專利名稱：分泌抗喹諾酮類藥物單抗雜交瘤細胞株及其單抗應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其單抗的應用。
背景技術：
氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones, FQs)是一類人工合成的廣譜、高效的抗菌藥物。作為獸藥和飼料添加劑而大量應用于動物，導致其殘留在動物可食性產品中。這類殘留物可直接對人體造成危害引起軟骨毒性、關節疼痛和腫脹、皮膚過敏反應、白細胞和血小板減少、嗜酸細胞增多、溶血、肝腎損傷等。更嚴重的是低濃度的殘留藥物可能會對FQs類藥物敏感的致病菌產生耐藥性，從而間接威脅人類健康。為此許多國家對喹喏酮類抗生素制定了嚴格的限量標準，我國該類抗生素的最高殘留限量達氟沙星在牛、羊、家禽肌肉中為200ii g/kg、奶中為30ii g/kg，二氟沙星在牛、羊、豬肌肉中為400ii g/kg、家禽中為300 ii g/kg，恩諾沙星在牛、羊、豬、家禽肌肉中均為IOOii g/kg。目前采用的檢測手段主要有微生物抑制分析法、熒光分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜(GC)、薄層色譜和氣質聯用，液相色譜方法及質譜聯用方法等。目前主要用GC或HPLC進行測定。這些方法雖然有較高的靈敏度，但需昂貴的實驗儀器，操作復雜、費時費錢、不能高通量檢測，故難以在基層普及應用。而用抗體為基礎開發的免疫學檢測方法及其試劑盒和試紙條能有效克服這些不足。目前國內外沒有檢測喹諾酮類藥物殘留的免疫試劑盒及試紙條，本發明專利應用競爭抑制ELISA原理，以喹諾酮類藥物單克隆抗體為核心建立檢測喹諾酮類藥物殘留的競爭ELISA方法，并組裝成有自主知識產權、廉價、靈敏的喹諾酮類藥物殘留檢測試劑盒，應用免疫膠體金的原理，以膠體金標記環丙沙星特異性單克隆抗體為核心研制喹諾酮類藥物殘留快速檢測的高靈敏度的免疫試紙條。發明專利的單抗及其免疫學檢測試劑盒和試紙條完全滿足中國、歐盟、日本等地區對喹諾酮類藥物殘留的檢測要求。喹諾酮殘留的免疫學檢測方法、免疫學試劑盒及免疫試紙條的國產化對保障我國食品安全及食品的出口創匯具有重要意義，可產生巨大的經濟效益和社會效益。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其單抗應用。分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細胞株，保藏號為CGMCC No. 5608，它能分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體；
雜交瘤細胞株分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體腹水間接ELISA效價達10_7以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與喹諾酮類藥物環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、達氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星、麻保沙星、沙拉沙星和雙氟沙星有特異性免疫反應。抗喹諾酮類藥物單克隆抗體在食品中該類抗生素殘留檢測上的應用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學檢測方法及其試劑盒和試紙條。本發明提供的雜交瘤細胞株分泌的抗喹諾酮類藥物單克隆抗體特異性強、靈敏度高，能滿足開發免疫學檢測方法及試劑盒的要求；以該發明提供的單抗為核心建立的檢測食品中喹諾酮類藥物殘留的競爭ELISA方法及免疫學試劑盒和試紙條能特異、準確、靈敏、簡單、快速、高通量地檢測食品中喹諾酮類藥物的殘留。


圖I是試紙條的特異性分析，每個樣品的含量為IOOppb ；
圖2是試紙條的組織樣品檢測靈敏度分析；
圖3是試紙條的蜂蜜樣品檢測靈敏度分析；
圖4是試紙條的原奶樣品檢測靈敏度分析。
具體實施例方式分泌抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細胞，于2011年11月28日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏號為CGMCC No. 5608，分類命名為分泌抗氟喹諾酮類藥物單抗雜交瘤細胞；
雜交瘤細胞株分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體腹水間接ELISA效價達10_7以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與喹諾酮類藥物環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、達氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星、麻保沙星、沙拉沙星和雙氟沙星有特異性免疫反應。抗喹諾酮類藥物單克隆抗體在食品中該類抗生素殘留檢測上的應用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學檢測方法及其試劑盒和試紙條。本發明提供的雜交瘤細胞株能分泌抗喹諾酮類藥物單抗，且其特異性強、靈敏度高、穩定性好。以該單抗為核心建立了檢測食品中喹諾酮類藥物的高通量的免疫學競爭ELISA方法及其免疫學試劑盒和試紙條，從而對保障我國食品安全及食品的出口創匯具有
