專利名稱：調(diào)控斑馬魚卵黃蛋白原水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種評價(jià)有機(jī)污染物對水生生物內(nèi)分泌毒害或干擾的方法，尤其涉及到一種檢驗(yàn)水生生物體內(nèi)內(nèi)分泌是否受到外源環(huán)境中低濃度類雌激素干擾物毒害或干擾的方法，屬于類雌激素干擾物的檢驗(yàn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生態(tài)環(huán)境中的化學(xué)污染物質(zhì)干擾人類和野生動物的內(nèi)分泌功能，從而對個體的生殖、發(fā)育和性行為等產(chǎn)生多方面的影響，甚至?xí)绊懙饺祟惖纳娣毖?Tilghman S L， Nierth-Simpson E N, Wallace R， et al.Environmental hormones !Multiple pathways for response may lead to multiple disease outcomes[J]. Steroids,2010,75 (8-9) 520-523)。因而國際組織和發(fā)達(dá)國家對內(nèi)分泌干擾危害效應(yīng)監(jiān)控實(shí)行強(qiáng)制管理，如聯(lián)合國 GHS(全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度)和歐盟REACH(化學(xué)物質(zhì)注冊、評估、授權(quán)和限制) 法規(guī)1907/2006 (EC)中均對內(nèi)分泌干擾化學(xué)物質(zhì)提出了明確管控要求。卵黃蛋白原(VTG)是卵黃蛋白的前體，通常受循環(huán)的內(nèi)源性雌激素刺激，由雌性卵生脊椎動物肝臟產(chǎn)生，由血流進(jìn)入卵巢，并被發(fā)育中的雌性配子吸收并改變。它是直接通過雌激素受體調(diào)節(jié)途徑來合成的，一般只在成熟雌魚體內(nèi)合成，而在幼魚或成年雄魚體內(nèi)含量很低，難以檢測出。但在受外源性的雌激素的刺激下，肝臟能夠合成并分泌VTG。因此， 通過測量VTG水平的變化，能夠探索不同化學(xué)物質(zhì)的內(nèi)分泌干擾作用機(jī)制。全氟碳化合物(PFCs)已成為重要的持久性有機(jī)污染物(POP s)， 廣泛分布于環(huán)境、野生動物和人類中。其中代表性的全氟辛烷磺酰基化合物 (Perfluorooctanesulphonate, PF0S)、全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid, PF0A)以及它們的衍生物已成為新型持久性有機(jī)污染物質(zhì)，可以通過呼吸和食物被生物體攝取， 有很高的生物蓄積性，可能具有內(nèi)分泌干擾毒性、遺傳毒性、肝臟毒性等(Jensen A A, Leffers H. Emerging endocrine disrupters perfluoroalkylated substances[J]. International Journal of Andrology,2008,31(2) 161-169 ；Clarke B 0, Smith S R. Review of ‘emerging’ organic contaminants in biosolids and assessment of international research priorities for the agricultural use of biosolids[J]. Environment International, 2011, 37 (I) :226-247)，其工業(yè)生產(chǎn)已于 2000 年禁止。在 2009年5月4日-8日在瑞士日內(nèi)瓦召開的“有關(guān)持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約”會議上，鑒于PF0S，其鹽化合物以及全氟辛烷磺酰氟等的劇毒性和持久性，將它們列入斯德哥爾摩公約新增受控化學(xué)物質(zhì)范圍。當(dāng)水生生物處于高濃度類雌激素干擾物的外源環(huán)境的毒害或污染下會遭受到急性毒性損傷，從而呈現(xiàn)出較為明顯的形態(tài)特征變化或生理變化，再結(jié)合采用多種生物標(biāo)記物，可以非常準(zhǔn)確和靈敏的檢驗(yàn)出水生生物是否受到外源環(huán)境中高濃度類雌激素干擾物的毒害或污染。當(dāng)水生生物受到低濃度的類雌激素干擾物的毒害或污染時，無論是外部的形態(tài)特征還是內(nèi)部的生理指標(biāo)都不會出現(xiàn)較為明顯的變化；此外，現(xiàn)有的用于評價(jià)類雌激素干擾物對于水生生物內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的生物標(biāo)志物均不同程度的存在敏感性較差、準(zhǔn)確率較低的缺陷。