專利名稱：膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及表觀遺傳學研究領域，尤其是涉及一種膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法及應用。
背景技術：
膜性腎病是以基底膜彌漫性增厚及上皮下免疫復合物沉積為特征，腎小球也表現出獨特的形態學特征:比如，基底膜增厚、顆粒狀IgG在腎小球毛細血管袢沉積或呈電子致密物沉積在上皮下組織。膜性腎病發生在世界各地，沒有種族、年齡及性別的差異。目前為止，也有不少關于膜性腎病發病機制的研究，但是仍沒有找到膜性腎病特異性的生物標志物。迄今為止，膜性腎病的組蛋白甲基化狀態改變也不清楚。
對膜性腎病(麗)的發病機制中所涉及的細胞和分子層面的理解來自對大鼠Heymann腎炎模型的研究，這個模型與人類MN的臨床及病理特點非常類似。大量的文獻證實有不少關于人類MN的發病機制的研究，但是MN的特異生物標志物仍然沒有找到。發明內容
基于此，有必要提供一種用于研究膜性腎病特異性生物標志物的膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法及應用。
一種膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，包括如下步驟:
分別采集膜性腎病患者和健康對照組的外周血單個核細胞；
室溫下使用1%的甲醛溶液分別對所述外周血單個核細胞進行交聯處理，然后用PBS溶液進行洗滌，再加入IM的甘氨酸溶液終止交聯；
分別收集交聯后的外周血單個核細胞，用勻漿器進行處理裂解細胞核，收集裂解物后溶解懸浮于緩沖液中，使用H3K9三甲基化(H3K9me3)抗體沉淀所述緩沖液中的裂解物，得到的DNA與抗體的復合物用蛋白酶K于65°C處理后得到純化的DNA片段；
使用Illumina樣品準備包對所述純化的DNA片段進行末端修復、添加接頭和片段大小選擇處理，選擇除去接頭后大小為IOObp的DNA片段進行測序，將測序得到的序列與bosTau數據庫的參考基因組進行比對，允許兩個堿基的錯配，刪除不能比對到參考基因組的序列，然后使用MACS法 對比對后的序列進行分析確定轉錄因子的結合位點、ChlP-seq數據集以及H3K9三甲基化對應的DNA富集區，使用MEME軟件對MACS法的分析結果進行處理得到新的與H3K9三甲基化對應的DNA模體，并依據所述DNA模體找到與H3K9三甲基化相關的基因；以及
對比膜性腎病患者和健康對照組的所述H3K9三甲基化相關的基因得到所述膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因。
在其中一個實施例中,所述測序過程使用的是Solexa/Illumina2G測序儀對除去接頭后大小為IOObp的DNA片段進行測序。
在其中一個實施例中，所述將測序得到的序列與bosTau數據庫的參考基因組進行比對是使用短讀對準儀Bowtie將測序得到序列與bosTau數據庫的參考基因組進行比對。
在其中一個實施例中，所述使用MACS法對比對后的序列進行分析過程中MACS參數為:帶寬為273 ;基因組大小為2.70e+09 ;標簽大小為49 ;模型折疊數據是10，30 ；p值為1.00e_05o
上述膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法通過使用染色質免疫沉淀-高通量(ChlP-seq)測序來分析膜性腎病患者外周血單個核細胞(PBMCs)的組蛋白H3K9三甲基化狀態的改變，得到膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因，深入研究這些差異表達基因將有助于進一步闡明膜性腎病的發病機理，為膜性腎病的診斷和治療提供新途徑。上述膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法設計合理可行，能夠有效地協助建立一種膜性腎病差異表達基因的圖譜模型，獲取作為中間結果的膜性腎病的相關信息。
一種基因檢測芯片，所述基因檢測芯片上固定有上述方法得到的膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因。
在其中一個實施例中，所述差異表達基因為DGCR6、SNX16、CNTN4、BIRC2及BIRC3中的至少一種。
