專利名稱：肌鈣蛋白Ⅰ血清快速檢測試劑盒(膠體金法)的制作方法
肌鈣蛋白I血清快速檢測試劑盒(膠體金法)技術領域
本發明提供了一種快速檢測心肌梗死病癥的快速檢測的肌鈣蛋白I血清快速檢測試劑盒(膠體金法)。
背景技術：
心肌缺血性損傷，特別是急性心肌梗塞(AMI)是威脅人類生命的主要疾病之一， 臨床化學家和臨床科學家一直努力尋找和探索特異性好、靈敏度高的血清指標，心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I, cTnl)具有高度的心肌特異性，當心肌細胞受損時,血液中的 cTnl出現時間早，持續時間長，與心肌損傷程度及預后密切相關，因此，它可作為心肌損傷的一種特異性指標。發明內容
本發明提供了一種用于快速檢測心肌梗死病癥的肌鈣蛋白I血清快速檢測試劑盒(膠體金法)，具有快速檢測試，性能極其穩定，用戶使用方便、能準確快速檢測的功能。
本發明是通過如下技術方案實現的
肌鈣蛋白I血清快速檢測試劑盒(膠體金法)，其原理為心肌鈣蛋白I(cTnl)的分子量為22. 5KD，其連同肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白C構成結構復合物，在心臟中的細胞間鈣信號肌動蛋白-肌球蛋白相互作用的轉化過程中起著重要作用，人體中的cTnl與骨骼肌中的形式在結構上有所不同，它的氨基端上多了一個氨基酸殘基，使得cTnl成為一個特異性的標志物，在心肌梗死(AMI)發生后，cTnl便迅速釋放入血液循環中，本發明采用雙抗夾心免疫法，當標本加入樣品槽后，通過結合墊和金抗體結合，復合物沿膜流動和抗體在檢測區域反應，如果標本中存在有可檢出濃度或更濃的標志物，就會在檢測區出現一條色帶，如果沒有就會保持無色，標本繼續移動至控制區域，出現粉紅-玫瑰紅的色帶，說明試驗正常結果有效。
本發明同時公開了肌鈣蛋白I血清快速檢測試劑盒(膠體金法)的制備及檢測方法，其流程為
—、cTnl標記用單克隆抗體的預處理
1.1透析，純化水，24小時；
1.2離心去上清，4 10°C，10000轉/分鐘、5分鐘；
I. 3 BCA法則濃度(物料平衡)；
I. 4 PH 的調節，0. lmol/LK2C03 量的確定；
I. 5最佳標記量的確定；
1.6分裝(5000人份量/支)、-20度凍存；
二、試劑的配制
2.1 1%的檸檬酸三鈉的配制；
2.2 1%的氯金酸的配制；
2.3 0.01%的氯金酸的配制；2. 4 0. lml/L K2C03 的配制；2.5 10%的氯化鈉的配制；2.6 的疊氮鈉的配制；2.7 10% 的 BSA 的配制;2. 8 lmol/1 PBS 的配制；2. 9 0. 05mol/l PBS 的配制；2. 10膠體金復溶液的的配制；三、膠體金的制備3. 1 量取 0. 01 % 的 HAuCL4 溶液；3.2 加熱至沸騰，迅速加入檸檬酸三鈉溶液，攪拌均勻，IOOml 0.01%的 HAuCL4溶液加1. 6ml 檸檬酸三鈉溶液；3. 3繼續加熱10分鐘，然后冷卻至室溫，用超純水恢復至原體積；3.4 0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌；3.5送檢、裝瓶、貼標簽；四、cTnl免疫金的制備和干燥4. 1 cTnl標記抗體的稀釋，按照每生產5000人份4mm寬的cTnl試紙條需1支 cTnl標記抗體計算，領取相應量的抗體，用0. 05mol/l PBS稀釋到0. 