專利名稱：一種測量小于衍射極限距離的光學成像方法
技術領域：
本發明涉及一種超高分辨率顯微成像的方法，特別是一種測量小于衍射極限距離的光學成像方法。
背景技術：
遠場光學成像的分辨率受衍射極限限制，在可見光范圍內難以測量小于200nm的距離。提高光學影像的分辨率一直是遠場光學顯微成像的研究目標之一。能夠突破衍射極限的遠場光學成像方法被稱為遠場納米顯微技術。與近場掃描光學顯微鏡相比，遠場方法避免了實體探針對樣品的干擾，可以實現無損檢測及活細胞檢測。已經報道的單分子遠場納米成像的技術有如下三種①利用熒光分子漂白時間的差異，分別確定檢測區內各分子的位置，可以實現8nm的分辨率；②光激活定位顯微術 (PALM)法利用某些熒光分子經光激活后在檢測波長下發出熒光的性質，交替施加激活光和檢測光，大體控制分子發射熒光的順序；③超分辨隨機光重建顯微鏡(STORM)以紅、綠兩種激光，可控、可逆地開關Cy3/Cy5染料對中的Cy5熒光，實現20-30nm的成像分辨率。 眾所周知，多波長的同時成像(即多色成像)在視覺效果、信息通量等方面均優于單波長成像。與發射單一波長熒光(簡稱單色)的單分子納米成像原理相似，若能從時序上或空間上分別定位發射不同波長熒光(簡稱多色)的分子，則可以實現多色單分子間小于衍射極限距離的測量。Nie利用單通道彩色CXD和雙色熒光微球證實了這一方法的可行性，但是該方法的靈敏度尚有待提高，目前做不到單個納米顆粒和單個分子的水平。
現有超分辨顯微成像方法，大多儀器復雜，成本高，應用范圍有限，需要專業人員操作、 分析。單分子和單個納米粒子水平上的多色超分辨成像尚未實現。

發明內容
本發明的目的在于提供一種測量小于衍射極限距離的光學成像方法，解決單分子和單個粒子水平上不能實現多色超分辨成像的問題，填補技術空白。本發明的目的是這樣實現的以顯微鏡為成像平臺，以成像檢測器為記錄儀，以有閃爍現象的衍射極限距離內的發光個體為測量對象，以光柵為識別手段，測量10 - 200納米距離內的發射不同波長的發光個體之間的距離；光柵對有閃爍現象的不同發光波長的發光個體進行光譜識別，分別超分辨定位；
所述發光個體是熒光分子，量子點，銀簇，碳點，發光納米顆粒； 所述的光柵是透射光柵、反射光柵； 所述發光波長在可見光范圍內即300 - 800納米； 基于光柵分光的超分辨定位，具體實施方案為
(1)、構建標尺選用發射波長不同的紅色與綠色量子點(QD)熒光標記物，分別與兩條互補的單鏈DNA連接，形成“單鏈DNA-量子點(ssDNA-QD)”交聯物；將兩種顏色的“單鏈 DNA-量子點”交聯物混勻，雜交，形成“紅色量子點-DNA-綠色量子點(QDred-DNA-QDgreen)"復合物；DNA長度、量子點半徑已知，該標尺長度已知；
(2)、成像裝置在成像檢測器前放置透射光柵，利用透射光柵分光原理，實現不同發射波長的熒光標記物的光譜成像；成像檢測器安置在顯微鏡上；
(3)、超分辨定位用成像裝置連續拍攝“紅色量子點-DNA-綠色量子點”樣品，當圖片中只有一個一級條紋時，表明此時只有一種顏色的量子點發光，則其零級光斑可用于此發光量子點的超分辨定位；同樣，當只出現另一條一級條紋時，另一種量子點亦可超分辨定位；這樣即可分別定位兩種量子點中心；
(4)、漂移的校正在進行分析的圖片上選取一單色發光點作為參考點，該參考點中心隨時間的變化即為平臺漂移，根據不同幀圖片中心的移動軌跡來校正光學平臺的漂移；然后計算量子點間的距離；
(5)、定位準確性按照上述1-5步，測量三種不同長度DNA間的不同顏色量子點的距離；用三種不同距離與三種不同堿基對作圖，線性回歸計算堿基對的距離，考量定位的準確性；所述的三種不同長度分別為15個堿基對15bp ；或者為30個堿基對30bp，或者為45個堿基對45bp。該方案中以雙色量子點標記DNA片段作為標尺，該標尺已知長度且小于衍射極限距離，用來驗證本發明的可靠性和測量精確性；通過在EMCCD檢測器前放置透射光柵進行光譜成像，根據一級條紋“on”與“off”的交替，超分辨定位不同顏色量子點的中心；具體步驟為(1)標尺的制備；(2)于EMCXD檢測器前放置光柵；(3)將標尺樣品光譜成像；(4) 記錄不同量子點一級條紋的“on”與“off ”；(5)超分辨定位不同顏色量子點的中心；(6)平臺漂移的校正。研究對象可為有閃爍現象的熒光分子或納米顆粒標記DNA，蛋白質和其它生物分子；利用透射光柵的分光原理，在可見光范圍內的所有波長皆適用；改造顯微成像模型，應用反射光柵同樣適用；不僅適用于靜止而且適用于運動過程中單分子特定時刻精確定位。單分子及單粒子水平上的超分辨率顯微術得以實現的關鍵要素是對小于衍射極限距離的分子能夠分別定位；無論是在空間或時間上只要能將多個分子分別定位就有望實現超分辨成像；利用發光個體的閃爍不同步和透射光柵的分光將不同顏色的發光體分別定位，解決了單分子和單個納米粒子水平上不能實現多色樣品超分辨成像的問題，填補了技術空白，達到了本發明的目的。優點該方法能夠應用于多種發光波長的發光體的共定位，通量更高，信息量更大。在操作上簡便，快捷，測量準確，不需要復雜的光學技術和專業的操作者，對任何具有閃爍現象的發光體均適用。


