血清、10 %正常兔血清、5 %脫脂奶粉為封閉劑，用PBST稀釋，每孔加200 UL, 37。C孵育2 h。洗滌后封閉2 h，分別加陽性血清對(duì)照和陰性血清對(duì)照，37 0C孵育1 h。洗滌，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37 °C孵育1 h。洗滌后加入底物，觀察顏色變化。顯色后，用2 mol/L 終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測(cè)定OD49tlIim值。同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照(P)、陰性對(duì)照(N)和空白對(duì)照，P/N > 2，判為陽性。選擇封閉效果最佳者。1. 2抗原和一抗工作濃度的確定
用不同濃度1、0. 5、0. 25、0. 125、0. 0125、0. 00 625 Pg/孔的重組蛋白包被酶標(biāo)板，用不同稀釋倍數(shù)1:200、1 :400、1:800、1:1 600,1:3 200的陽性血清孵育，進(jìn)行間接ELISA，確
定抗原和一抗最佳工作濃度。1.3 HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗工作濃度的確定
選擇最佳封閉劑，抗原和一抗按最佳工作濃度稀釋，將HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗稀釋為不同濃度 1:500、1:1 000、1:2 000,1:4 000,1:8 000,1:16 000。加底物緩沖液顯色，測(cè)定 OD49tlIim值，確定二抗最佳工作濃度。1. 4間接ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定
檢測(cè)12份健康小鼠血清，測(cè)定OD49tlIim值，計(jì)算平均值T和標(biāo)準(zhǔn)差SD。結(jié)果
2.1微小隱孢子蟲抗體檢測(cè)ELISA方法的建立
根據(jù)測(cè)定的結(jié)果，選擇最佳封閉液為5 %脫脂奶粉的PBST溶液，最佳抗原包被濃度 0. 25 μ g/孔、被檢血清稀釋度1 200，羊抗鼠二抗稀釋倍數(shù)1:2 000為最佳檢測(cè)條件。2.2間接ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定
經(jīng)間接ELISA檢測(cè)12份健康小鼠血清OD49tlIim值平均值T力0. 216，標(biāo)準(zhǔn)差SD為 0.026，因此陽性樣品檢出下限為I +3SD=0J94。為了減少假陽性和假陽性的出現(xiàn)，將臨界值加減一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為可疑區(qū)間。因此當(dāng)OD49tlIim ^ 0. 32時(shí)，樣品判定為陽性；當(dāng)0D49(1nm < 0. 268時(shí)，樣品判定為陰性；當(dāng)0. 268 ^ OD490Iim < 0. 32時(shí)，樣品判定為陽性，但是需要重新檢測(cè)。若重檢時(shí)，OD49tlIim ^ 0.四4，樣品判定為陽性；OD49tlIim < 0.四4，樣品判定為陰性(見附表1)。
附表1間接ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定實(shí)施例3
檢測(cè)人的隱孢子蟲感染血清中抗體間接ELISA試劑盒組裝
1、隱孢子蟲病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、隱孢子蟲病毒標(biāo)準(zhǔn)陰性血清
2、包被病毒重組蛋白酶標(biāo)板
3、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗
4、底物顯色液A液pH值為5.0的0. lmol/L醋酸鈉-檸檬酸緩沖液配制成0. 3%過氧化氫儲(chǔ)備液。B液四甲基聯(lián)苯胺，先制備成0. 2mg/mL溶液，用0. Imol/LpH值為5. 0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液配制成0. 2mg/L溶液。5.洗滌液pH值為7. 4的0. 1%吐溫-20的PBST緩沖液。6.酶標(biāo)物稀釋液:pH值為7. 4的0. 01%吐溫-20的PBST緩沖液。7.樣品稀釋液pH值為7. 4的0. 1%吐溫-20的PBST緩沖液，。8.終止液2mol/L 硫酸。試驗(yàn)例1
間接ELISA方法性能測(cè)定 1材料和方法 1.1材料
鼠抗安氏隱孢子蟲ip. mdersoni)陽性血清、鼠抗弓形蟲ij. gondii)陽性血清、鼠抗藍(lán)氏賈第蟲(P-Iamblia)陽性血清、鼠抗雞柔嫩艾美爾球蟲広tenella)陽性血清均按常規(guī)方法制備。1. 2 方法