5mg/ml ；4.2生產前小試a取Iml膠體金；b 調 PH 值，0. lmol/L K2C03 的量，混勻 5min ；c根據生產指令加入CTnIAbl，混勻IOmin ；d 加入 IOOul 10% BSA，混勻 IOmin ；e 離心 1000 轉 /min，30min,要求環境溫度 4_10°C ；f 30%復溶，浸泡聚酯膜 O.anl/條，0.6cmX30cm;g溫度20_30°C，相對濕度30-35%干燥5小時；h送質檢部檢驗；4. 3 cTnl 抗體標記1)標記小試質檢質檢合格，取膠體金，電磁攪拌，以生產1000人份5mm寬的肌鈣蛋 白I膠體金試紙條約需50ml膠體金來計算；2)調 PH 值，0. lmol/L K2C03 的量，混勻 5min ；3)根據最適標記量加入CTnIAbl，混勻IOmin ；4)加入 IOOul 10% BSA，混勻 IOmin ；5)離心 1000 轉 /min，30min, 4_10°C ；6) 30%復溶，浸泡聚酯膜 25. 3ml/ 張，20cmX30cm ；7)溫度20_30°C，相對濕度30-35%干燥5小時；8)抽一條0. 6cm寬送質檢部做膜金匹配檢測；9)cTnI免疫金送中間品室暫存；五、cTnl包被板的制備
5. I包被抗體的稀釋,羊抗鼠IgO. 05mol/LPBS稀釋到I. 2mg/ml工作濃度,cTnl捕獲抗體用0. 05mol/LPBS稀釋到I. lmg/ml工作濃度；
5. 2包被前小試
I)各取20ul試包被I條20cm長的膜，線濃度I. Oul/cm ；
2)2°C-8°C 過夜；
3)貼膜；
4)溫度20-30°C、相對濕度30_35*%干燥5小時,最后送質檢部檢驗質檢合格；
5. 3包被生產
I) cTnl包被小試質檢合格單；
2)羊抗鼠IgG、cTnl捕獲抗體工作濃度包被質控線和檢測線，線濃度I. Oul/cm ；
3)2°C-8°C 過夜；
4)貼膜；
5)溫度20_30°C、相對濕度30-35%，干燥5小時；
6)抽I板送質檢部作膜金匹配；
7)密封后送中間品庫暫存。
本發明的檢測流程為采用以上技術方案制作標本，加入樣品槽后，通過結合墊和金抗體結合，復合物沿膜流動和抗體在檢測區域反應，其分為以下三種情況
(一)、陽性15分鐘后出現兩條色帶，說明結果陽性試驗有效，只要在檢測區域出現有色帶即可以讀取結果，很低濃度的cTnl會在長于15分鐘的時候出現兩條帶；
( 二)、陰性如果在檢測區域沒有條帶而控制區域有條帶，說明結果陰性而試驗有效；
(三)、無效試驗如果在控制區域沒有任何條帶，說明試驗無效，標本應選用另一個新的卡片重新測試。
由于采用了以上技術方案，本發明具有的有益效果為肌鈣蛋白I血清快速檢測試劑盒，性能極其穩定，用戶使用極其方便、能準確快速檢測。


圖I、為本發明的制備的工藝流程圖。
其中《 ☆”為必須在凈化車間內操作；
“令”為必須在溫度20_3(TC、濕度30_35%操作，
另外cTnl包被板的制備以及cTnl免疫金的制備的干燥過程也必須在溫度 20-30°C、濕度 30-35%進行；
為關鍵控制點。
具體實施方式
肌鈣蛋白I血清快速檢測試劑盒(膠體金法)，其原理為心肌鈣蛋白I(cTnl)的分子量為22. 5KD，其連同肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白C構成結構復合物，在心臟中的細胞間鈣信號肌動蛋白-肌球蛋白相互作用的轉化過程中起著重要作用，人的cTnl與骨骼肌中的形7有所不同，它的氨基端上多了一個氨基酸殘基，使得cTnl成為一個特異性的標志物，在心肌梗死(AMI)發生后，cTnl便迅速釋放入血液循環中。