通過上述基因檢測芯片，可以為初步診斷膜性腎病提供中間結果信息，檢測過程方便，不需要使用傳統的繁雜的檢測步驟，但由于膜性腎病往往是一種綜合病征，獲取這些中間結果之后還需要結合其他檢測數據才能診斷為是否是膜性腎病。


圖1為H3K9三甲基化多個富集區(peaks)的分布，其中橫軸代表富集區的長度，縱軸代表富集區的數目；
圖2為富集區相關基因在全基因組內的分布；
圖3為富集區相關基因GO分析結果圖，其中，橫軸代表GO項，左縱軸代表與GO相關的基因比例，右縱軸代表與GO相關的基因數量；
圖4為DNA motif的示意圖,其中，橫軸表示該motif的位點,縱軸總的高度反應該motif的保守性，每個堿基的高度代表該堿基出現的頻率。
具體實施方式
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下面主要結合附圖及具體實施例對膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法及應用做進一步詳細的說明。
一實施方式的膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，包括如下步驟:
步驟SllO:分別采集膜性腎病患者和健康對照組的外周血單個核細胞。
步驟S120:室溫下使用1%的甲醛溶液分別對外周血單個核細胞進行交聯處理，然后用PBS溶液進行洗滌，再加入IM的甘氨酸溶液終止交聯。
步驟S130:分別收集交聯后的外周血單個核細胞，用勻漿器進行處理裂解細胞核，收集裂解物后溶解懸浮于緩沖液中，使用H3K9三甲基化抗體沉淀緩沖液中的裂解物，得到的DNA與抗體的復合物用蛋白酶K于65°C處理后得到純化的DNA片段。
步驟S140:使用Illumina樣品準備包(Illumina公司產品)對純化的DNA片段進行末端修復、添加接頭和片段大小選擇處理，選擇除去接頭后大小為IOObp的DNA片段進行測序，將測序得到的序列與bosTau數據庫的參考基因組進行比對，允許兩個堿基的錯配，刪除不能比對到參考基因組的序列，然后使用MACS法對比對后的序列進行分析確定轉錄因子的結合位點、ChlP-seq數據集以及H3K9三甲基化對應的DNA富集區，使用MEME軟件對MACS法的分析結果進行處理得到新的與H3K9三甲基化對應的DNA模體，并依據DNA模體找到與H3K9三甲基化相關的基因。
其中，測序過程使用的是Solexa/Illumina2G測序儀對除去接頭后大小為IOObp的DNA片段進行測序。將測序得到的序列與bosTau數據庫的參考基因組進行比對是使用短讀對準儀Bowtie將測序得到序列與bosTau數據庫的參考基因組進行比對。使用MACS法對比對后的序列進行分析過程中MACS參數為:帶寬為273 ;基因組大小(genome size)為2.70e+09 ;標簽大小(tag size)為49 ;模型折疊數據(model fold)是10，30cutoff)為 1.00e-05。
步驟S150:對比膜性腎病患者和健康對照組的H3K9三甲基化相關的基因得到膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因。
具體在本實施方式中得到5個較大差異表達的基因，分別是表達上調的DGCR6、SNX16、CNTN4和BIRC2，以及一個表達下調的BIRC3。
上述膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法通過使用染色質免疫沉淀-高通量測序(ChlP-seq)來分析膜性腎病患者外周血單個核細胞(PBMCs)的組蛋白H3K9三甲基化狀態的改變，得到膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因，深入研究這些差異表達基因水平將有助于進一步闡明膜性腎病的發病機理，為膜性腎病的診斷和治療提供新途徑。上述膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法設計合理可行，能夠有效地協助建立一種膜性腎病差異表達基因的圖譜模型，獲取作為中間結果的膜性腎病的相關信肩、O
此外，本實施方式還提供了一種基因檢測芯片，在該基因檢測芯片上固定有上述方法得到的膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因作為檢測探針。
優選的，上述差異表達基因為DGCR6、SNX16、CNTN4、BIRC2及BIRC3中的至少一種。