建立一種靈敏性好、準(zhǔn)確率高的評價(jià)水生生物內(nèi)分泌是否受到類雌激素干擾物干擾的方法，對于展開相關(guān)的科學(xué)研究以及環(huán)境污染物監(jiān)控和安全管理等具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明人進(jìn)行了銳意研究，發(fā)現(xiàn)，在暴露于低劑量的諸如全氟辛燒磺酰基化合物(Perfluorooctanesulphonate, PF0S)或全氟辛酸 (Perfluorooctanoic acid, PF0A)等類雌激素干擾物時，雖然斑馬魚,特別是雄性斑馬魚體征沒有發(fā)生明顯變化，但斑馬魚的血漿、全魚勻漿液或頭尾組織勻漿液中的卵黃蛋白原 (VTG)的含量明顯升高，通過檢測水生生物的血漿、全魚勻漿液或頭尾勻漿液的卵黃蛋白原 (VTG)的含量就可以靈敏、準(zhǔn)確地確定水生生物是否受到外源環(huán)境中低劑量類雌激素干擾物毒害或干擾，由此完成本發(fā)明。本發(fā)明的目的在于提供了一種檢驗(yàn)水生生物是否受到外源環(huán)境中低濃度類雌激素干擾物毒害或干擾的方法，包括以下步驟定量待檢測水生生物的血漿、全部身體勻漿液或頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量；當(dāng)待檢測水生生物血漿中的卵黃蛋白原的含量高于對照水生生物血漿中的卵黃蛋白原的含量，則表明待檢測水生生物受到低濃度類雌激素干擾物的毒害或干擾；或者當(dāng)待檢測水生生物的頭尾勻漿液或全部身體勻漿液中卵黃蛋白原的含量高于對照水生生物的頭尾勻漿液或全部身體勻漿液中卵黃蛋白原的含量，則表明待檢測水生生物受到低濃度類雌激素干擾物的毒害或干擾。其中，待檢測水生生物與對照水生生物是同一種水生生物，所述的對照水生生物是沒有遭受類雌激素干擾物毒害或污染的水生生物。本發(fā)明的方法中，所述的水生生物優(yōu)選為水生魚類；更優(yōu)選為斑馬魚 (Brachydanio rerio);特別優(yōu)選的，所述的斑馬魚是雄性斑馬魚(Brachydanio rerio)。斑馬魚(Brachydanio rerio)是淡水水族箱觀賞魚,原產(chǎn)于亞洲,體長約4公分， 具暗藍(lán)與銀色條紋。斑馬魚基因與人類基因的相似度達(dá)到87%，在其身上做藥物實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體，因此廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的研究，日益受到生物學(xué)家的重視。斑馬魚的胚胎是透明的，所以生物學(xué)家很容易觀察到藥物對其體內(nèi)器官的影響。 此外，雌性斑馬魚可產(chǎn)卵200枚，胚胎在24小時內(nèi)就可發(fā)育成形，這使得生物學(xué)家可以在同一代魚身上進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而研究病理演化過程并找到病因。卵黃蛋白原(VTG)是卵黃蛋白的前體，通常受循環(huán)的內(nèi)源性雌激素的刺激，由雌性卵生脊椎動物的肝臟產(chǎn)生，由血流進(jìn)入卵巢，并被發(fā)育中的雌性配子吸收并改變。斑馬魚有 7 種 VTG 亞型(Tong Y, Shan T, Poh Y K, et al. Molecular cloning of zebraf ish and medaka vitellogenin genes and comparison of their expression in response to 17 beta-estradiol [J] · Gene，2004，328 :25-36 ；Wang H，Tan J T，Emelyanov A，et al. Hepatic and extrahepatic expression of vitellogenin genes in the Zebrafish， Danio rerio [J] · Gene，2005，356 :91-100.)，其中含 87kb 片段基因組的 VTGU VTG2、VTG4、 VTG5、VTG6和VTG7主要分布于染色體22上，而含卵黃高磷蛋白較少的VTG3單獨(dú)存在于染色體11上。卵黃蛋白原分子進(jìn)化比較保守，不同種類之間具有一定同源性(Mouchel N， Trichet V,Naimi B Y,et al. Structure of a fish (Oncorhynchus mykiss)vitellogenin gene and its evolutionary implication[J] · Gene,1997，197 (1-2) :147-152)。本發(fā)明可以通過紫外分光光度法(董純定.生化藥物分析.南京中國藥科大學(xué)，1995. 142-151)、4-甲酸喹啉法(董純定.生化藥物分析.南京中國藥科大學(xué)，1995. 