本發明同時公開了肌鈣蛋白I血清快速檢測試劑盒(膠體金法)的制備及檢測方法，其流程為
—、cTnl標記用單克隆抗體的預處理
1.1透析，純化水，24小時；
1.2離心去上清，4 10°C，10000轉/分鐘、5分鐘；
I. 3 BCA法則濃度(物料平衡)；
I. 4 PH 的調節，0. lmol/LK2C03 量的確定；
I. 5最佳標記量的確定；
1.6分裝(5000人份量/支)、-20度凍存；
二、試劑的配制
2. II %的檸檬酸三鈉的配制
2. 2I %的氯金酸的配制；
2. 30.01%的氯金酸的配制;
2. 40. lml/L K2C03 的配制；
2. 510%的氯化鈉的配制；
2. 6I %的疊氮鈉的配制；
2. 710%的BSA的配制；
2. 8Imo 1/1 PBS 的配制；
2. 90. 05mol/l PBS 的配制；
2. 10膠體金復溶液的的配制
三、膠體金的制備
3. I 量取 0. 01 % 的 HAuCL4 溶液；
3.2 加熱至沸騰，迅速加入I %檸檬酸三鈉溶液，攪拌均勻，IOOml 0.01%的 HAuCL4溶液加I. 6mll%檸檬酸三鈉溶液；
3. 3繼續加熱10分鐘，然后冷卻至室溫，用超純水恢復至原體積；
3.4 0. 22iim微孔濾膜過濾除菌；
3.5送檢、裝瓶、貼標簽；
四、cTnl免疫金的制備和干燥
4. IcTnI標記抗體的稀釋,按照每生產5000人份4mm寬的cTnl試紙條需I支cTnl 標記抗體計算，領取相應量的抗體，用0. 05mol/l PBS稀釋到0. 5mg/ml ；0105]4.2生產前小試0106]a取Iml膠體金；0107]b調 PH 值，0. lmol/L K2C03 的量，混勻 5min ；0108]C根據生產指令加入CTnIAbl，混勻IOmin ；0109]d加入 IOOul 10% BSA，混勻 IOmin ；0110]e離心1000轉/min, 30min,要求環境溫度4-10°C0111]f30%復溶,浸泡聚酯膜0. 8ml/條,0. 6cmX 30cm
g溫度20-30°C，相對濕度30-35%干燥5小時；
h送質檢部檢驗；
4. 3 cTnl抗體標記
I)標記小試質檢質檢合格，取膠體金，電磁攪拌，以生產1000人份5mm寬的肌I丐蛋白I膠體金試紙條約需50ml膠體金來計算；
2)調 PH 值，0. lmol/L K2C03 的量，混勻 5min ；
3)根據最適標記量加入CTnlAbl，混勻IOmin ；
4)加入 IOOul 10% BSA，混勻 IOmin ；
5)離心 1000 轉/min, 30min, 4_10°C ；
6) 30%復溶，浸泡聚酯膜25. 3ml/張，20cmX30cm ；
7)溫度20-30°C，相對濕度30-35%干燥5小時；
8)抽一條0. 6cm寬送質檢部做膜金匹配檢測；
9) cTnl免疫金送中間品室暫存；
五、cTn I包被板的制備
5. I包被抗體的稀釋，羊抗鼠IgO. 05mol/LPBS稀釋到I. 2mg/ml工作濃度，cTnl捕獲抗體用0. 05mol/LPBS稀釋到I. lmg/ml工作濃度；
5. 2包被前小試
I)各取20ul試包被I條20cm長的膜，線濃度I. Oul/cm ；
2) 2°C _8°C過夜；
3)貼膜；
