專利名稱：：一種用于蓼科植物來源藥材的檢測方法
技術領域：
：本發明涉及天然藥物的質量控制領域，具體涉及基于高效液相色譜-可變波長檢測器(HPLC-VWD)的分段檢測技術用于蓼科植物來源藥材(如大黃、虎杖、何首烏等)中多類成分的同時檢測。
背景技術：
：蓼科植物，多草本或灌木，莖節常膨大。托葉包于莖節形成托葉鞘。花兩性或單性異株；單被，花被3-6，常花瓣狀；子房上位。瘦果或小堅果，常包于宿存花被內。本科約有30屬1200種，全球分布。我國15屬200余種，其中藥用種類約120種，全國均有分布。主要的屬有蓼屬(Polygonum)、大黃屬(liheum)、酸模屬(Rumex)等。主要的生藥有大黃、何首烏、虎杖、拳參、篇蓄、金蕎麥、辣蓼、杠板歸、蓼大青等。蓼科植物普遍含有蒽醌類、黃酮類、鞣質及各種苷類。蓼科植物來源藥材，如大黃、虎杖、何首烏等臨床應用相當廣泛，國內外關注度亦較高。近年來，針對蓼科植物的抗腫瘤活性有廣泛的研究。然而，關于蓼科植物的肝毒性報道也逐漸增多。因此，建立簡單適用的分析方法用于蓼科植物所含化學成分的定量檢測顯得尤為重要。建立簡單、快速、適用的檢測方法將有利于對蓼科植物的安全性及有效性評價。2010版藥典中針對蓼科植物來源藥材的含量測定多為利用高效液相色譜串聯紫外檢測器(HPLC-UV)用于藥材的定量檢測，這種方法只檢測一類或兩類成分，很難反映出藥材的整體特點，難以達到對藥材安全性及有效性的全面評價。目前，對藥材進行多類成分同時檢測已成為藥材質量控制的重要手段。Komatsu等建立一種HPLC-UV方法，在^Onm波長下定量檢測大黃藥材中30個化學成分，然而在280nm波長下很多化合物未達最大吸收，且在此方法中很多化合物未能基線分離，導致定量不準確。Lin等利用HPLC-UV方法用于大黃的定量檢測，該方法分別在^Onm下檢測二苯乙烯類和沒食子酰葡萄糖，在254nm下檢測蒽醌類化合物，然而不同吸收波長下需要分別檢測，加大了工作量。因此，同時定量蓼科植物中多種類型化合物，用于蓼科植物的質量控制成為亟待解決的問題。正因為蓼科植物所含化學成分種類較多，且各類化合物紫外吸收特征不同，利用HPLC-VffD用于蓼科植物的質量控制一直難以實現。這制約了蓼科植物的活性及毒性研究。因此，建立合適的定量檢測技術對蓼科植物的藥效及毒效物質基礎研究具有重要的意義。以HPLC-VWD為基礎，應用分段檢測技術，研究一種可用于同時定量蓼科植物中酚酸類、黃酮類、二苯乙烯類和蒽醌類的方法，是本
技術領域：
面臨的主要問題。
發明內容本發明的目的在于建立一種基于HPLC-VWD的分段檢測技術，用于同時定量檢測蓼科植物中4種不同類型化合物的定量檢測，并應用于蓼科藥材的質量控制。本發明通過如下方法實現我們建立基于HPLC-VWD的分段檢測技術首先用HPLC將待檢測的各個化合物很好的分離開來，其次VWD可在不同時間段檢測不同的吸收波長，使得每一類化合物都能在其最大吸收處被檢測，從而大大提高了檢測的靈敏度，用于同時檢測和定量蓼科藥材中四種不同類型化合物，最后我們通過色譜條件選擇、方法學考察等研究，優化和確證建立方法的適用性，并將此方法用于蓼科藥材的質量控制。本發明的具體方案如下使用高效液相色譜儀，可變波長檢測器，色譜工作站，將混合標準品液或蓼科藥材提取液，采用如下色譜條件分析色譜柱安捷倫ZorbaxStableBond-C18柱(50mmX4.6mmI.D.，1·8μm)；柱溫20-35°C;流動相A相為0.05-0.5%甲酸水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫程序:0-2min,5-10%(ν/ν)B；2_4min，10-15%B；4-lOmin，15-15%B；10-llmin,15-21%B；ll_14min，21-21%B；14_21min，21-29%B；21_23min，29-40%B；23-25min,40-50%B；25-26min,50-50%B；26-28min,50-80%B；28-30min,80-100%B；30-32min,100-100%B。流速0.8ml/min；檢測波長0-9min和17_25min為280nm;6_12min和15_19min為320nm；12-14.5min和21_32min為254nm。優選的柱溫為25°C。