142-151)、Bradford法(董純定.生化藥物分析.南京中國藥科大學(xué)， 1995. 142-151)、Lowry法(董純定.生化藥物分析.南京中國藥科大學(xué)，1995. 142-151)、 凱氏法(國家藥典委員會.中國藥典2000版第2部.北京.化學(xué)工業(yè)出版社.2000.附錄 50. 171)等蛋白定量方法定量待檢測水生生物血漿、頭尾勻漿液或全部身體勻漿液中的卵黃蛋白原的含量或水平，這些定量方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所通曉。作為一種最常規(guī)的技術(shù)手段，本領(lǐng)域技術(shù)人員可米用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunoadsordent assay, ELISA)的方法測定待檢測水生生物血漿、頭尾勻漿液或全部身體勻漿液中的卵黃蛋白原的含量或水平。此外，本發(fā)明也可通過測定待檢測水生生物血漿、頭尾勻漿液或全部身體勻漿液中的卵黃蛋白原的mRNA的表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)；例如，可以通過測定斑馬魚卵黃蛋白原的7種亞型中的任意一種或多種在血漿、頭尾勻漿液或全部身體勻漿液中的表達(dá)水平，從而間接確定待測樣品中的卵黃蛋白原的含量是否高于對照樣品中的卵黃蛋白原的含量，同樣可以達(dá)到本發(fā)明的目的并實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果。作為參考，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用實(shí)時熒光定量PCR或半定量RT-PCR等方法對卵黃蛋白原的7種亞型的mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行定量； 也可以采用組織芯片和原位雜交技術(shù)檢測點(diǎn)陣石蠟組織芯片中 種VTG亞型的mRNA的表達(dá)水平，再用LeicaQ500MC圖像分析系統(tǒng)定量測試7種VTG亞型的mRNA表達(dá)水平，這些定量方法或手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟練掌握。本發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)斑馬魚暴露于低濃度類雌激素干擾物諸如全氟辛烷磺酰基化合物或全氟辛酸全氟碳化合物時，雄斑馬魚對PFOS暴露更為敏感，在極低環(huán)境劑量濃度(0. I μ g · L-1)處VTG水平就與對照組呈現(xiàn)顯著性差異，而在較高濃度(> 0. I μ g-Γ1)下呈現(xiàn)飽和抑制效應(yīng)；相比于雄魚，雌斑馬魚對PFOS暴露耐受性稍高，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)VTG水平的升高與劑量呈倒U型曲線，IOyg- Γ1的PFOS濃度暴露處與對照組呈現(xiàn)出顯著性差異。因此通過測定雄性斑馬魚的血漿、頭尾勻漿液或全部身體勻漿液中卵黃蛋白原的含量可更加靈敏和準(zhǔn)確的判定斑馬魚是否受到低濃度類雌激素的毒害或干擾。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)非常意外的發(fā)現(xiàn)，通過檢測水生生物的頭尾勻漿液中的卵黃蛋白原的含量就可以非常準(zhǔn)確和靈敏的檢驗(yàn)出待測斑馬魚是否受到低濃度類雌激素的毒害或干擾。獲取水生生物的血漿，尤其是斑馬魚的血漿，不僅操作繁瑣，而且還需要一定的專業(yè)操作水平，不過血漿中卵黃蛋白原的含量是非常準(zhǔn)確的；此外，對于獲取水生生物的全部身體勻漿液而言，結(jié)果表明全部身體勻漿液中卵黃蛋白原的含量變化趨勢與血漿中卵黃蛋白原的含量變化趨勢不完全一致，檢驗(yàn)效果相對差些；相對來說，獲取水生生物的頭尾勻漿液或全部身體勻漿液就容易的多，而且，頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量變化趨勢與血漿中卵黃蛋白原的含量變化趨勢具有一致性，檢驗(yàn)效果良好。采用斑馬魚的頭和尾制備勻漿液作為檢測樣品，不僅容易制備、而且成本也更低。由此，本發(fā)明的一種優(yōu)選的技術(shù)方案是定量待檢測水生生物的頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量；當(dāng)待檢測水生生物的頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量高于對照水生生物的頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量，則表明待檢測水生生物受到低濃度類雌激素干擾物的毒害或干擾。