4)溫度20-30°C、相對濕度30-35%干燥5小時,最后送質檢部檢驗質檢合格；
5. 3包被生產
I) cTnl包被小試質檢合格單；
2)羊抗鼠IgG、cTnl捕獲抗體工作濃度包被質控線和檢測線，線濃度I. Oul/cm ；
3) 2°C _8°C過夜；
4)貼膜；
5)溫度20-30°C、相對濕度30-35%，干燥5小時；
6)抽I板送質檢部作膜金匹配；
7)密封后送中間品庫暫存。
本發明的檢測流程為采用以上技術方案制作的標本，加入樣品槽后，通過結合墊和金抗體結合，復合物沿膜流動和抗體在檢測區域反應，其分為以下三種情況
(一)、陽性15分鐘后出現兩條色帶，說明結果陽性試驗有效，只要在檢測區域出現有色帶即可以讀取結果，很低濃度的cTnl會在長于15分鐘的時候出現兩條帶。
有效。(二)、陰性如果在檢測區域沒有條帶而控制區域有條帶，說明結果陰性而試驗
(三)、無效試驗如果在控制區域沒有任何條帶，說明試驗無效，標本應選用另一個新的卡片重新測試。
心肌鈣蛋白I(cTnl)的分子量為22. 5KD，其連同肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白C構成結構復合物，在心臟中的細胞間鈣信號肌動蛋白-肌球蛋白相互作用的轉化過程中起著重要作用，人的cTnl與骨骼肌中的形式在結構上有所不同，它的氨基端上多了一個氨基酸殘基，使得cTnl成為一個特異性的標志物，在心肌梗死(AMI)發生后，cTnl便迅速釋放入血液循環中，釋放的模式和CK-MB相同(在AMI發生4-6個小時以后)，然而，CK-MB的水平在 36-48小時后恢復正常，cTnl可以持續升高6_10天，在正常健康人體內，cTnl水平是非常低的，在骨骼肌受損的病人體內也檢測不到cTnl，因此cTnl是診斷心肌梗死的一個特異性指標。
產品名稱肌鈣蛋白I血清快速檢測試劑盒(膠體金法)
規格25人份/盒
適用范圍
本試劑盒是免疫層析基礎上的一步法體外診斷試劑盒，用來對發生心肌梗死時人血清中的心肌鈣蛋白I進行定性檢測。
檢測原理膠體金法
采用雙抗體夾心法，以膠體金作為指示標記，交聯抗肌鈣蛋白I抗體，另一抗體為捕獲抗體，與血液中的肌鈣蛋白I結合并顯色，測試時，樣本向檢測區及質控區移動，如果樣品中含有肌鈣蛋白I，它就會和試劑中的金標抗體組成抗原抗體復合物，再和檢測區中的相對應的捕獲抗體形成紫紅色的色帶，如果樣品中肌鈣蛋白I水平低于最低檢測限，檢測區中就不會有色帶出現，在任何情況下，質控區色帶都應出現，質控區色帶的出現表明反應系統有效。
主要組成成分
測試卡片和一份干燥劑、一個滴管一起裝于鋁箔袋中，每個試劑盒有25個相同的鋁箔袋。
自備材料
血清收集設備
2、計時裝置
樣本要求
必須在標準實驗室環境下采集血清標本。
2、標本采集后最好馬上就做檢測。如不能在24小時內檢測，血清標本應冷凍起來，在試驗以前使標本回復到室溫。
3、可以加0. I %的疊氮鈉作為防腐劑，不會影響試驗結果。
質控方法
控制線是內對照試劑和步驟控制，只要正確操作試劑有效控制線總會出現。
2、建議每次都使用對照品以確保試劑盒的有效性，本試劑盒內沒有提供對照品， 可外購。
操作步驟
使用前，將所有的試劑成分和病人樣本置于室溫。
把測試卡片從鋁箔袋中取出。
用微量移液器吸取150 ii I樣本。
移液器垂直，加標本2-3滴(100-150 ii I)至樣品槽中。
5、15分鐘讀取顯示結果。
廣品性能指標
本試劑盒在cTnl彡I. 5ng/ml時出現陽性結果。
注意事項
I.處理樣品時，請戴一次性手套。
