專利名稱：一種檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法。
背景技術(shù)：
免疫層析是出現(xiàn)于80年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方式，它往往以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)發(fā)生高特異、高親和性的免疫反應(yīng)，層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域(檢測帶)，通過酶反應(yīng)或直接運(yùn)用可目測的標(biāo)記物(如膠體金)而得到直觀的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象(如顯色)。而游離標(biāo)記物則越過檢測帶， 達(dá)到與結(jié)合標(biāo)記物自動分離之目的。免疫層析技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療檢測中。國內(nèi)外現(xiàn)有的商品供應(yīng)及文獻(xiàn)報(bào)道的檢測項(xiàng)目主要包括以下方面違禁藥物檢測(苯丙胺、可卡因、大麻、嗎啡、海洛因等)、傳染病病原檢測(梅毒螺旋體、淋球菌、沙眼衣原體、幽門螺桿菌等)、激素檢測、寄生蟲、腫瘤標(biāo)記物、心血管病檢測標(biāo)志物等。免疫層析技術(shù)常見的示蹤粒子有膠體金，乳膠，膠體硒、明膠等，其中運(yùn)用最成功的標(biāo)記物為膠體金。由于正常情況下血清IgE抗體僅在ng/ml水平，用常規(guī)測定IgG或IgM的凝膠擴(kuò)散法檢測不出IgE，因而目前常采用免疫層析法來進(jìn)行檢測。然而，現(xiàn)有的進(jìn)行血清IgE抗體檢測的免疫層析法將特異性過敏原直接連接到標(biāo)記物乳膠微球上形成過敏原-乳膠微球復(fù)合物，相當(dāng)于一比一的連接關(guān)系，靈敏度低，用于檢測ng/ml水平的特異性IgE抗體時， 檢測結(jié)果顏色暗淡，不容易觀察。生物素-親合素系統(tǒng)(Biotin-Avidin-System，BAS)是70年代末發(fā)展起來的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。近年大量研究證實(shí)，生物素-親合素系統(tǒng)幾乎可與目前研究成功的各種標(biāo)記物結(jié)合。生物素-親合素與標(biāo)記試劑高親合力的牢固結(jié)合及多級放大效應(yīng)，使BAS免疫標(biāo)記和有關(guān)示蹤分析更加靈敏。它已成為目前廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種改進(jìn)的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案
一種檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法，其首先將樣品墊、結(jié)合墊、包被有檢測線和質(zhì)控線的層析膜、吸水墊依次相互交錯粘貼在底板上，構(gòu)成免疫層析試紙條，然后向樣品墊中滴加血液樣本進(jìn)行檢測，其特征在于所述結(jié)合墊上結(jié)合有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球，所述方法利用血液樣本中的過敏原特異性IgE抗體能夠與過敏原-生物素-親合素-乳膠微球結(jié)合形成結(jié)合物，以及所形成的結(jié)合物能夠在檢測線處被捕獲而呈現(xiàn)色帶來實(shí)現(xiàn)對過敏原特異性IgE抗體的定性檢測。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案所述的過敏原-生物素-親合素-乳膠微球通過如下方法制備首先將過敏原與生物素連接形成過敏原-生物素，將親合素與乳膠微球連接形成親合素-乳膠微球，然后再將所形成的過敏原-生物素與所形成的親合素-乳膠微球連接，即得。根據(jù)本發(fā)明的一個具體方面，過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的具體制備過程如下
①將過敏原溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，將生物素溶于去離子水中，然后將生物素的水溶液滴加至過敏原的磷酸鹽緩沖液中，在室溫下攪拌，得到含有過敏原-生物素的溶液；
②將親合素溶液溶于脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液(MES)中，將乳膠微球儲存液劇烈震蕩， 取出微球于離心管中，離心，除去上清，加入脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液，劇烈震蕩，加入溶有親合素的脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液和新鮮配制的碳二亞胺溶液(EDC)，劇烈震蕩，使混合均勻，在室溫暗室孵育20 40分鐘，加入吐溫-20，離心，除去上清，加入十二烷基硫酸鈉水溶液(SDS)溶解微球，劇烈震蕩，離心，除去上清，加入磷酸鹽緩沖液溶解微球，劇烈震蕩，得含有親合素-乳膠微球的溶液；