重要意義。下面結合實施例和附圖對本發明作進一步說明。I.環丙沙星半抗原與載體蛋白的交聯
I.環丙沙星(CIP)與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶聯產物的制備方
法
a)將60 mg環丙沙星和30 mg EDC溶于2 ml超純水中。然后立即快速加入30mg/ml的BSA (或者0VA)水溶液1ml，攪拌反應12-18小時，合成CIP-BSA、CIP-OVA偶聯產物。b) CIP-BSA、CIP-OVA偶聯產物放入透析袋中，用0. OlM pH7. 2的磷酸鹽緩沖液在4°C透析2天；
c)透析后的CIP-BSA偶聯產物、CIP-OVA偶聯產物、CIP、BSA、OVA溶液進行紫外掃描，分析鑒定偶聯產物及濃度。結果發現CIP-BSA偶聯產物的紫外掃描圖形與BSA、環丙沙星的掃描圖形明顯不同，CIP-OVA偶聯產物的紫外掃描圖形與0VA、環丙沙星的掃描圖形明顯不同，說明環丙沙星已與BSA、0VA偶聯成功，偶聯產物分裝后于_20°C冰箱保存，用于抗體制備及檢測食品中喹諾酮類藥物殘留的免疫學方法中的環丙沙星人工抗原。
分泌抗環丙沙 星單抗雜交瘤細胞獲得及其單抗制備 I)免疫動物
用CIP-BSA偶聯物免疫四周齡體重18-20 g BALB/C雌性小鼠1 mg/ml CIP-BSA偶聯物0. 5-0. 7 ml與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經背腹部皮下多點加腹腔注射0. 2-0. 3ml/只，間隔3-4周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0. 2-0. 3ml/只，共進行5次加強免疫，末免用不加佐劑的加倍劑量抗原進行腹腔注射，3天后取脾細胞進行融合。2)骨髓瘤細胞的制備
采用SP2/0為實驗的骨髓瘤細胞，直接從細胞培養瓶中吹打懸浮的SP2/0，并計數細胞，活細胞數應高于95%為合格；一般在準備融合前的兩周就應開始復蘇骨髓瘤細胞，為確保該細胞對HAT的敏感性，每3-6月應用8-氮-鳥嘌呤篩選一次，以防止細胞的突變。3)免疫脾細胞的制備
免疫3天后，小白鼠眼球放血后拉頸處死，收集血清并離心，上清凍存，做陽性對照；將小鼠放于70%酒精中浸泡消毒5分鐘，取出固定于板上，在無菌條件下取脾；把脾放入5mL1640液中，輕輕洗去脾上的紅血球；用折彎后的巴氏管輕輕擠壓脾，制成脾細胞懸液，用吸管將懸液移入無菌離心管中；并以400g離心3-5 min (與此同時應開始制備骨髓細胞);把沉淀用約10 mL的新鮮培養液再懸浮；計數細胞，活細胞數高于80%為合格。4)細胞融合
取上述免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)按5-10 1的比例，在無血清的RPMI-1640 (Gibco)培養基中混勻，1500 rpm離心5 min，去除培養基，用50 % PEG (聚乙二醇，分子量為1500，Sigma)作為融合劑，在37°C下水浴下加入0. 5-0. 7ml，使其融合2 min,用無血清的RPMI-1640培養基終止融合后1500 rpm離心5 min,沉淀用HAT篩選培養基(Sigma)懸浮，分裝到96孔含有飼養細胞的細胞板中，37°C，5 % C02的細胞培養箱中培養。5)雜交瘤細胞、陽性孔的篩選及其克隆
細胞在培養箱中培養5天后，用HAT篩選培養基換液一次，第10天用HT培養基換液，等到融合細胞覆蓋孔底10-30%時，用環丙沙星偶聯卵清蛋白(CIP-OVA)作為包被抗原進行間接ELISA方法篩選陽性孔，共獲51多個對環丙沙星有反應的陽性孔，陽性率為5 %。陽性孔進一步用間接競爭ELISA鑒定篩選，選擇6個呈強陽性反應的細胞孔，進行有限稀釋法克隆3-4次，獲得IFl I株能分泌抗環丙沙星的特異性抗體的雜交瘤細胞株。間接競爭ELISA分析發現該單抗的半數抑制率IC50及20%的抑制率IC20分別為3. 65 ng mL'O. 51 ng mL—1。經6個月以上體外傳代和多次凍存復蘇后，細胞株均能良好生長，并穩定分泌抗體。經擴大培養后，用于腹水制備和液氮保存。6)細胞凍存
細胞凍存液所含血清的量為40%，凍存液中含8-10%的DMSO ;細胞濃度為IO7個/mL ;細胞凍存管放入凍存盒后放入-80 °C，幾天后轉入液氮中長期保存；含青霉素100 U/mL，環丙沙星 100 Ii g/mL。7)細胞復蘇
從液氮罐中取出凍存管，立即放37°C水浴中速溶I min;400g離心3 min，無菌操作打開凍存管，棄上清，細胞用HT培養基重新懸浮，取出細胞懸液，轉入細胞培養瓶；培養箱中培養，2小時后吸掉培養上清，加入新的培養基培養。8)單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0. 3-0. 5 ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入5-10X IO5個雜交瘤細胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000-5000 rpm離心3-5 min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。采用辛酸-硫酸銨法進行單克隆抗體免疫球蛋白的分離沉淀。取I倍體積腹水加2倍體積0. 06 M pH 4. 8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(33 ul/ml腹水),室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清I小時，12000 rpm離心20 min,收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小時，3000-5000 rpm離心10 min,收集沉淀，沉淀用少量PBS溶解,透析并更換6次透析液,離心(5000 rpm, 20 min),上清即為純化后的抗體，其濃度為4. 35 mg 111^,-70 °C冷凍保存。9)單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價測定