2.測試時，測試卡應水平放置，不要傾斜。
3.加樣15分鐘后顯示的結果無診斷意義。
4.測試結束，請徹底清洗雙手剩余標本和廢棄物應用I : 25稀釋的84消毒液浸泡30分鐘以上才能丟棄。
5. 一個吸管只能吸取一個樣品，以免交叉污染。
6.若用微量滴管頭滴加樣本，應迅速一次性加入到樣品槽中，避免斷續加入。
7.本試劑結果僅供定性的輔助診斷，對實驗結果解釋需與臨床癥狀相結合。
貯存2-8°C保存。
有效期12個月。
醫療器械注冊證書編號
產品標準編號Q/YZ021-2006。
最后應說明的是以上說明書僅用以說明本發明的技術方案和使用特征，盡管本說明書參照上述的實施例對本發明已進行了詳細的說明，但是，本領域的普通技術人員應當理解，仍然可以對本發明進行修改或等同替換；而一切不脫離本發明的精神和范圍的技術方案及其改進，其均應涵蓋在本發明的權利要求
權利要求
1.肌鈣蛋白I血清快速檢測試劑盒(膠體金法)，其原理為心肌鈣蛋白I(cTnl)的分子量為22. 5KD，其連同肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白C構成結構復合物，在心臟中的細胞間鈣信號肌動蛋白-肌球蛋白相互作用的轉化過程中起著重要作用，人體中的cTnl與骨骼肌中的形式在結構上有所不同，它的氨基端上多了一個氨基酸殘基，使得cTnl成為一個特異性的標志物，在心肌梗死(AMI)發生后，cTnl便迅速釋放入血液循環中，其特征在于采用雙抗夾心免疫法，當標本加入樣品槽后，通過結合墊和金抗體結合，復合物沿膜流動和抗體在檢測區域反應，如果標本中存在有可檢出濃度或更濃的標志物，就會在檢測區出現一條色帶，如果沒有就會保持無色，標本繼續移動至控制區域，出現粉紅-玫瑰紅的色帶，說明試驗正常結果有效。
2.根據權利要求I所屬的肌鈣蛋白I血清快速檢測試劑盒(膠體金法)，其制備及檢測方法，其流程為一、cTnl標記用單克隆抗體的預處理`1.1透析，純化水，24小時；`I. 2離心去上清，4 10。。，10000轉/分鐘、5分鐘；`I. 3 BCA法則濃度(物料平衡);`I. 4 PH的調節，0. lmol/LK2C03量的確定；`1.5最佳標記量的確定；`1.6分裝(5000人份量/支)、-20度凍存；二、試劑的配制`2.I I %的檸檬酸三鈉的配制；`2.2I %的氯金酸的配制；`2.30.01%的氯金酸的配制；`2. 4 0. lml/L K2C03 的配制；`2.510%的氯化鈉的配制；`2.6I %的疊氮鈉的配制；`2. 7 10%的BSA的配制；`2. 8 lmol/1 PBS 的配制；`2.9 0. 05mol/l PBS 的配制；`2.10膠體金復溶液的的配制；三、膠體金的制備`3.I 量取0. 01 %的HAuCL4溶液；`3.2 加熱至沸騰，迅速加入I %檸檬酸三鈉溶液，攪拌均勻，IOOml 0. 01%的HAuCL4 溶液加I. 6ml I %檸檬酸三鈉溶液；`3.3繼續加熱10分鐘，然后冷卻至室溫，用超純水恢復至原體積；`3.40.22 um微孔濾膜過濾除菌；`3.5送檢、裝瓶、貼標簽；四、cTnl免疫金的制備和干燥`4.IcTnI標記抗體的稀釋,按照每生產5000人份4mm寬的cTnl試紙條需I支cTnl標記抗體計算，領取相應量的抗體，用0. 05mol/l PBS稀釋到0. 