優選的甲酸水濃度為0.1%，為體積百分比。優選的檢測波長0-6min和18_24min為^Onm；6_12min和14.5_18min為320nm；12-14.5min和24_32min為254nm。上述液相色譜儀進樣量優選為5μ1。本發明利用四類13種不同的化合物用于方法的建立及方法學的考察。這些標準品分別為酚酸類(1沒食子酸)、黃酮類O兒茶素)、二苯乙烯類(3虎杖苷、4二苯乙烯苷和7白藜蘆醇)和蒽醌類(5番瀉苷Β、6番瀉苷Α、8大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷、9蘆薈大黃素、10大黃酸、11大黃素、12大黃酚和13大黃素甲醚)。本發明利用HPLC偶聯短柱來分析待測樣品，可以有效的縮短分析時間，提高分析效率。不同蓼科藥材，如虎杖、大黃、何首烏，以及13個混標，均能在32min內明顯的分離開來，為后面分段檢測技術提供基礎。圖1為混合標準品溶液在傳統HPLC-VWD方法和基于HPLC-VWD的分段檢測技術下的色譜圖對比，其中(A)、(B)和(C)分別為傳統HPLC-VWD方法在不同波長下分次、分別檢測所得色譜圖，⑶為基于HPLC-VWD的分段檢測技術下色譜圖，圖中各編號所指引標準品，如前所標示。由圖可見，分段檢測技術可在一次進樣中同時檢測具有不同吸收波長的多種類型化合物，相比傳統方法，該方法更加省時高效，且能保持各類化合物均在其最大吸收處被檢測，提高了檢測的精密度。本發明，以四類13種混合標準品溶液為研究對象，對所建立的HPLC-VWD的分段檢測技術進行方法學考察，包括線性、檢測限、定量限、精密度，并且對比其與傳統方法的區別。表1.基于HPLC-VWD分段檢測技術與傳統HPLC-VWD下13個化合物的線性、檢測4限和定量限c權利要求1.一種基于高效液相色譜串聯可變波長檢測器(HPLC-VWD)，用于蓼科植物來源藥材的檢測方法包括色譜分析方法的建立與優化、用建立的方法用于對蓼科來源藥材的定量檢測，其特征采用如下方法獲得使用高效液相色譜儀，可變波長檢測器，色譜工作站，將混合標準品液或蓼科藥材提取液，采用如下色譜條件分析色譜柱鍵合硅膠填料色譜柱；柱溫:25°C；流動相A相為0.甲酸水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫程序:0-2min,5-10%(ν/ν)B；2_4min，10-15%B；4-lOmin，15-15%B；10-llmin，15-21%B;ll_14min，21-21%B；14_21min，21-29%B;21_23min，29-40%B；23-25min,40-50%B；25-26min,50-50%B；26-28min,50-80%B；28-30min,80-100%B；30-32min,100-100%B。流速:0.8ml/min；檢測波長0_6min和18_24min為^Onm；6_12min和14.5_18min為320nm；12-14.5min和24-32min為254nm。2.權利要求1的分析方法，其中柱溫是20-40°C。3.權利要求1的分析方法，其中色譜柱是碳八或十八烷基鍵合硅膠填料色譜柱。4.權利要求1的分析方法，其中甲酸水濃度為0.05-0.5%，為體積百分比。5.權利要求1的分析方法，其中流速為0.3-1.3ml/min。6.權利要求1的分析方法，其中液相色譜儀進樣量為1-15μ1。7.權利要求1的分析方法，其中檢測波長為0-9min和17_25min為^Onm；6-ianin和15-19min為320nm；12-14.5min和21_32min為254nm。全文摘要本發明涉及天然藥物的質量控制領域，具體涉及基于高效液相色譜-可變波長檢測器(HPLC-VWD)的分段檢測技術，用于蓼科植物來源藥材(如大黃、虎杖、何首烏等)中多類成分的同時檢測。本發明首先使用HPLC將待檢測的各個化合物很好的分離開來，其次設定VWD在不同時間段檢測不同的吸收波長，使得每一類化合物都能在其最大吸收處被檢測，從而達到同時檢測和定量蓼科藥材中四種不同類型化合物的目的。文檔編號G01N30/02GK102539574SQ20121000936公開日2012年7月4日申請日期2012年1月13日優先權日2012年1月13日發明者李會軍,李萍,鄧婷,馬江申請人:中國藥科大學