專利名稱：基于非損傷微測技術的動態離子流篩選抗旱水稻的方法
技術領域：
本發明涉及抗旱植株的篩選方法，具體地說，涉及一種基于非損傷微測技術的動態離子流篩選抗旱水稻的方法。
背景技術：
全球水資源短缺，地下水位持續下降導致全球干旱災害頻繁發生。而我國是農業大國，干旱嚴重危害我國的農業生產和糧食安全，制約我國的農業發展。據國家防汛抗旱總指揮部發布統計數據2009、2010、2011連續三年受干旱影響損失嚴重。干旱造成了國民收入的大量損失，嚴重制約了我國經濟社會的發展。因此，尋找或加速培育抗旱作物新品種， 有助于穩定和促進我國糧食生產。水稻作為我國的主要糧食作物之一，播種面積很大，但是隨著近些年來干旱災害的頻繁發生育種家也開始關注旱稻育種，而旱稻育種缺少直接而有效的抗旱材料篩選工具，非損傷微測技術作為無損、快速的檢測方法用于旱稻的篩選是比較好的直接工具，利用該技術檢測不同品種在干旱條件下對K+的吸收能力可以快速篩選抗旱水稻品種。Maria(2008)在研究氣孔關閉時候發現，K+饑餓引起氣孔關閉，導致生理學紊亂， 有可能使許多作物在水分脅迫下脫水(Mari' a Benlloch-Gonza' lez,Octavio Arquero, Jose ‘ Mari ‘ a Fournier, Diego Barranco, Manuel Benlloch. K+Starvation inhibits water-stress-induced stomatal closure (鉀離子饑餓抑制水分脅迫誘導的氣孔關閉).Journal of Plant Physiology, 2008,165 :623-630.)；由此推斷，K+可能對植物的耐旱性有所幫助。&ianasiri (19%)證實了高粱在干旱田間下除了積累K+和可溶性糖外Cl_也對維持細胞的膨壓起到了重要作用(Gnanasiri S. Premachandra, Daniel Τ. Hahn, David Rhodes and Robert J. J oly. Leaf water relations and solute accumulation in two grain sorghum lines exhibiting contrasting drought tolerance.(兩種高粱株系的葉片水勢關系和溶質積累表現的不同耐旱性)Journal of Experimental Botany 1995， 46(12) :1833-1841)；上述研究表明，可溶性小分子物質和無機離子在植物滲透調節中具有重要作用，因此用K+的吸收能力來判斷植物抗旱能力成為可能。非損傷微測技術(Non-InvasiveMicro-Test ^Technology，NMT)，是通過微電極和微傳感器獲取離子和分子的信號，基于Nernst方程和Fick' s第一擴散定律計算離子和分子的濃度和流速的技術，精度達到pmol CnT2s-1,該技術是一項新型的無損檢測技術，能夠以單細胞、細胞層、組織、離體器官為檢測對象，來檢測離子、分子并且探知其流動速率及其方向，檢測時不與被測材料接觸，植物不用去除細胞壁，進行數小時、乃至十數小時以上的連續測量，能夠得到時時的分子和離子流動的數據，從而判知被測對象生理狀況。近幾年來許多科學家通過這種技術研究了植物在不同環境下的離分子離子變化情況，取得了較好的成
果 ο張智猛等Q010)通過研究花生種子萌發期在干旱處理下抗旱性評價指標(芽干重、根干重、生芽率、生根率等)篩選抗旱花生新品種(張智猛等，花生品種芽期抗旱性指標篩選與綜合性評價，中國農業科技導報，2010，12(1) :85-91)；劉鵬等(2009)，利用耐寒指數和抗旱指數評價方法篩選玉米抗旱新品種(劉鵬等，玉米品種抗旱性指標篩選的研究，吉林農業科學，2009，34 ) =21-24,34)；王麟等(2009)，利用抗旱指數評價方法篩選抗旱水稻品種(王麟等，黑龍江省抗旱水稻品種(系)的篩選，黑龍江省農業科學，2009，4: 沈-29)。以上方法不能實現活體生物材料的動態檢測，對珍稀材料造成浪費。因此，開發新的篩選抗旱作物的方法具有非常重要的意義。

發明內容
本發明旨在為水稻抗旱育種和水稻大田生產提供一種快速的、無損的篩選抗旱水稻的新方法。為了實現本發明目的，本發明的一種基于非損傷微測技術的動態離子流篩選抗旱水稻的方法，其是利用微觀動態離子流檢測技術檢測水稻根系K+的吸收能力，通過檢測 PEG6000溶液處理前后幼苗的K+吸收變化篩選出抗旱水稻。本發明的目的是采用以下的技術方案來實現的。依據本發明提供的，待水稻長至 1葉1心期，用PEG6000溶液進行處理，利用微觀動態離子流檢測技術檢測處理前后幼苗的 K+吸收流速和流向，篩選出抗旱水稻。優選地，使用的PEG6000溶液濃度為10-20%，更優選為20%。前述的方法，測試液中PEG6000溶液濃度為10 20%，優選為20%。前述的方法，微觀動態離子流檢測技術中測試緩沖液中的測試離子濃度為 0. 05 0. 15mM。前述的方法，檢測使用的水稻處于1葉1心期，測量位置為距所述水稻苗根尖 200 500 μ m的根尖分生區的外表面20 40 μ m處。