專利名稱：殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性影響的測定方法
技術領域：
本發明涉及殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性的測定方法。
背景技術：
自1996年轉基因Bt植物在美國首次商業化種植以來，轉基因作物在全球的種植面積持續快速增長。根據ISAAA公布的數據表明，2010年全球轉基因作物種植面積已達到了 I. 48億公頃(James，2010)，其中具有抗蟲特性的轉基因作物0. 586億公頃，占總種植面積的37. 5%。轉Bt抗蟲植物的種植能有效減少廣譜化學殺蟲劑的使用，降低了農藥對環境的污染，保護了人類健康。轉基因抗蟲植物的利用是作物害蟲防治技術的一次巨大綠色變革。然而，像其他害蟲防治措施一祥，其為人類帶來利益的同時，也可能會對環境造成潛在的生態風險。轉基因抗蟲作物對非靶標生物的潛在影響是有關轉基因作物環境風險評價中關注的ー個焦點。目前，在轉基因植物的非靶標生物影響方面，國際上已逐漸形成了一套被風險評估工作者廣泛采用的分層次評價程序(Romeis et al. ,2008 ;王圓圓等,2011)。在該評價程序中， 第一歩(層)需要鑒定轉基因作物表達的殺蟲蛋白對受試非靶標生物的潛在毒性，被稱之為Tier-I毒性測定試驗。簡單的說，就是發展合適的人工飼料或其它殺蟲蛋白載體把高劑量的、具有殺蟲活性的殺蟲蛋白傳遞給受試生物，設立合適的陰性和陽性對照，通過比較殺蟲蛋白處理和陰性和陽性對照處理間的受試生物生長發育及其它生理生化參數，評價殺蟲化合物對該生物的潛在毒性。這樣的毒性測定模型不但可以用于評價轉基因抗蟲作物對非靶標受試生物的潛在風險，還有可以用于篩選對受試昆蟲具有殺蟲活性的新基因(Li et al. ,2011)。灰飛風(Laodelphax striatellus Fall6n)屬半翅目飛風科,主要分布于從菲律賓至西伯利亞與歐洲的溫帯地區，在我國分布十分廣泛，尤其是在長江流域及華北地區。它不僅直接刺吸危害水稻、小麥、玉米、高粱等作物。更重要的是傳播水稻條紋葉枯病、黑條矮縮病及玉米粗縮病等病毒病害。在亞洲，長期化學防治已導致該蟲對有機氯、有機磷及氨基甲酸酯類等多種殺蟲劑產生了抗性。發展轉基因抗蟲作物可能是防治稻飛虱的有效措施。 然而，當前培育的轉基因抗蟲水稻都只對鱗翅目害蟲有較好抗性，至今還沒有發現對飛虱有高效抗性的殺蟲基因。

發明內容
為了高效篩選對該類害蟲有抗性效果的殺蟲基因，并評價當前已經培育成功的轉基因抗蟲水稻表達的外源殺蟲蛋白及不同殺蟲劑對灰飛虱的潛在影響，專利申請人通過試驗研究，其首先確立了對灰飛虱毒性測定體系有效的人工飼料，發展了把不同有機或無機殺蟲化合物加入人工飼料的技術和方法，篩選了適合可用于測定體系的陽性對照化合物 (蛋白酶抑制劑E-64或無機化合物神酸ニ氫鉀PA)，經試驗研究提出了適合的灰飛虱毒性影響評價指標，并利用E-64和PA作為模式化合物，通過劑量反應生測試驗驗證了所建立灰飛虱毒性測定方法的有效性和敏感性，最終建立了系統、敏感的評價殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性影響的測定方法。本發明提供的一套殺蟲化合物(純殺蟲蛋白或其它毒性化合物)對灰飛虱潛在毒性的測定方法，以期為新型殺蟲基因的篩選、轉基因抗蟲植物的環境安全評價及殺蟲劑毒性測定提供技術支撐。本發明提供的殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性的測定方法利用混入了需要檢測的殺蟲化合物的人工飼料供灰飛虱取食，通過選擇合適的灰飛虱生長發育指標評價所述殺蟲化合物對灰飛虱的潛在毒性，所述人工飼料為含有氨基酸、維生素、無機鹽和蔗糖的水溶液，以mg/100ml為濃度單位，所述氨基酸包括如下組分L_鹽酸精氨酸150-200，L-天冬酰胺酸200-250，L-谷氨酸220-280，L-谷氨酰胺180-230，L-組氨酸65-85，L-蛋氨酸65-85， L-亮氨酸210-270，L-賴氨酸鹽酸鹽180-210，L-苯丙氨酸180-220, L-絲胺酸350-450， L-結Jj氛酸 260-330。