5mg/ml ；4.2生產前小試 a取Iml膠體金；b 調 PH 值，0. lmol/L K2C03 的量，混勻 5min ； c根據生產指令加入CTnIAbl，混勻IOmin ； d 加入 IOOul 10% BSA，混勻 IOmin ； e離心1000轉/min, 30min,要求環境溫度4_10°C ； f 30%復溶,浸泡聚酯膜0. 8ml/條,0. 6cmX30cm ； g溫度20-30°C，相對濕度30-35%干燥5小時； h送質檢部檢驗；4.3 cTnl抗體標記1)標記小試質檢質檢合格，取膠體金，電磁攪拌，以生產1000人份5mm寬的肌I丐蛋白I 膠體金試紙條約需50ml膠體金來計算；2)調PH 值，0. lmol/L K2C03 的量，混勻 5min ；3)根據最適標記量加入CTnIAbl，混勻IOmin；4)加入IOOul 10% BSA，混勻 IOmin ；5)離心1000 轉/min, 30min, 4_10°C ；6)30%復溶，浸泡聚酯膜25. 3ml/張，20cmX30cm ；7)溫度20-30°C，相對濕度30-35%干燥5小時；8)抽一條0.6cm寬送質檢部做膜金匹配檢測；9)cTnl免疫金送中間品室暫存；五、cTnI包被板的制備5.I包被抗體的稀釋，羊抗鼠IgO. 05mol/LPBS稀釋到I. 2mg/ml工作濃度，cTnl捕獲抗體用0. 05mol/LPBS稀釋到I. lmg/ml工作濃度；5. 2包被前小試1)各取20ul試包被I條20cm長的膜，線濃度I.Oul/cm ；2)2°C _8°C過夜；3)貼膜；4)溫度20-30°C、相對濕度30-35%干燥5小時,最后送質檢部檢驗質檢合格；5.3包被生產1)cTnl包被小試質檢合格單；2)羊抗鼠IgG、cTnl捕獲抗體工作濃度包被質控線和檢測線，線濃度I.Oul/cm ；3)2°C _8°C過夜；4)貼膜；5)溫度20-30°C、相對濕度30-35%，干燥5小時；6)抽I板送質檢部作膜金匹配；7)密封后送中間品庫暫存。
3.根據權利要求I所屬的肌鈣蛋白I血清快速檢測試劑盒(膠體金法)，其檢測流程為采用以上技術方案制作標本，加入樣品槽后，通過結合墊和金抗體結合，復合物沿膜流動和抗體在檢測區域反應，其分為以下三種情況(一)、陽性15分鐘后出現兩條色帶，說明結果陽性試驗有效，只要在檢測區域出現有色帶即可以讀取結果，很低濃度的cTnl會在長于15分鐘的時候出現兩條帶；(二)、陰性如果在檢測區域沒有條帶而控制區域有條帶，說明結果陰性而試驗有效；(三)、無效試驗如果在控制區域沒有任何條帶，說明試驗無效，標本應選用另一個新的卡片重新測試。
全文摘要
本發明公開了肌鈣蛋白I血清快速檢測試劑盒(膠體金法)，屬于生物檢測試劑盒技術領域，其原理為心肌鈣蛋白I(cTnI)的分子量為22.5KD，其連同肌鈣蛋白和肌鈣蛋白構成結構復合物，人體中的cTnI的氨基端上多了一個氨基酸殘基，使得cTnI成為一個特異性的標志物，在心肌梗死發生時，cTnI便迅速釋放入血液循環中，本發明采用雙抗夾心免疫法，當標本加入樣品槽后，通過結合墊和金抗體結合，復合物沿膜流動和抗體在檢測區域反應；若標本中存在有可檢出濃度或更濃的標志物，就會在檢測區出現一條色帶；若沒有就會保持無色，標本移動至控制區域，出現粉紅-玫瑰紅的色帶，說明試驗結果正常；本發明具有快速檢測、性能穩定、使用方便。
文檔編號G01N33/531GK102539787SQ201210006460
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者宣生良 申請人:上海一滴準生物科技有限公司