在本文中，所用術(shù)語“低濃度類雌激素干擾物”的定義是指濃度為 O. I μ g .Ti-IOOO μ g *L_1的類雌激素干擾物,進(jìn)一步優(yōu)選為濃度為O. I μ g ·T1-IOO μ g *L_1 的類雌激素干擾物，特別優(yōu)選為濃度為O. 1μ g · T1-IO μ g · L—1的類雌激素干擾物。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，所述的類雌激素干擾物包括全氟碳化合物、對特辛基苯酚或17 β -雌二醇；所述的全氟碳化合物優(yōu)選為全氟辛烷磺酰基化合物或全氟辛酸全氟碳化合物；進(jìn)一步優(yōu)選的，所述全氟辛烷磺酰基化合物是全氟辛烷磺酸。本發(fā)明的另一目的在于提供了將水生生物血漿、全部身體勻漿液或頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量水平作為檢驗(yàn)水生生物體內(nèi)內(nèi)分泌是否受到低濃度類雌激素干擾物毒害或干擾的生物標(biāo)記物；優(yōu)選的，所述的水生生物是水生魚類；進(jìn)一步優(yōu)選為斑馬魚 (Brachydanio rerio);更優(yōu)選的，所述的斑馬魚是雄性斑馬魚(Brachydanio rerio)。本發(fā)明將斑馬魚(Brachydanio rerio)暴露于各種不同濃度全氟辛燒磺酸 (PFOS)的環(huán)境中，測定斑馬魚血漿、全部身體勻漿液或頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低劑量的PFOS暴露均不同程度地引起雄性和雌性斑馬魚血漿、全部身體勻漿液或頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量升高，說明低濃度PFOS暴露對斑馬魚的內(nèi)分泌干擾作用明顯，斑馬魚的血漿、全部身體勻漿液或頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量水平可作為PFOS內(nèi)分泌干擾效應(yīng)評價(jià)的敏感生物標(biāo)志物；此外，本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 斑馬魚暴露于低濃度全氟辛烷磺酰基化合物后，雄性斑馬魚對PFOS暴露更為敏感，在極低環(huán)境劑量濃度(0. Iyg .171)處，其VTG水平就與對照組呈現(xiàn)顯著性差異；相比于雄性斑馬魚，雌性斑馬魚對PFOS暴露耐受性稍高，其在10 μ g -Γ1的PFOS濃度暴露處與對照組呈現(xiàn)出顯著性差異。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，通過檢測水生生物的頭尾勻漿液中的卵黃蛋白原的含量水平就可以非常準(zhǔn)確和靈敏的檢驗(yàn)出待測斑馬魚是否受到低濃度類雌激素的毒害或干擾。綜合考慮檢測靈敏性、準(zhǔn)確性、取樣的難易以及成本等因素，本發(fā)明優(yōu)選將斑馬魚的頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量水平作為檢驗(yàn)水生生物是否受到低濃度類雌激素干擾物毒害或干擾的生物標(biāo)記物；更優(yōu)選的，將雄性斑馬魚的頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量水平作為檢驗(yàn)水生生物是否受到低濃度類雌激素干擾物毒害或干擾的生物標(biāo)記物。作為本發(fā)明的具體的應(yīng)用方式，可以分別將斑馬魚的卵黃蛋白原或其編碼基因制備成生物芯片，例如蛋白芯片、基因芯片、組織芯片或細(xì)胞芯片等，采用高通量的方式檢驗(yàn)待檢測水生生物的血漿、全部身體勻漿液或頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量，再將其與對照水生生物相應(yīng)的血漿、全部身體勻漿液或頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量進(jìn)行比較，從而檢驗(yàn)水生生物內(nèi)分泌是否受到外源環(huán)境中低濃度類雌激素干擾物的毒害或干擾。蛋白芯片是將標(biāo)記了有特定熒光物質(zhì)的各種蛋白質(zhì)抗體有序地固定于載玻片等各種介質(zhì)載體上成為檢測芯片；然后，將待檢測的抗原樣品與芯片抗體作用，抗體上的熒光將指示對應(yīng)的蛋白質(zhì)及其表達(dá)數(shù)量。在將未與芯片上的蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的抗原洗去之后利用熒光掃描儀或激光共聚掃描技術(shù)，測定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，通過熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白之間相互作用的關(guān)系，達(dá)到測定各種基因表達(dá)的目的。應(yīng)用蛋白芯片可以研究在不同生理狀態(tài)或病理狀態(tài)下蛋白水平的量變，具有微型化、集成化和高通量化等優(yōu)點(diǎn)。
