一種精子細胞凋亡相關基因的基因檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種精子細胞凋亡相關基因檢測方法，其特征在于，通過同時檢測分析個體的NOS3基因、FASLG基因SNPs位點基因攜帶型為所有的受檢者提供精子細胞凋亡相關基因檢測，并結合中國人群中特有的與無精癥、少精癥相關的環境暴露因素和生活方式影響因素對男性的不育發病風險進行預測評估。
【專利說明】—種精子細胞凋亡相關基因的基因檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種精子細胞凋亡相關基因檢測方法，可用于評估精子細胞凋亡相關基因檢測，屬于分子生物學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]無精癥、少精癥是最為常見的男性不育原因之一。據世界衛生組織統計，全球約有10%~15%育齡夫婦因各種因素影響不能正常生育，其中男性因素占到一半，15%~20%的男性病因是由無精子癥所致。目前認為生精相關基因的缺失、突變和遺傳多態性是男性生精障礙的重要遺傳病因。
[0003]精子發生過程受許多基因的精密調控，基因缺失或突變均可導致精子發生過程中斷。精子成熟是精原細胞增殖、分化、凋亡的精確調控過程，其中生精細胞凋亡調控尤為重要。生精細胞凋亡參與維持精子發生過程的動態平衡，維持支持細胞與生精細胞的最佳比例，清除基因異常生殖細胞，調節生精過程中精子數量和質量，是機體保持生殖遺傳穩定的重要防御機制。精子成熟是精原細胞增殖、分化、凋亡的精確調控過程，其中生精細胞凋亡調控尤為重要。凋亡可清除異常精細胞并穩定精子數量。現已明確FAS/ FASLG、p53和Bcl-2基因家族等基因通過不同途徑參與精細胞凋亡。精細胞凋亡是一個自發性的凋亡過程，凋亡相關基因變異而引發精細胞凋亡不足或過度都會影響精子數量和質量，從而引發生精障礙，最終導致男性不育。
[0004]在自然狀態和正常生精過程中，環境因素如激素、溫度、化學藥物和放射線及腫瘤均可誘導生殖細胞凋亡。研究證明，睪丸生精細胞凋亡對電離輻射敏感，很低劑量照射誘導生精細胞凋亡增加。睪酮水平的降低是生精凋亡的重要原因。促卵泡激素被拮抗或其水平降低，都可導致生殖細胞凋亡調控異常。
[0005]由于遺傳體質的不同，不同機體的生精細胞凋亡調控也有所差異，而這種差異會影響到機體不育癥的易感性。通過檢測可以了解自身凋亡相關基因的情況，遠離電離輻射并改善吸煙等不健康的生活方式，適當補充鋅硒等營養素，提高精子質量，孕育健康寶貝。
[0006]研究發現N0S3、FASLG基因與中國男性精子細胞凋亡有關。
[0007]基因簡介:N0S3全稱 nitric oxide synthase 3 (endothelial cell),中文名為內皮型一氧化氮合成酶。定位于7q36，全長23，529bp，mRNA長4，327nt，編碼由1，203個氨基酸殘基組成的蛋白質。N0S3主要分布于冠狀血管及心腔面的內膜，主要功能是參與精氨酸和脯氨酸代謝， 并催化生成一氧化氮(NO)。NO是一種內皮松弛因子，具有舒張血管、調節血流、抑制血管平滑肌細胞增殖、抑制血小板和白細胞粘附等重要功能，參與多種疾病的病理生理過程。
[0008]內皮型一氧化氮合成酶(N0S3)合成NO的功能，需要依賴蛋白激酶B (PKB/Akt)的激活。蛋白激酶B (PKB/Akt)通過磷酸化eNOS將其激活，并啟動在內皮的一氧化氮合成反應。eNOS上與蛋白激酶B (PKB/Akt)磷酸化反應相關的一些氨基酸如果發生改變，就將影響到eNOS的功能和NO的合成。NO合成后，將啟動cGMP依賴的一系列反應。在這個過程中，NO表現為一種第二信使，通過cGMP繼續傳導信號，可以達到舒張血管、調節血流等功能和作用。NO-cGMP通路還關系到機體的能量平衡，并由此對機體其它各個方面產生影響。
[0009]位點簡介:N0S3 G894T是位于基因第8號外顯子上的一個G/T突變，其第894位堿基G突變成T，相應蛋白產物第298位上的谷氨酸則被替換成天冬氨酸(Glu298Asp)。此突變為錯義突變，導致N0S3結構成分發生改變，從而降低酶活性。