較佳地，以mg/100ml為濃度單位，所述氨基酸還包括如下組分L-丙氨酸 100-150，L-天冬氨酸 90-110，L-異亮氨酸 90-110，L-脯氨酸 90-110，L-蘇氨酸 100-150， L-色氨酸90-120。較佳地，以mg/100ml為濃度單位，所述氨基酸還包括如下組分甘氨酸25_35， L-半胱氨酸70-90，L-胱氨酸鹽酸鹽15-25，Y -氨基丁酸8_12，L-酪氨酸8_12。較佳地，所述維生素包括如下組分生物素O. 03-0. 07,泛酸鈣3-7，氯化膽鹼 40-60，葉酸O. 3-0. 7，肌醇45-55，煙酸12-18，鹽酸吡哆辛2-3，核黃素O. 3-0. 7，鹽酸硫胺素2-3，維生素C 80-120 ;所述無機鹽還包括如下組分=CaCl2 · 2H20 3-3. 3，CuCl2 · 2H20 O. 2-0. 35，FeCl3 · 6H20 2-2. 5，MnCl2 · 4H20 0. 5-1，氯化鋅 0. 3-0. 5，六水氯化鎂 180-220， 磷酸二氫鉀450-550 ;所述蔗糖的濃度為6000-12000。更佳地，所述人工飼料中含有的氨基酸、維生素、無機鹽和蔗糖的組分和濃度如下
權利要求
1.殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性的測定方法，其利用混入了需要檢測的殺蟲化合物的人工飼料供灰飛虱取食，通過灰飛虱生長發育指標評價所述殺蟲化合物對灰飛虱的潛在毒性，其特征在于，所述人工飼料為含有氨基酸、維生素、無機鹽和蔗糖的水溶液，以mg/100ml 為濃度單位，所述氨基酸包括如下組分L-鹽酸精氨酸150-200，L-天冬酰胺酸200-250， L-谷氨酸220-280, L-谷氨酰胺180-230, L-組氨酸65-85，L-蛋氨酸65-85，L-亮氨酸 210-270，L-賴氨酸鹽酸鹽180-210, L-苯丙氨酸180-220, L-絲胺酸350-450，L-纈氨酸 260-330。
2.根據權利要求I所述的殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性的測定方法，其特征在于， 以mg/100ml為濃度單位，所述氨基酸還包括如下組分L_丙氨酸100-150，L-天冬氨酸 90-110，L-異亮氨酸 90-110，L-脯氨酸 90-110，L-蘇氨酸 100-150，L-色氨酸 90-120。
3.根據權利要求2所述的殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性的測定方法，其特征在于， 以mg/100ml為濃度單位，所述氨基酸還包括如下組分甘氨酸25-35，L-半胱氨酸70-90， L-胱氨酸鹽酸鹽15-25，Y -氨基丁酸8-12，L-酪氨酸8_12。
4.根據權利要求I所述的殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性的測定方法，其特征在于， 以mg/100ml為濃度單位，所述維生素包括如下組分生物素O. 03-0. 07，泛酸鈣3_7，氯化膽鹼40-60，葉酸O. 3-0. 7，肌醇45-55，煙酸12-18，鹽酸吡哆辛2-3，核黃素O. 3-0. 7， 鹽酸硫胺素2-3，維生素C 80-120 ;所述無機鹽還包括如下組分=CaCl2 · 2H20 3-3.3， CuCl2 ·2Η200· 2-0. 35，FeCl3 ·6Η20 2-2. 5，MnCl2 · 4Η20 O. 5_1，氯化鋅 O. 3-0. 5，六水氯化鎂 180-220，磷酸二氫鉀450-550 ;所述蔗糖的濃度為6000-12000。