1.2.1敏感性試驗(yàn)將鼠抗Cparra 陽性血清按1:200、1 :400、1:800、1:1 600,1:3
200倍比稀釋，應(yīng)用已建立的間接ELISA，確定其敏感性。1. 2. 2特異性試驗(yàn)以鼠抗C. parvum陽性血清和陰性血清為對(duì)照，用已建立的間接ELISA方法測(cè)定鼠抗C. andersoni陽性血清、鼠抗T. gondii陽性血清鼠、抗Iamblia 陽性血清、鼠抗五tenella陽性血清，觀察血清交叉反應(yīng)情況，來確定反應(yīng)的特異性。1. 2. 3重復(fù)性試驗(yàn)在同一塊板內(nèi)檢測(cè)7份陽性血清樣品，每份血清樣品重復(fù)3 孔，按照間接ELISA的操作程序進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算每份血清樣品OD49tlIim值的變異系數(shù)(CV)， 以檢驗(yàn)批內(nèi)被檢測(cè)樣品的重復(fù)性；另取3塊用純化重組蛋白包被好的酶標(biāo)板，在相同條件下檢測(cè)7份陽性血清樣品，按照間接ELISA的操作程序進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算同一份血清樣品在不同板間OD49tlIim值的變異系數(shù)(CV)，以檢驗(yàn)批間被檢測(cè)樣品的重復(fù)性。附表2 ELISA檢測(cè)的敏感性
權(quán)利要求
1.一種隱孢子蟲病毒衣殼蛋白血清中抗體ELISA檢測(cè)方法，其特征在于抗原為隱孢子蟲病毒衣殼重組蛋白，可檢測(cè)血清中隱孢子蟲病毒抗體。
2.一種隱孢子蟲病毒衣殼蛋白抗體間接ELISA檢測(cè)試劑盒，組成包括隱孢子蟲病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、隱孢子蟲病毒標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、酶標(biāo)二抗、包被病毒衣殼蛋白的酶標(biāo)板、底物顯色液、洗滌液、終止液、封閉液和酶標(biāo)物稀釋液及樣品稀釋液。
3.如權(quán)利要求2所試劑盒的制備方法，其特征在于以隱孢子蟲病毒衣殼蛋白為抗原包被于酶標(biāo)板，隱孢子蟲病毒蛋白標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、底物顯色液、洗滌液、終止液、酶標(biāo)物稀釋液、樣品稀釋液和封閉液，組成ELISA試劑盒。
4.權(quán)利要求3所述ELISA試劑盒的制備方法，其特征在于所述抗原為隱孢子蟲病毒衣殼重組蛋白。
5.ELISA試劑盒檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)樣品前處理將被檢血清用樣品稀釋液1 200稀釋；(2)用權(quán)利要求2所述的ELISA試劑盒檢測(cè)，向包被隱孢子蟲病毒衣殼重組蛋白的酶標(biāo)板孔中加入封閉液，再加入血清，孵育60分鐘，洗滌液洗滌，加入酶標(biāo)二抗，孵育60分鐘，洗滌液洗滌，加入顯色液孵育10分鐘，終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值；(3)分析檢測(cè)結(jié)果當(dāng)0D490nm ^ 0. 32時(shí)，樣品判定為陽性；當(dāng)0D490nm < 0. 268時(shí)，樣品判定為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種隱孢子蟲病毒衣殼蛋白抗體ELISA檢測(cè)方法及試劑盒，用于動(dòng)物及人隱孢子蟲感染血清抗體的檢測(cè)，以隱孢子蟲病毒衣殼蛋白為抗原包被于酶標(biāo)板，隱孢子蟲病毒蛋白標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、底物顯色液、洗滌液、終止液、酶標(biāo)物稀釋液、樣品稀釋液和封閉液，組成ELISA試劑盒。本發(fā)明的積極效果在于檢測(cè)的樣品為血清，檢測(cè)特異性高、靈敏度高、穩(wěn)定性好，能檢測(cè)人隱孢子蟲的感染，適合于臨床的快速診斷和基層、農(nóng)村等流行病學(xué)調(diào)查大規(guī)模應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/535GK102221619SQ20111015090
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月7日
發(fā)明者任文陟, 刁玉梅, 宮鵬濤, 張國才, 張楠, 張西臣, 李建華, 李淑紅, 李 赫, 楊舉, 高華義 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)