蛋白芯片的一般操作流程如下將抗體蛋白純化后溶于點(diǎn)樣液中；將溶有抗體蛋白的點(diǎn)樣液點(diǎn)樣于載玻片等介質(zhì)載體上，洗滌未結(jié)合的蛋白質(zhì)，封閉，得到檢測芯片；將待檢測的抗原蛋白樣品加入到蛋白芯片上進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，洗滌，檢測。作為本發(fā)明中蛋白芯片的一個具體應(yīng)用實(shí)例，可參考以下方式進(jìn)行制備斑馬魚卵黃蛋白原抗體，將斑馬魚卵黃蛋白原抗體純化后用熒光標(biāo)記后再溶解于點(diǎn)樣液中點(diǎn)樣到載玻片等載體上，洗滌未結(jié)合的蛋白質(zhì)，封閉，得到檢測抗體芯片；將待檢測的斑馬魚血漿、 全部身體勻漿液或頭尾勻漿液樣品加入到蛋白芯片上進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，將未與芯片上的蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的抗原洗去之后利用熒光掃描儀或激光共聚掃描技術(shù)測定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，根據(jù)所測定的抗體上的熒光強(qiáng)度得到所指示對應(yīng)的抗原蛋白質(zhì)及其含量。基因芯片是在載體(尼龍膜、玻璃片或硅片等)上按照預(yù)先設(shè)計(jì)的位置高密度有序的排列大批量的核酸探針(也稱DNA芯片或DNA微陣列)，形成高密度點(diǎn)陣，與樣品中的靶分子作用后，通過分子雜交技術(shù)在相同條件下進(jìn)行分子反應(yīng)，采用同位素法、化學(xué)熒光法或化學(xué)發(fā)光法等方法對反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行顯示，并采用相應(yīng)的方法進(jìn)行定量。作為本發(fā)明基因芯片的一個具體應(yīng)用實(shí)施，可參考以下方式將水生生物的卵黃蛋白原7種亞型的任意一種或多種mRNA作為探針采用原位點(diǎn)樣法或直接點(diǎn)樣法等方式將探針按照預(yù)先設(shè)計(jì)的位置高密度有序的排列或點(diǎn)樣到尼龍膜載體(或玻璃片、硅片等載體)上，得到基因芯片；從待檢測的水生生物的血漿、全部身體勻漿液或頭尾勻漿液中提取 VTG mRNA,將所提取的VTG mRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物的末端用熒光標(biāo)記后與芯片上的探針分子進(jìn)行分子雜交，采用共聚焦熒光掃描儀進(jìn)行信號檢測，定量待測樣品中VTG mRNA的表達(dá)水平，再與對照樣品中的VTG mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行比較，就可快速、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)出待檢測水生生物體內(nèi)內(nèi)分泌是否受到外源環(huán)境中低濃度類雌激素干擾物毒害或干擾。組織芯片，又稱組織微陣列，是將大量的組織片有序的排列于載體上而得到的微縮組織切片，用于研究同一基因或蛋白質(zhì)分子在不同細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況，具有體積小、高通量、豐富樣本、快速省時等優(yōu)點(diǎn)。組織芯片還可以與免疫組化、熒光核酸原位雜交、 RNA原位雜交等技術(shù)相結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考以下方法制備組織芯片，包括待測樣品的收集、芯片的制備、染色及染色后掃描、數(shù)據(jù)處理。其中，制作組織芯片時多采用石蠟組織芯片，石蠟組織芯片的制作是采用組織芯片制作機(jī)的活檢細(xì)針，從大量供體蠟塊組織中鉆取若干個圓柱形的組織芯，然后將樣本整齊的放到受體蠟塊中制作組織芯片蠟塊，對組織芯片蠟塊進(jìn)行切片，再將切片轉(zhuǎn)移到載玻片上。利用顯微鏡精密的機(jī)械控制功能，進(jìn)行打孔、取樣、點(diǎn)樣、觀察與定位、通過化學(xué)染色或原位雜交，載玻片上所有標(biāo)本的信號可以同時顯現(xiàn)出來。與普通切片相比，組織芯片的單次可以同時對上百個樣本進(jìn)行免疫組織化和原位雜交，可以大規(guī)模分析樣本，并具有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)精確性和高效性等優(yōu)點(diǎn)。