圖1為本發明的單分子定位模型示意圖。圖2為本發明的透射光柵分光原理圖。圖3為本發明的單對量子點的確定圖。圖4為本發明的提取分析數據與數據定位與光學平臺的漂移的校正圖。圖5為本發明的定位準確性的分析圖。圖6為本發明在細胞內測量的結果圖。
具體實施例方式
實施例1 滴加5 μ L，lnmol/L的QDral-DNA-QDg,een標尺樣品于載玻片表面，覆蓋蓋玻片，送熒光顯微鏡觀察。利用量子點的“一元激發，多元發射”的優勢，選用415-455nm濾光片作為激發塊，圖3C為用510-750nm濾光片為發射濾光塊，使系統能同時多色成像。圖2為利用透射光柵的分光原理，圖3A為使來自樣品的像分成一個零級點和多個一級條紋像。圖:3B為分別分析不同一級條紋熒光強度隨時間的變化，確定觀察的對象是否為量子點對。利用另一種量子點處于“off”狀態時，圖4A和圖4B為定位此時處于” on”狀態的量子點。分別定位兩種量子點的中心，計算標尺的距離。改變標尺中DNA的堿基對(Mbp，30bp, 45bp)，分別測量不同長度的的標尺，將測量結果與理論計算結果比較。作DNA堿基對與測量長度圖，回歸出堿基對間的距離為0. 33nm(理論值為0. 34nm)(圖5)。
實施例2:
將人胚腎細胞(293A)與0. 25nmol/L的QD585和QD655共培養M小時后，取4_8 μ L細胞樣品，送光譜成像顯微鏡觀察。用我們的發明方法可以測量細胞內兩種量子點聚集時，它們之間的距離。圖6是兩個細胞的測量結果。A上為明場細胞圖像。A中為小視野的熒光照片。將該照片中虛線內放大為A下。其中箭頭所指處為兩種顏色的量子點聚集處。它們之間的距離用常規方法無法測量，本發明測量結果為37. 5nm。同樣，B中箭頭所指處兩種量子點的距離為29. 9nm。
權利要求
1. 一種測量小于衍射極限距離的光學成像方法，以顯微鏡為成像平臺，以成像檢測器為記錄儀，以有閃爍現象的衍射極限距離內的發光個體為測量對象，以光柵為識別手段，可以測量10 - 200納米距離內的發射不同波長的發光個體之間的距離；其特征在于光柵對有閃爍現象的不同發光波長的發光個體進行光譜識別，分別超分辨定位；所述發光個體是熒光分子，量子點，銀簇，碳點，發光納米顆粒；所述的光柵是透射光柵、反射光柵；所述發光波長在可見光范圍內即300 - 800納米；基于光柵分光的超分辨定位，具體實施方案為(1)、構建標尺選用發射波長不同的紅色與綠色量子點(QD)熒光標記物，分別與兩條互補的單鏈DNA連接，形成“單鏈DNA-量子點(ssDNA-QD)”交聯物；將兩種顏色的“單鏈 DNA-量子點”交聯物混勻，雜交，形成“紅色量子點-DNA-綠色量子點(QDred-DNA-QDgreen)"復合物；DNA長度、量子點半徑已知，該標尺長度已知；(2)、成像裝置在成像檢測器前放置透射光柵，利用透射光柵分光原理，實現不同發射波長的熒光標記物的光譜成像；成像檢測器安置在顯微鏡上；(3)、超分辨定位用成像裝置連續拍攝“紅色量子點-DNA-綠色量子點”樣品，當圖片中只有一個一級條紋時，表明此時只有一種顏色的量子點發光，則其零級光斑可用于此發光量子點的超分辨定位；同樣，當只出現另一條一級條紋時，另一種量子點亦可超分辨定位；這樣即可分別定位兩種量子點中心；(4)、漂移的校正在進行分析的圖片上選取一單色發光點作為參考點，該參考點中心隨時間的變化即為平臺漂移，根據不同幀圖片中心的移動軌跡來校正光學平臺的漂移；然后計算量子點間的距離；(5)、定位準確性按照上述1-5步，測量三種不同長度DNA間的不同顏色量子點的距離；用三種不同距離與三種不同堿基對作圖，線性回歸計算堿基對的距離，考量定位的準確性；所述的三種不同長度分別為15個堿基對15bp ；或者為30個堿基對30bp，或者為45個堿基對45bp。
全文摘要
一種測量小于衍射極限距離的光學成像方法，屬于超高分辨率顯微成像的方法。以顯微鏡為成像平臺，以成像檢測器為記錄儀，以有閃爍(blinking)現象的衍射極限距離內的發光個體為測量對象，以光柵為識別手段，可以測量10－200納米距離內的發射不同波長的發光個體之間的距離。具體方案步驟是(1)在檢測器前放置光柵進行光譜成像；(2)記錄不同發光個體的一級條紋的“明”與“暗”；(3)超分辨定位發光波長不同的發光體中心；(4)光學平臺漂移的校正。本發明不需要復雜的光學技術和專業的操作者，對任何具有閃爍現象的多色發光體均可適用。
文檔編號G01N21/25GK102538683SQ20121000711
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者蓋宏偉, 石星波 申請人:徐州師范大學