5.根據權利要求I所述的殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性的測定方法，其特征在于，所述人工飼料中含有的氨基酸、維生素、無機鹽和蔗糖的組分和濃度如下
6.根據權利要求5所述的殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性的測定方法，其特征在干，所述人工飼料中含有的氨基酸、維生素、無機鹽和蔗糖的組分和濃度如下i.氨基酸mg/100mlL-脯氨酸100鹽酸吡哆辛2. 5甘氨酸30L-賴氨酸鹽酸鹽200核黃素0. 5L-丙氨酸130L-苯丙氨酸200鹽酸硫胺素2. 5L-鹽酸精氨酸175L-絲胺酸400維生素C100. 0L-天冬酰胺酸230L-蘇氨酸1303.無機鹽mg/100mlL-天冬氨酸100L-色氨酸105CaCl2 2H203. IL-半胱氨酸80L-酪氨酸10CuCl2 2H200. 27L-胱氨酸鹽酸鹽20L-纈氨酸300FeCl3 6H202. 23Y-氨基丁酸102.維生素mg/100mlMnCl2 4H200. 8L-谷氨酸250生物素0. 05氯化鋅0. 4L-谷氨酰胺204泛酸鈣5. 0六水氯化鎂200L-組氨酸80氯化膽鹼50. 0磷酸ニ氫鉀500L-蛋氨酸70葉酸0. 5L-異亮氨酸100肌醇50. 04.mg/100mlレ亮氨酸240煙酸15. 0蔗糖9000
7.根據權利要求I所述的殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性的測定方法，其特征在于，所述灰飛虱生長發育指標選自灰飛虱若蟲的生存率、若蟲歷期和新羽化的成蟲體重的ー種或多種。
8.根據權利要求I所述的殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性的測定方法，其特征在于，該方法以含有機化合物蛋白酶抑制劑E-64或無機化合物砷酸ニ氫鉀的人工飼料作為生物測定陽性對照，以純飼料處理作為陰性對照。
9.根據權利要求8所述的殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性的測定方法，其特征在于，該方法包括以下步驟1)配制人工飼料母液；2)把需要檢測的可溶性化合物溶解于適量的蒸餾水或溶液中；3)把毒性化合物溶液混入人工飼料母液，用蒸餾水定容至需要的濃度；4) 同樣根據前三個步驟配制含一定濃度有機化合物蛋白酶抑制劑E-64或無機化合物砷酸二氫鉀的人工飼料作為生物測定陽性對照；5)純飼料處理作為陰性對照；將初孵灰飛虱若蟲單頭接入飼養容器中，每個處理設25個以上重復，飼料1-3天更換一次，觀察記錄灰飛虱生長發育情況，評價各處理對灰飛虱的潛在毒性。
全文摘要
本發明提供了殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性的測定方法，其首先確立了對灰飛虱毒性測定體系有效的人工飼料，發展了把不同有機或無機殺蟲化合物加入人工飼料的技術和方法，篩選了適合可用于測定體系的陽性對照化合物(蛋白酶抑制劑E-64或無機化合物砷酸二氫鉀PA)，經試驗研究提出了適合的灰飛虱毒性影響評價指標，并利用E-64和PA作為模式化合物，通過劑量反應生測試驗驗證了所建立灰飛虱毒性測定方法的有效性和敏感性，最終建立了系統、敏感的評價殺蟲化合物對灰飛虱潛在毒性影響的測定方法。本發明可以用于評價轉基因抗蟲作物表達的外源殺蟲蛋白對灰飛虱的潛在毒性、篩選對灰飛虱具有抗性的新型殺蟲蛋白基因、也可用于測定不同殺蟲劑對灰飛虱的潛在影響。
文檔編號G01N33/50GK102608307SQ20121006388
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月12日 優先權日2012年3月12日
發明者劉澤文, 彭于發, 李云河, 林克劍, 王增霞 申請人:中國農業科學院植物保護研究所