圖I示出PFOS暴露(O. 1,1,10，100 μ g .L—1)分別對雄性斑馬魚血漿、全魚和頭尾勻漿中VTG水平的影響；其中，雄性斑馬魚對照組血漿VTG水平為3882. 6±521. 8ng πιΓ1, 對照組全魚勻漿中VTG水平為2705. 4±1716. Ong · mL—1，對照組頭尾勻漿中VTG水平為114. 6 ±68. 3ng · mL、圖2示出PFOS暴露(O. 1，1，10，100 μ g · Γ1)分別對雌性斑馬魚血漿、 全魚和頭尾勻漿中VTG水平的影響；其中，雌性斑馬魚對照組血漿VTG水平為 466530. 0±205096. Ong · ml/1，對照組全魚勻漿中 VTG 水平為 53454. 5±30406. 9ng · πι Λ 對照組頭尾勻漿中VTG水平為21959. 9±9721. 6ng · mL'
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚明確。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。試驗(yàn)例低濃度的全氟辛烷磺酸暴露對于斑馬魚血■漿、全魚勻漿或頭尾勻漿中卵黃蛋白原的水平的影響試驗(yàn)I.材料與方法I. I儀器與試劑儀器多功能酶標(biāo)儀(BIO-RAD 680，BIO-RAD公司，美國)，洗板機(jī)(WELLWASH 4MK2, Thermo公司，美國)，混合型球磨儀(MM400，RETSCH公司，德國)，冷凍離心機(jī)(3-18K， Sigma公司，德國)，全自動雪花制冰機(jī)(YT-MS-70，北京海淀晶晶科技有限公司)，反滲透制水機(jī)(R0-500型，北京英諾格林有限公司)。試劑全氟辛燒磺酸(Assay LC-MS 98 %, Sigma-Aldrich公司，美國)，抑肽酶(BioBasic INC公司，加拿大)，斑馬魚卵黃蛋白原ELISA檢測試劑盒(Zebrafish vitellogenin ELISA kit, Biosense Laboratories,挪威)。I. 2供試生物實(shí)驗(yàn)魚斑馬魚(Brachydanio rerio)，魚齡3個月，體長I. 0-1. 5cm,體重 0. 120-0. 220g，雌雄兼有，購于北京市東郊市場。采用反滲透純凈水機(jī)制備的水。試驗(yàn)前將雌雄斑馬魚分開預(yù)養(yǎng)，在試驗(yàn)條件下預(yù)養(yǎng)7d,水溫(25±2) °C,飼養(yǎng)容器為2L燒杯,飼養(yǎng)密度不大于Ig ·Ι^(即每升水容納斑馬魚的質(zhì)量為Ig)，每日光照12-14h，早晚定時投喂孵化的豐年蟲2次，并每天清除排泄物，預(yù)養(yǎng)期間斑馬魚死亡率不超過5%。I. 321天毒性試驗(yàn)預(yù)養(yǎng)結(jié)束后停止喂食ld，然后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)設(shè)置染毒濃度為0. I μ g · L-1, 1μ g · Γ',ΙΟμ g · Γ',ΙΟΟμ g · L—1的4個實(shí)驗(yàn)組，同時設(shè)置空白對照組，分別對雌、雄斑馬魚進(jìn)行21d的毒性試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在2L燒杯中進(jìn)行，每缸內(nèi)盛有I. 8L不同濃度的染毒液，且每缸隨機(jī)投放8尾斑馬魚。暴露期間水溫維持在(25±2)°C，每日光照12-14h，采用每周兩次更換全部染毒液的半靜態(tài)法進(jìn)行暴露，暴露周期為21d，暴露期間每天喂食2次，喂食量以實(shí)驗(yàn)魚正好吃完為宜。I. 4血漿和組織勻漿液制備21d染毒結(jié)束后,撈出斑馬魚并置于冰上冷凍處死,用在肝素鈉溶液中浸泡過的手術(shù)剪刀橫向剪開斑馬魚尾部，用浸泡過肝素鈉溶液的毛細(xì)管取血，按I : 6(血液稀釋液) 加入預(yù)冷的血樣稀釋液(pH 7. 4 0. OlM的PBS ； IOOmg · L—1肝素鈉溶液;6 μ g · mL—1抑肽酶)，混勻后4°C，15000g離心lOmin，離心后血漿從血樣本中分離且無溶血現(xiàn)象。取上清液分裝，于-80°C保存。將取血后的魚頭和魚尾沿魚鰭切分,或取全魚置于冰上冷凍處死后,進(jìn)行稱重。按 200mg魚重lmL(pH 7. 4 :0. OlM的PBS)比例加入預(yù)冷的稀釋液。用手術(shù)剪刀剪碎魚頭、 魚尾或全魚，然后采用混合型球磨儀以30Hz/l. 5min勻漿直至混合物勻質(zhì)化，混勻后4°C， 5000g離心30min，離心后上清液析出與脂肪和肌肉分離。將吸液管的尖端伸入表面的脂肪層下，小心吸取表面無脂肪或顆粒部分，分裝，于-80°C保存。I. 5卵黃蛋白原(VTG)的ELISA檢測用ELISA檢測試劑盒分別對雌性和雄性斑馬魚不同組織的VTG進(jìn)行檢測分析。