采用美國Sigma公司的羊抗鼠IgGl, IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA, IgM標準抗血清，將純化的腹水抗體作適當稀釋后用瓊脂雙擴散法測定，24h后觀察沉淀線，判斷單抗的抗體類型及亞類。結果為，IFl的抗體類型及亞類均為IgGl，輕鏈為kappa鏈。腹水效價測定以間接ELISA方法測定，操作如下=CIP-OVA交聯物lOPg/ml濃度用0. 05mol / L pH 9. 6碳酸鹽緩沖液包被ELISA板，每孔lOOul，37°C孵育2h，PBST洗滌3次；用2. 0%脫脂奶封閉，每孔200ul，37°C孵育0. 5h后洗滌3次；倍比稀釋的腹水作一抗，每孔lOOul，37°C孵育Ih后洗滌3次；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG為二抗，每孔lOOul，37°C孵育Ih后洗滌3次，加入底物溶液，每孔lOOul，37°C孵育15min，加入50ul 2mol/l硫酸終止反應，酶標儀測定0D450值。0D450值為大于陰性抗體的2. I倍時的抗體的最高稀釋倍數即為其效價。IFl單抗的ELISA效價達到10_7以上。10)單抗的特異性
采用方陣滴定方法確定間接競爭ELISA抗原抗體最佳工作濃度，在優化的條件下，將環丙沙星標準品、雙氫環丙沙星、卡那霉素、慶大霉素、新霉素、青霉素G、磺胺嘧啶、氯霉素、蔗糖、葡萄糖做系列稀釋，分別與單抗進行間接競爭ELISA。制作標準曲線，并在曲線上找出抑制率50%的濃度，以及上述幾種物質50%抑制率的濃度，然后計算出各類抗生素的交叉反應率。交叉反應率CR計算方法為CR% =環丙沙星IC5tl/其它抗生素IC5tlX 100。如表I所示，單抗與喹諾酮類藥物有交叉反應，但與新霉素、慶大霉素、卡那霉素、磺胺嘧啶、青霉素G、四環素的交叉反應率均小于0. 01%,說明單抗具有很好的特異性，而且對于喹諾酮類藥物，如恩諾沙星、氧氟沙星、達氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星、麻保沙星、沙拉沙星、雙氟沙星等具有明顯的抑制作用，因此，所確定的單抗不單可以檢測環丙沙星，亦可檢測上述的喹諾酮類藥物。表I.單抗的特異性分析
權利要求
1.一種分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細胞株，保藏號為CGMCC N O. 5608,其特征在于能分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體。
2.一種如權利要求I所述的雜交瘤細胞株分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體腹水間接ELISA效價達1(Γ7以上,抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈,該單克隆抗體能與喹諾酮類藥物環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、達氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星、麻保沙星、沙拉沙星和雙氟沙星有特異性免疫反應。
3.—種如權利要求2所述的抗喹諾酮類藥物單克隆抗體在食品中該類抗生素殘留檢測上的應用，其特征在于以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學檢測方法及其試劑盒和試紙條。
全文摘要
本發明公開了一種分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其單抗的應用。用與牛血清白蛋白偶聯的環丙沙星(CIP)為抗原免疫BALB/c小鼠，經細胞融合、篩選、克隆，獲得1株能穩定傳代并分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體(MAb)的雜交瘤細胞株1F1，其保藏號為CGMCCNo.5608。1F1單克隆抗體腹水間接ELISA效價達10-7以上，抗體類型及亞類為IgG1，kappa鏈。間接競爭ELISA分析表明，該株單抗與環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、達氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星、麻保沙星、沙拉沙星、雙氟沙星等喹諾酮類藥物有特異反應。利用1F1單抗開發了檢測食品中喹諾酮類藥物殘留的ELISA方法及試劑盒和試紙條。
文檔編號G01N33/577GK102618502SQ201210004198
公開日2012年8月1日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者吳建祥 申請人:浙江大學