通過上述基因檢測芯片可以檢測待測患者的相關基因的表達水平，獲得初步診斷膜性腎病提供中間結果信息，檢測過程方便，不需要使用傳統的繁雜的檢測步驟，但由于膜性腎病往往是一種綜合病征，獲取這些中間結果之后還需要結合其他檢測數據才能診斷為是否是膜性腎病。
以下為具體實施例部分:
1.材料與方法
1.1樣本的采集
本實施例共有20個樣本，見表I，其中， 疾病組10人，健康對照組10人。疾病組患者來源于桂林市第181醫院腎臟科，是經腎活檢確診為膜性腎病的患者，并且排除了炎癥、糖尿病及其他疾病的干擾。健康對照組與疾病組年齡、種族、性別相匹配。本研究征得了桂林市第181醫院倫理委員會的同意。
表I疾病組和對照組的人口學和臨床特征
權利要求
1.一種膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，其特征在于，包括如下步驟: 分別采集膜性腎病患者和健康對照組的外周血單個核細胞； 室溫下使用1%的甲醛溶液分別對所述外周血單個核細胞進行交聯處理，然后用PBS溶液進行洗滌，再加入IM的甘氨酸溶液終止交聯； 分別收集交聯后的外周血單個核細胞，用勻漿器進行處理裂解細胞核，收集裂解物后溶解懸浮于緩沖液中，使用H3K9三甲基化抗體沉淀所述緩沖液中的裂解物，得到的DNA與抗體的復合物用蛋白酶K于65°C處理后得到純化的DNA片段； 使用Illumina樣品準備包對所述純化的DNA片段進行末端修復、添加接頭和片段大小選擇處理，選擇除去接頭后大小為IOObp的DNA片段進行測序，將測序得到的序列與bosTau數據庫的參考基因組進行比對，允許兩個堿基的錯配，刪除不能比對到參考基因組的序列，然后使用MACS法對比對后的序列進行分析確定轉錄因子的結合位點、ChlP-seq數據集以及H3K9三甲基化對應的DNA富集區，使用MEME軟件對MACS法的分析結果進行處理得到新的與H3K9三甲基化對應的DNA模體，并依據所述DNA模體找到與H3K9三甲基化相關的基因；以及 對比膜性腎病患者和健康對照組的所述與H3K9三甲基化相關的基因得到所述膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因。
2.如權利要求1所述的膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，其特征在于，所述測序過程使用的是Solexa/Illumina2G測序儀對除去接頭后大小為IOObp的DNA片段進行測序。
3.如權利要求1所述的膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，其特征在于，所述將測序得到的序列與bosTau數據庫的參考基因組進行比對是使用短讀對準儀Bowtie將測序得到序列與bosTau數據庫的參考基因組進行比對。
4.如權利要求1所述的膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，其特征在于，所述使用MACS法對比對后的序列進行分析過程中MACS參數為:帶寬為273 ;基因組大小為2.70e+09 ;標簽大小為49 ;模型折疊數據是10，30 ；p值為1.00e-05。
5.一種基因檢測芯片，其特征在于，所述基因檢測芯片上固定有如權利要求1 4中任一項所述的方法得到的膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因。
6.如權利要求5所述的基因檢測芯片，其特征在于，所述差異表達基因為DGCR6、SNX16、CNTN4、BIRC2 及 BIRC3 中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，其通過使用染色質免疫沉淀-高通量(ChIP-seq)測序來分析膜性腎病患者外周血單個核細胞(PBMCs)的組蛋白H3K9三甲基化狀態的改變，得到膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因，深入研究這些差異表達基因將有助于進一步闡明膜性腎病的發病機理，為膜性腎病的診斷和治療提供新途徑。上述膜性腎病三甲基化狀態的差異表達基因的分析方法設計合理可行，能夠有效地協助建立一種膜性腎病差異表達基因的圖譜模型，獲取作為中間結果的膜性腎病的相關信息。
文檔編號C40B40/08GK103205490SQ201310076679
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月11日 優先權日2013年3月11日
發明者眭維國, 戴勇, 何慧燕 申請人:眭維國