主要操作步驟包括將預(yù)處理好的血樣用樣品稀釋液(O. OlM PBS緩沖液；pH 7. 4 ;包含1% BSA)進(jìn)行稀釋處理。每孔加入IOOyL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品于96孔酶標(biāo)板中，封閉酶標(biāo)板，室溫 (20-250C )孵化lh。每孔用300 μ L洗液洗板三次后，每孔加入按I : 350稀釋的一抗各 100 μ L，室溫(20-25°C )孵化lh。再洗板三次，每孔加入按I : 2000稀釋的二抗各100 μ L， 室溫(20_25°C )孵化lh。洗板五次后，每孔加入100 μ L底物顯色液，室溫(20_25°C )避光 30min,之后每孔加入50 μ L的2Μ的H2SO4終止反應(yīng)，5min后于492nm處測吸光值。I. 6數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行處理，采用SPSS 13. O統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析， 各數(shù)據(jù)均用平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean土SD)表示，各組間的差異采用單因素方差分析 (ONE-WAY AN0VA)，p 彡 O. 05 為差異顯著。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. I雄性斑馬魚血漿、全魚和頭尾勻漿液中VTG含量21天染毒結(jié)束時，4個實(shí)驗(yàn)組的雄性斑馬魚沒有死亡出現(xiàn)。對血漿、全魚勻漿液和頭尾勻漿液中VTG含量進(jìn)行檢測和分析的結(jié)果見圖I。圖I中的數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差 (Mean土SD)表示，每組數(shù)據(jù)樣本量η > 3。柱形上方參數(shù)有一個字母相同則無顯著性差異， 反之則有顯著性差異(P ( O. 05)。由圖I中可看出，PFOS暴露引起實(shí)驗(yàn)組的雄性斑馬魚血漿、全魚勻漿液和頭尾勻漿液中的VTG水平的升高，實(shí)驗(yàn)組的雄性斑馬魚不同組織中VTG水平及水平高低為血漿 (103ng · mL—1) >全魚勻衆(zhòng)(103ng · mL—1) >>頭尾勻衆(zhòng)(102ng · mL—1)。其中，PFOS暴露引起實(shí)驗(yàn)組的雄性斑馬魚血漿和頭尾勻漿中VTG水平的升高與劑量呈負(fù)相關(guān)，在O. Iug-L-1暴露濃度處與對照組呈現(xiàn)顯著性差異；而全魚勻漿液中的VTG 水平升高相比于對照組有升高，但均沒有顯著性差異。注雄性斑馬魚對照組(沒有遭受類雌激素干擾物毒害或干擾的雄性斑馬魚)血漿VTG水平為3882. 6 ±521. 8ng · mL—1，全魚勻漿中 VTG 水平為 2705. 4±1716. Ong · mL—1，頭尾勻漿中 VTG 水平為 114. 6±68. 3ng · mL'2. 2雌性斑馬魚血漿、全魚和頭尾勻漿液中VTG含量21天染毒結(jié)束時，4個實(shí)驗(yàn)組的雌性斑馬魚沒有死亡出現(xiàn)。對血漿、全魚勻漿液和頭尾勻漿液中VTG含量進(jìn)行檢測和分析的結(jié)果見圖2。圖2中的數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差 (Mean土SD)表示，每組數(shù)據(jù)樣本量η > 3。柱形上方參數(shù)有一個字母相同則無顯著性差異， 反之則有顯著性差異(P ( O. 05)。由圖2中可看出，PFO S暴露引起實(shí)驗(yàn)組的雌性斑馬魚血漿、全魚勻漿液和頭尾勻漿液中的VTG水平的升高，實(shí)驗(yàn)組的雌性斑馬魚不同組織中VTG水平及水平高低為血漿 (105ng · ι Γ1) >>全魚勻漿(104ng · mL—1) >頭尾勻漿(104ng · mL—1)，而且，VTG 水平雌魚 >>雄魚。其中，PFOS暴露弓丨起雌魚血漿和頭尾勻漿中VTG水平的升高與劑量呈倒U型曲線， 在10 μ g · L—1暴露濃度處與對照組呈現(xiàn)顯著性差異；而全魚勻漿液中的VTG水平升高相比于對照組有升高，但均沒有顯著性差異；注雌性斑馬魚對照組(沒有遭受類雌激素干擾物毒害或干擾的雄性斑馬魚)血漿VTG水平為466530. O ±205096. Ong .mL-1,全魚勻漿中VTG 水平為 53454. 5±30406. 9ng · mL—1，頭尾勻漿中 VTG 水平為 21959. 9±9721. 6ng · mL'
權(quán)利要求