具體地，前述方法包括以下步驟(1)向微電極中灌入離子灌充液至充滿所述電極尖端0.8 1.5cm，再將電極前端吸入相應的測試離子交換劑；( 將經過步驟(1)處理后的電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座，并放入校正液中校正；(3)取待測水稻苗， 將其根部先放在測試緩沖液中平衡30min左右，再用校正后的電極對待測水稻苗進行檢測 10 15min ； (4)對檢測結果進行處理和分析。其中，步驟(1)所述的灌充液為80 140mM KCl ；步驟⑵所述的校正液為 0. 05 0. 15mM KCl和0. 5 1. 5mM KCl ；步驟(3)所述的測試緩沖液為:K+ :0. 05 0. 15mM KCl、0. 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mM MgCl2、0. 3 0. 6mM NaCl、0. 1 0. 3mM Na2SO4 和 0. 2 0. 5mM MES0前述方法中步驟(1)電極的前端吸入測試離子交換劑的長度為K+ :100 200μπι。前述方法中校正后電極的能斯特方程計算理想值為K+ 56 60mV ；前述方法中所述K+離子流的流速為40 500pmol. cm—2. s\本發明是基于非損傷微測技術，通過對水稻和旱稻的動態K+流檢測來篩選抗旱水稻品種，實現對水稻抗旱性的無損、快速、活體檢測、檢測時間在10-15min左右，耗時短，檢測準確性高，抗旱性幼苗與不抗旱性幼苗凈離子流對比差異明顯，評價方法簡單可靠，為水稻抗旱育種及水稻大田生產提供了直接而快速的篩選工具。


圖1為本發明基于非損傷微測技術的動態離子流篩選抗旱水稻的實驗過程圖。圖2為水稻品種日本晴和巴西旱稻經PEG6000處理前后K+動態吸收變化。其中， RBQ 日本晴；RBQ+PEG 日本晴+PEG ；BXHD 巴西旱稻；BXHD+PEG 巴西旱稻+PEG。圖3為水稻品種日本晴和巴西旱稻經PEG6000處理前后K+凈離子流的比較。其中，RBQ 日本晴；RBQ+PEG 日本晴+PEG ；BXHD 巴西旱稻；BXHD+PEG 巴西旱稻+PEG。圖4為水稻品種日本晴和巴西旱稻幼苗經20% PEG6000處理3天后的生長情況。圖5所示為利用微電極檢測時，電極距離根尖的位置。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。其中水稻品種日本晴由中國農業大學農學院惠贈，巴西旱稻的種子由北京農業信息技術研究中心保存。實施例1.實驗方法實驗材料及培養條件為水稻品種日本晴和巴西旱稻，種子經過次氯酸鈉消毒蒸餾水清洗后，加入適當水浸種2小時，置于地墊濕潤濾紙的培養皿上25°C光照培養箱內萌發，發芽后加入hogland營養液培養，生長至1葉1心期時開始加入PEG6000處理，測試處理前后的離子流。2.實驗儀器及耗材離子流檢測用非損傷微測系統(BIO-OOlBJoungerUSA Sci. &Tech. Corp.，USA)， 系統軟件imFlux，微電極采用尖端直徑為2-4 μ m的玻璃微電極。3.實驗試劑及溶液(1)液態離子交換劑包括K+ ^-^ Potassium ionophore I—cocktail A ；Sigma-Aldrich,Louis,M0 63103, USA ；(2)測試緩沖液成分K+離子0. ImM KC1、0. ImM CaCl2、0. ImM MgCl2、0. 5mM NaCl、0. 2mM Na2SO4^O. 3mM MES(3)電極灌充液K+: IOOmM KCl(4)校正液(濃度相差十倍也是必須的)K+:0. ImM 和 ImM KCl4.實驗內容及方法實驗過程如圖1所示。從電極末端灌入Icm左右的相應測試離子的灌充液至電極尖端充滿，前端吸入適當長度(K+:150-200 μ m)離子交換劑(LIX)。將電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座。 參比電極為固體低滲漏性電極(WPI)。電極在相應的校正液中校正，其能斯特理想值是55-60mVo測試前將材料在相應的測試液中平衡30-50min。然后在距離水稻根尖分生區(距離根尖300 μ m左右)外表面30 μ m的地方振動檢測(圖5)，每個樣品檢測10-15min。5.數據處理離子流處理基于Fick' s擴散定律，并通過在線軟件MageFlux_3DIon Flux Plotting System(http://www. xuyue. net/mageflux/)計算得出。由大于 3 次獨立實驗所得到的數據做統計分析，利用EXcel2003分析作圖。6.實驗結果評價實驗結果如圖2和圖3所示。干旱敏感型水稻日本晴幼苗未處理前對K+吸收幅度很大，離子吸收平均流速達-74. 86pmol cm^s"1 ；加入20 % PEG6000處理30min之后K+吸收平均流速幅度降低至-29. 69pmol cnT2、1。