[0010]一氧化氮合酶(NOS)屬于黃素蛋白類，包括神經型NOS(nNOS)、誘導型N0S( iNOS)和內皮NOS (eNOS)。NOS是體內催化左旋精氨酸和分子氧相互反應的限速酶，睪丸內反應生成的NO含量可調節性激素水平、睪丸的生精功能、睪丸微循環和精子質量。人eNOS基因發生變異，其編碼的NOS成分和含量則發生變化，從而影響睪丸NO含量生成。NO生成過多或過少導致睪丸生精功能及精子生活內環境發生改變，引起少精、死精、精子質量降低等病理變化。
[0011]基因簡介=FASLG基因定位于lq23，與0X-40L基因相鄰，由5個外顯子組成。FASLG只表達于活化T淋巴細胞，其它細胞如B細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、內皮細胞以及胸腺細胞都不表達FASLG，但在睪丸組織中，卻可見到高表達的FASLGt5FASLG由胞膜外區(179aa)、跨膜區(22aa)和胞漿區(77aa)組成，N端150個氨基酸為TNF超家族同源區，同源性主要表現在形成b折疊股的序列，在b折疊股c和d之間有一對保守的二硫鍵，對其空間結構的形成有作用。FASLG在胞膜外區有4個N-糖基化位點，經過糖基化的FASLG的分子量為36-43kD。 [0012]FAS / FASLG是介導精細胞凋亡的一對膜蛋白，FAS為I型跨膜受體蛋白，其配體FASL則是II型跨膜蛋白，屬腫瘤壞死因子家族，可觸發交叉連接與FAS細胞死亡信號級聯。FAS和FASLG基因表達僅限于生殖細胞和支持細胞中，FAS和FASLG交聯后傳導細胞凋亡信號，引起FAS抗原表達細胞凋亡。人類FAS和FASLG基因在睪丸發育的不同階段表達引發異常生殖細胞凋亡，上述兩個基因啟動子序列堿基分布多態性可影響轉錄活性而導致正常精細胞凋亡引發生精障礙。
[0013]位點簡介:FASLG C844T是位于FASLG基因啟動子區的一個C/T多態，位于CAAT/增強結合蛋白p元件(C/EBP ^ )的一段結合序列內。FASLG C844T多態性可能會影響FASLG的表達，進而影響FASLG介導的凋亡信號轉導。
[0014]本發明的目的是提供一種精子細胞凋亡相關基因檢測方法，并結合中國人群中特有的與無精癥、少精癥相關的環境暴露因素和生活方式影響因素對男性的不育發病風險進行預測評估。

【發明內容】

[0015]本發明的目的是提供一種精子細胞凋亡相關基因檢測方法，并結合中國人群中特有的與無精癥、少精癥相關的環境暴露因素和生活方式影響因素對男性的不育發病風險進行預測評估。
[0016]為實現以上目的，本發明提供一種精子細胞凋亡相關基因檢測方法。其具體步驟為:
步驟1:檢測的樣品類型與采樣方法
用采樣拭在口腔中分別左右兩腮至少需要各上下刮40次以上，以保證采集到足量的細胞樣本；
步驟2:基因組DNA的抽提方法
采用硅膠吸附法抽提每一個口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2小時一 2.5小時，經電泳檢測后，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進入下一步檢測；
步驟3:熒光定量PCR反應
將每一個被測者樣本分別放入2個反應孔，同時檢測2個位點，即一氧化氮合酶(N0S3)rsl799983,TNF-a家族成員Fas配體基因(FASLG) rs763110，另外根據實驗需要增設不含DNA模版的NTC空白對照孔；
每一個反應孔的基因分型可以根據下表的引物和探針設計，采用TaqMan?_MGB技術，進行檢測試劑合成；
在每一個反應孔中加入試劑為熒光定量PCR反應體系，總體積為IOMl,即濃度為20ng/m的DNA模板2W ,m IOX熒光定量PCR反應緩沖液ABI Taqman ? MGB、0.1W 25mMd NTP合成DNA的四種脫氧核苷酸底物、0.5W 25mM MgCl2溶液、0.02W (5unitsM)TaqDNA聚合酶、去離子水4.98W、3個位點分別采用不同的正向引物(20剛，0.225W )、反向引物(20剛，0.225|^1)、￥1(:熒光探針(10剛，0.25W )和FAM熒光探針(10剛，0.25W)工具進行檢測，基因序列及其引物探針如下:
一氧化氮合酶(NOS3) rsl799983
【權利要求】
1.一種精子細胞凋亡相關基因檢測方法，其特征在于，具體步驟為 步驟1:檢測的樣品類型與采樣方法 用采樣拭在口腔中分別左右兩腮至少需要各上下刮40次以上，以保證采集到足量的細胞樣本； 步驟2:基因組DNA的抽提方法 采用硅膠吸附法抽提每一個口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2小時一 2.5小時，經電泳檢測后，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進入下一步檢測； 步驟3:熒光定量PCR反應 將每一個被測者樣本分別放入2個反應孔，同時檢測2個位點，即一氧化氮合酶(NOS3)rsl799983,TNF-a家族成員Fas配體基因(FASLG) rs763110，另外根據實驗需要增設不含DNA模版的NTC空白對照孔； 每一個反應孔的基因分型可以根據下表的引物和探針設計，采用TaqMan?_MGB技術，進行檢測試劑合成； 在每一個反應孔中加入試劑為熒光定量PCR反應體系，總體積為IOMl,即濃度為20ng/m的DNA模板2W ,m IOX熒光定量PCR反應緩沖液ABI Taqman ? MGB、0.1W 25mMd NTP合成DNA的四種脫氧核苷酸底物、0.5W 25mM MgCl2溶液、0.02W (5unitsM)TaqDNA聚合酶、去離子水4.98W、3個位點分別采用不同的正向引物(20剛，0.225W )、反向引物(20剛，0.225|^1)、￥1(:熒光探針(10剛，0.25W )和FAM熒光探針(10剛，0.25W)工具進行檢測，其引物探針如下: 帶VIC熒光A型探針 TGAgCCCCCAGAA 帶FAM熒光G型探針 TGAtCCCCCAGAA 正向引物 CTCCCCACAGCTCTGCAT 反向引物 CAGTCAATCCCITTGGTGCT 帶VIC熒光C型探針 ITGcGAAATACAA 帶FAM熒光G型探針 TTGtGAAATACAA 正向引物 GATAGCACCACTGCACTCCA 反向引物 TCATCTCTTCCCCACACACA 將反應孔和空白對照在PCR擴增儀上進行反應，先進行預熱:50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，然后再進行60個循環的95°C、30秒，60°C、1分鐘、反應結束后取出后再放入熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，得到一氧化氮合酶(NOS3) rsl799983, TNF-a家族成員Fas配體基因(FASLG) rs763110兩張圖； 步驟4: SNP基因型分析 將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號的3個圖和一個NTC空白對照進行比較，每個位點理論上存在三種不同的信號，純VIC熒光信號、VIC和FAM雜合熒光信號以及純FAM熒光信號，分別代表該位點三種不同的基因型； (I)、一氧化氮合酶(NOS3) rsl799983 在檢測結果圖中，坐標軸左下區域為空白對照、坐標軸左上區域為GG基因型、坐標軸右上區域為GT基因型、坐標軸右下區域為TT基因型，(2)、TNF-a 家族成員 Fas 配體基因(FASLG) rs763110 在檢測結果圖中，坐標軸左下區域為空白對照、坐標軸左上區域為CC基因型、坐標軸右上區域為CT基因型、坐標軸右下區域為TT基因型。
2 .權利要求書I中的所述的N0S3基因與FASLG基因的組合檢測模式。
【文檔編號】C12Q1/68GK103642932SQ201310722584
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月25日 優先權日:2013年12月25日
【發明者】毛丹丹, 王校 申請人:上海中優醫藥高科技有限公司