③將步驟①制得的含有過敏原-生物素的溶液加入步驟②制得的含有親合素-乳膠微球的溶液中，輕輕攪拌直至微球全部懸浮起來，然后在室溫下持續(xù)攪拌10 15小時，即得含有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的溶液。根據(jù)本發(fā)明，通過噴涂所述含有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的溶液使過敏原-生物素-親合素-乳膠微球結(jié)合到結(jié)合墊上。優(yōu)選地，在樣品墊上包被有抗紅細(xì)胞抗體。層析膜上的檢測線通過包被鼠抗人IgE 單克隆抗體形成。質(zhì)控線通過包被羊抗人IgE的多克隆抗體形成。層析膜優(yōu)選為硝基纖維素膜(NC膜)。優(yōu)選地，所述的乳膠微球?yàn)榫郾揭蚁┪⑶颉１景l(fā)明還涉及生物素-親合素放大系統(tǒng)在免疫層析法中的應(yīng)用。由于以上技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明將生物素-親合素系統(tǒng)應(yīng)用于連接過敏原和乳膠微球，能夠?qū)崿F(xiàn)在一個過敏原上連接多個乳膠微球，從而使檢測特異性IgE抗體的靈敏度提高，檢測結(jié)果明顯，容易觀察。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。實(shí)施例1
本實(shí)施例提供一種血清IgE抗體的免疫層析法，包括如下步驟 (1 )、制備過敏原-生物素-親合素-乳膠微球，具體過程如下 ①過敏原連接生物素將過敏原溶于IOOmM的PBS (pH 8. 0)中，獲得lmg/ml的過敏原溶液。將生物素溶于去離子水中，制得ang/ml的生物素溶液，將該生物素溶液緩慢滴加到過敏原溶液中，同時攪拌溶液，并使容器置于25°C水浴中。滴加完畢，密封容器，在25°C水浴中持續(xù)攪拌60士5分鐘，得含有過敏原-生物素的溶液。②親合素連接乳膠微球?qū)⒂H合素溶于Iml的IOOmM MES (pH 4. 5)溶液中，獲得 lmg/ml的親合素溶液。將微球儲存液劇烈震蕩20s，取出5. OX IO6的微球于Eppendorf離心管中，以8000g-10，OOOg的轉(zhuǎn)速離心l-2min,除去上清后加0. 5ml的100M MES (pH 4. 5)， 劇烈震蕩20s，加入Iml親合素溶液，加入25 μ 1新鮮配制的10mg/ml的EDC，劇烈震蕩，使其混合均勻，室溫暗室孵育30min,加入1. Oml 0. 02%吐溫-20，以8000g-10, OOOg的轉(zhuǎn)速離心Ι-aiiin，除去上清，獲得偶聯(lián)的微球，將偶聯(lián)的微球溶于1.0ml 0. 1%SDS，劇烈震蕩，以 8000g-10, OOOg的轉(zhuǎn)速離心l-2min，除去上清，使微球溶于IOOmM的PBS (pH 8. 0)，劇烈震蕩 20s，計(jì)數(shù)后置于4°C冰箱保存。③過敏原-生物素和親合素-乳膠微球的連接將Iml過敏原-生物素溶液，加入放置有等體積的親合素-乳膠微球的容器中；用玻璃棒輕輕攪拌直到微球全部懸浮起來； 將容器密封放置到混合器上，室溫持續(xù)攪拌溶液10-15小時。(2)、將制備好的過敏原-生物素-親合素-乳膠微球噴涂在結(jié)合墊上。(3)、進(jìn)行層析膜的包被層析膜為NC膜，在層析膜上包被鼠抗人IgE單克隆抗體形成檢測線(T線)；以及包被羊抗人IgE的多克隆抗體形成質(zhì)控線(C線)，T線與C線之間的距離為5-10mm。(4)、在樣品墊上包被抗紅細(xì)胞抗體。(5)、免疫層析試紙條的組裝將樣品墊、結(jié)合了過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的結(jié)合墊、層析膜、吸水墊(濾紙)依次相互交錯粘貼在底板上，裁切成長度100-120mm，寬度8-12mm的試紙條，試紙條的厚度為0. I-Imm,
(6)、樣品的檢測在試紙條的樣品墊上滴加30μ 1陽性血清(含IgE的標(biāo)準(zhǔn)品)，等待 15min，判斷結(jié)果。陽性結(jié)果在檢測線(T線)所在的檢測區(qū)和質(zhì)控線(C線)所在的質(zhì)控區(qū)各出現(xiàn)一條紅色條帶；陰性結(jié)果僅在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色帶。若檢測區(qū)無色帶且質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn)紫紅色帶，表明不正確的操作或試劑無效，需重新進(jìn)行檢測試驗(yàn)。對比例1
本對比例提供一種血清IgE抗體的免疫層析法，基本同實(shí)施例1，不同的是，其采用的免疫層析試紙條的結(jié)合墊結(jié)合的不是過敏原-生物素-親合素-乳膠微球，而是結(jié)合了過敏原-乳膠微球。該過敏原-乳膠微球的制備過程如下
將過敏原溶于IOOmM MES (pH 4. 5)中，得濃度達(dá)到lmg/ml的過敏原溶液。將微球儲存液劇烈震蕩20s，取出5. OX IO6的微球于Eppendorf離心管中，以8000g_10，OOOg的轉(zhuǎn)速離心Ι-anin，除去上清，加入50ul IOOmM MES (pH 4. 5)，劇烈震蕩20s，加入2ul過敏原溶液， 加入2. 5ul新鮮配制的10mg/ml的EDC，劇烈震蕩，使其混合均勻。室溫暗室孵育30min，加 Λ 1. Oml 0. 02%吐溫-20，以8000g-10, OOOg的轉(zhuǎn)速離心l_2min，除去上清，得偶聯(lián)的微球。 將偶聯(lián)的微球溶于1. Oml 0. 1%SDS中，劇烈震蕩，以8000g_10，OOOg的轉(zhuǎn)速離心l-anin，除去上清，使其溶于IOOmM的PBS (pH 8. 0)，劇烈震蕩20s。