干旱產生的滲透脅迫引起了日本晴根系對K+吸收幅度的迅速減小， 細胞內的K+含量降低，造成細胞膨壓和滲透勢的改變，最終水稻枯萎死亡(圖4)。干旱耐受型的巴西旱稻幼苗未處理前對K+吸收幅度很小，離子吸收平均流速為-15. 52pmol cm-2s-l ；加入20% PEG6000處理30min之后K+吸收平均流速幅度迅速升高至-79. 2lpmol cm-k-l，可作為抗旱水稻評價指標。短時間內(30min) PEG6000處理后巴西旱稻對K+的吸收幅度較處理前大幅增多，這是由于巴西旱稻能夠通過吸收K+穩定因干旱造成的滲透勢變化，保證細胞的膨壓，維持正常代謝活動，從而提高了抗旱性。綜上，干旱敏感型水稻在干旱條件下細胞內K+流失，細胞膨壓下降，體現了對干旱的敏感性；而干旱耐受型巴西旱稻能夠通過吸收K+維持細胞的滲透平衡，保證細胞的膨壓， 表現了很好的抗旱性，因此利用干旱條件下細胞對K+的吸收能力作為水稻抗旱植株的篩選是一種有效迅速而有效的手段。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種基于微觀動態離子流檢測技術篩選抗旱水稻的方法，其特征在于，利用微觀動態離子流檢測技術檢測水稻根系K+的吸收能力，通過檢測PEG6000溶液處理前后幼苗的K+ 吸收變化篩選出抗旱水稻。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，待水稻長至1葉1心期，用PEG6000溶液進行處理，利用微觀動態離子流檢測技術檢測處理前后幼苗的K+吸收流速和流向，篩選出抗旱水稻。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，測試液中PEG6000溶液濃度為10 20%。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，測試液中PEG6000溶液濃度為20%。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，微觀動態離子流檢測技術中測試緩沖液中的測試離子濃度為0. 05 0. 15mM。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，檢測使用的水稻處于1葉1心期，測量位置為距所述水稻苗根尖200 500 μ m的根尖分生區的外表面20 40 μ m處。
7.根據權利要求1 6任一項所述的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)向微電極中灌入離子灌充液至充滿所述電極尖端0.8 1. 5cm，再將電極前端吸入相應的測試離子交換劑；(2)將經過步驟(1)處理后的電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座，并放入校正液中校正；(3)取待測水稻苗，將其根部先放在測試緩沖液中平衡30min，再用校正后的電極對待測水稻苗進行檢測10 15min ；(4)對檢測結果進行處理和分析；其中，步驟⑴所述的灌充液為80 140mM KCl ；步驟(2)所述的校正液為0. 05 0. 15mM KCl和0. 5 1. 5mM KCl ；步驟(3)所述的測試緩沖液為:K+ :0. 05 0. 15mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mM MgCl2、0. 3 0. 6mM NaCU 0. 1 0. 3mM Na2SO4 和 0· 2 0. 5mM MES。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(1)電極的前端吸入測試離子交換劑的長度為K+ 100 200 μ m。
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，校正后電極的能斯特方程計算理想值為 K+ 56 60mV ；
10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述K+離子流的流速為40 500pmol.-2 -1 cm . s ο
全文摘要
本發明提供了一種基于微觀動態離子流檢測技術的篩選抗旱水稻的方法，其是利用微觀動態離子流檢測技術檢測水稻根系K+的吸收能力，通過檢測PEG6000溶液處理前后幼苗的K+吸收變化篩選出抗旱水稻。本發明能夠實現對水稻抗旱性的無損、快速、活體檢測、檢測時間在10-15min左右，耗時短，檢測準確性高，抗旱性幼苗與不抗旱性幼苗凈離子流對比差異明顯，評價方法簡單可靠，為水稻抗旱育種及水稻大田生產提供了直接而快速的篩選工具。
文檔編號G01N27/416GK102507701SQ20111036398
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者喬曉軍, 朱大洲, 王曉冬, 羅斌, 陳立平, 高權 申請人:北京農業智能裝備技術研究中心