1.一種檢驗(yàn)水生生物是否受到外源環(huán)境中低濃度類雌激素干擾物毒害或干擾的方法， 其特征在于，該方法包括以下步驟定量待檢測水生生物的血漿、全部身體勻漿液或頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量；當(dāng)待檢測水生生物血漿中的卵黃蛋白原的含量高于對照水生生物血漿中的卵黃蛋白原的含量，則表明待檢測水生生物受到低濃度類雌激素干擾物的毒害或干擾；或者當(dāng)待檢測水生生物的頭尾勻漿液或全部身體勻漿液中卵黃蛋白原的含量高于對照水生生物的頭尾勻漿液或全部身體勻漿液中卵黃蛋白原的含量，則表明待檢測水生生物受到低濃度類雌激素干擾物的毒害或干擾；其中，待檢測水生生物與對照水生生物是同一種水生生物，所述的對照水生生物是沒有遭受類雌激素干擾物毒害或干擾的水生生物。
2.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的水生生物是水生魚類，優(yōu)選為斑馬魚(Brachydanio rerio);更優(yōu)選的，所述的斑馬魚是雄性斑馬魚(Brachydanio rerio)。
3.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述低濃度類雌激素干擾物的濃度為 O. I μ g · L^1-IOOO μ g · L—1 ;優(yōu)選為 O. I μ g · L^1-IOO μ g · L—1 ;最優(yōu)選為O.I μ g · L^1-IO μ g · L—1。
4.按照權(quán)利要求I或3所述的方法，其特征在于所述的類雌激素干擾物包括全氟碳化合物、對特辛基苯酚或17 β -雌二醇；所述的全氟碳化合物包括全氟辛烷磺酰基化合物或全氟辛酸化合物；優(yōu)選的，所述全氟辛烷磺酰基化合物是全氟辛烷磺酸。
5.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟定量待檢測水生生物的頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量；當(dāng)待檢測水生生物頭尾勻漿液中的卵黃蛋白原的含量高于對照水生生物頭尾勻漿液中的卵黃蛋白原的含量，則表明待檢測水生生物受到低濃度類雌激素干擾物的毒害或干擾；其中，待檢測水生生物與對照水生生物是同一種水生生物，所述的對照水生生物是沒有遭受類雌激素干擾物毒害或干擾的水生生物。
6.按照權(quán)利要求I或5所述的方法，其特征在于采用酶聯(lián)免疫吸附方法定量待檢測水生生物的血漿、全部身體勻漿液或頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量。
7.水生生物頭尾勻漿液、全部身體勻漿液或血漿中卵黃蛋白原的含量水平作為檢驗(yàn)水生生物是否受到低濃度類雌激素干擾物毒害或干擾的生物標(biāo)記物的用途。
8.按照權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的水生生物是水生魚類，優(yōu)選為斑馬魚(Brachydanio rerio);更優(yōu)選的，所述的斑馬魚是雄性斑馬魚(Brachydanio rerio)。
9.按照權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述低濃度類雌激素干擾物的濃度為 0. I μ g · L^1-IOOO μ g · L—1 ;優(yōu)選為 0. I μ g · L^1-IOO μ g · L—1 ;最優(yōu)選為0.I μ g · L^1-IO μ g · L—1。
10.按照權(quán)利要求7或9所述的用途，其特征在于所述的類雌激素干擾物包括全氟碳化合物、對特辛基苯酚或17 β -雌二醇；所述的全氟碳化合物包括全氟辛烷磺酰基化合物或全氟辛酸化合物；優(yōu)選的，所述全氟辛烷磺酰基化合物是全氟辛烷磺酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種調(diào)控斑馬魚卵黃蛋白原水平的方法，該方法包括定量待檢測水生生物的血漿、全部身體勻漿液或頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量；當(dāng)待檢測水生生物的血漿、全部身體勻漿液或頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量高于對照水生生物的血漿、全部身體勻漿液或頭尾勻漿液中卵黃蛋白原的含量，則表明待檢測水生生物受到低濃度類雌激素干擾物的毒害或干擾。本發(fā)明方法能夠準(zhǔn)確、靈敏的檢驗(yàn)出水生生物是否受到外源環(huán)境中低濃度的類雌激素干擾物的毒害或干擾，對于展開相關(guān)的科學(xué)研究以及環(huán)境污染物監(jiān)控和安全管理等具有重要的意義。
文檔編號G01N33/48GK102590488SQ20121000780
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者于文蓮, 周新, 崔媛, 程艷, 謝文平, 陳會明 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院