對比上述的實(shí)施例1和對比例1的檢測結(jié)果可知，對比例1的檢測結(jié)果顏色非常暗淡，不容易觀察，表明該方法靈敏度低；而實(shí)施例1的檢測結(jié)果明顯，容易觀察，表明靈敏度尚。上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法，其首先將樣品墊、結(jié)合墊、包被有檢測線和質(zhì)控線的層析膜、吸水墊依次相互交錯粘貼在底板上，構(gòu)成免疫層析試紙條，然后向樣品墊中滴加血液樣本進(jìn)行檢測，其特征在于所述結(jié)合墊上結(jié)合有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球，所述方法利用血液樣本中的過敏原特異性IgE抗體能夠與過敏原-生物素-親合素-乳膠微球結(jié)合形成結(jié)合物，以及所形成的結(jié)合物能夠在檢測線處被捕獲而呈現(xiàn)色帶來實(shí)現(xiàn)對過敏原特異性IgE抗體的定性檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法，其特征在于所述的過敏原-生物素-親合素-乳膠微球通過如下方法制備首先將過敏原與生物素連接形成過敏原-生物素，將親合素與乳膠微球連接形成親合素-乳膠微球，然后再將所形成的過敏原-生物素與所形成的親合素-乳膠微球連接，即得所述的過敏原-生物素-親合素-乳膠微球。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法，其特征在于所述的過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的具體制備過程如下①將過敏原溶于磷酸鹽緩沖液中，將生物素溶于去離子水中，然后將生物素的水溶液滴加至過敏原的磷酸鹽緩沖液中，在室溫下攪拌，得到含有過敏原-生物素的溶液；②將親合素溶液溶于脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液中，將乳膠微球儲存液劇烈震蕩，取出微球于離心管中，離心，除去上清，加入脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液，劇烈震蕩，加入溶有親合素的脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液和新鮮配制的碳二亞胺溶液，劇烈震蕩，使混合均勻，在室溫暗室孵育20 40分鐘，加入吐溫-20，離心，除去上清，加入十二烷基硫酸鈉水溶液溶解微球，劇烈震蕩，離心，除去上清，加入磷酸鹽緩沖液溶解微球，劇烈震蕩，得含有親合素-乳膠微球的溶液；③將步驟①制得的含有過敏原-生物素的溶液加入步驟②制得的含有親合素-乳膠微球的溶液中，輕輕攪拌直至微球全部懸浮起來，然后在室溫下持續(xù)攪拌10 15小時，即得含有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法，其特征在于通過噴涂所述含有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的溶液使過敏原-生物素-親合素-乳膠微球結(jié)合到結(jié)合墊上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE 抗體的免疫層析方法，其特征在于所述的樣品墊上包被有抗紅細(xì)胞抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE 抗體的免疫層析方法，其特征在于所述的檢測線通過包被鼠抗人IgE單克隆抗體形成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE 抗體的免疫層析方法，其特征在于所述的質(zhì)控線通過包被羊抗人IgE的多克隆抗體形成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE 抗體的免疫層析方法，其特征在于所述的層析膜為硝基纖維素膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE 抗體的免疫層析方法，其特征在于所述的乳膠微球?yàn)榫郾揭蚁┪⑶颉?br> 10.生物素-親合素放大系統(tǒng)在免疫層析法中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法，其首先將樣品墊、結(jié)合墊、包被有檢測線和質(zhì)控線的層析膜、吸水墊依次相互交錯粘貼在底板上，構(gòu)成免疫層析試紙條，然后向樣品墊中滴加血液樣本進(jìn)行檢測，所述結(jié)合墊上結(jié)合有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球，該方法利用血液樣本中的過敏原特異性IgE抗體能夠與過敏原-生物素-親合素-乳膠微球結(jié)合形成結(jié)合物，以及所形成的結(jié)合物能夠在檢測線處被捕獲而呈現(xiàn)色帶來實(shí)現(xiàn)對過敏原特異性IgE抗體的定性檢測。本發(fā)明將生物素-親合素系統(tǒng)應(yīng)用于連接過敏原和乳膠微球，能夠?qū)崿F(xiàn)在一個過敏原上連接多個乳膠微球，從而使檢測特異性IgE抗體的靈敏度提高，檢測結(jié)果明顯，容易觀察。
文檔編號G01N33/531GK102565382SQ20121000262
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者張逸南, 李冬冬, 趙文姬 申請人:蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司