專利名稱：基于Au/Ag核/殼量子點的半胱氨酸和Cu²⁺熒光探針的制法的制作方法
技術領域：
本發明屬于生化分析檢測技術領域，具體涉及基于Au/Ag核/殼量子點的半胱氨酸和Cu2+熒光探針及其制法。
背景技術：
半胱氨酸是一種含有巰基的氨基酸，是構成蛋白質的二十種氨基酸之一。由于半胱氨酸分子結構中的巰基具有較高的親質子活性，且極易被氧化，使其具有較強的還原性。半胱氨酸還具有抗氧化性、解毒及清除自由基的能力，在多種細胞的生理過程中發揮著不可替代的作用。此外，半胱氨酸是細胞和組織生長的必備分子，半胱氨酸的缺乏可導致一系列綜合病癥，例如:頭發褪色、水腫、皮膚損傷、肝臟受損、幼兒發育不良等。因此，半胱氨酸的檢測顯得尤為重要。迄今為止，關于半胱氨酸的檢測方法有分光光度法、熒光光譜法、高效液相法、流動注射法、毛細管區帶電泳法及循環伏安法等。但這些方法普遍存在分析時間較長、分析過程繁瑣、成本較高、靈敏度較低和選擇性較差等問題，在一定程度上制約了其在實際樣品測試中的應用與推廣。目前，建立簡單、快速、成本低、靈敏度高和選擇性好的半胱氨酸檢測方法逐漸成為相關研究者關注的焦點。相比其它方法，熒光光譜法是一種基于光學信號而建立的檢測方法，半胱氨酸的熒光探測具有化學/光穩定性好、靈敏度高、選擇性好、響應快、對細胞毒害作用小，可進行快速、實時、原位檢測等諸多優點，受到很高的重視。近年來，科研工作者致力于半胱氨酸高效熒光探測方法的研究，并取得許多研究進展。例如，Hyo Sung Jung等制備了一系列具有熒光發射的香豆素分子，并用于發展分子調控型半胱氨酸選擇性突光探針(Molecular modulated cysteine-selectivefluorescent probe, Biomaterials, 2012, 33:8495-8502)。Li Shang 等發展了一種基于聚甲基丙烯酸穩定的納米銀突光量子點的半胱氨酸高選擇性探針(Sensitive detection ofcysteine based on fluorescent silver clusters， Biosensors and Bioelectronics,2009,24:1569-1573) 0另外，有關半胱氨酸的熒光探測也有中國專利報道。例如，于曉強等設計了一種基于咔唑吡啶醛類化合物的單、雙光子半胱氨酸熒光探針(公布號:CN 102127055A)。黃珊等公開了一種半胱氨酸的熒光納米CdS量子點探針(公布號:CN102796516A)。盡管采用以上實例中的方法可以獲得半胱氨酸的熒光探針，但依然存在某些關鍵的技術問題亟待解決，如探針的制備成本、敏感性、選擇性、生物相容性、可降解性、低毒性等。故此，發展一種可替代的、高效的熒光探測方法，對于半胱氨酸探針的實際應用具有十分重要的意義。截止目前，尚未見基于牛血清白蛋白穩定的生物相容性Au/Ag核/殼量子點的半胱氨酸熒光探針，且此探針可同時用于Cu2+的高效探測的相關中國專利報道
發明內容
本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種方法簡單，快速、成本低的基于Au/Ag核/殼量子點的半胱氨酸和Cu2+突光探針的制備方法。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現:一種基于Au/Ag核/殼量子點的半胱氨酸和Cu2+熒光探針的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:(I)溶解氯金酸和牛血清白蛋白BSA形成均質的水溶液，在一定的溫度和磁力攪拌下，在堿性環境下反應一定的時間，制得Au納米粒；(2)溶解硝酸銀和牛血清白蛋白BSA形成均質的水溶液，然后加入一定量的Au納米粒形成混合溶液體系，在一定的溫度和磁力攪拌下，在堿性環境下反應一定的時間，制得Au/Ag核/殼量子點；(3)將Au/Ag核/殼量子點配成量子點溶液，向此量子點溶液中加入半胱氨酸/Cu2+，測定含不同半胱氨酸/Cu2+摩爾濃度的量子點熒光強度，擬合該熒光強度與半胱氨酸/Cu2+摩爾濃度之間的關系，以構建基于此量子點的熒光探針。步驟(I)中所述的氯金酸摩爾濃度為I 10mM，BSA的用量為10 50mg/mL，反應溫度為20 40°C，反應時間為6 24h，所述的堿性環境是指采用NaOH調節堿性pH為7.5 9.0。步驟⑵中所述的硝酸銀摩爾濃度為I 5mM，BSA的用量為5 20mg/mL，反應溫度為20 40°C，反應時間為12 48h，采所述堿性環境是指用NaOH調節堿性pH為7.5 9.0, Au納米粒的用量為0.1 lmg/mLo步驟(3)中所述的量子點溶液的濃度為0.5mg/mL,半胱氨酸/Cu2+摩爾濃度為O 40/0 10 μ M，熒光強度與半胱氨酸和Cu2+摩爾濃度之間均呈線性關系。在待檢測的混合水樣和生物樣品中加入Au/Ag核/殼量子點，根據所述的線性關系探測混合水樣和生物樣品中半胱氨酸/Cu2+的熒光強度。與現有技術相比，本發明選用牛血清白蛋白為還原劑/穩定劑，氯金酸和硝酸銀為原料，在堿性水溶液中反應，制備出生物相容性的Au/Ag核/殼量子點，該量子點溶液的熒光強度與外加的半胱氨酸/Cu2+摩爾濃度均呈線性關系，因而可發展為半胱氨酸/Cu2+的熒光探針。與現有技術相比，本發明方法簡單，快速、成本低，制備產物具有生物相容性，可對生物樣品和復雜體系中的半胱氨酸/Cu2+進行準確、靈敏、簡便、快捷的探測，為生物檢測、化學分析等領域的研究提供了一種新的發展方向。


圖1為牛血清白蛋白BSA穩定的Au/Ag核/殼量子點作為半胱氨酸和Cu2+熒光探針的制備過程示意圖；圖2為Au/Ag核/殼量子點的透射電子顯微鏡照片(TEM)；圖3為Au/Ag核/殼量子點的紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜；圖4為Au/Ag核/殼量子點的熒光強度隨半胱氨酸摩爾濃度[cys]依次增加而逐漸淬滅的變化，插圖為熒光強度與[cys]之間的線性擬合；圖5為Au/Ag核/殼量子點的熒光強度隨Cu2+摩爾濃度[Cu2+]依次增加而逐漸淬滅的變化，插圖為熒光強度與[Cu2+]之間的線性擬合。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。實施例1基于Au/Ag核/殼量子點的半胱氨酸和Cu2+熒光探針的制備過程參見圖1，詳細的制備步驟如下:將氯金酸與BSA溶于20mL去離子水，調節氯金酸的摩爾濃度為2mM，BSA的用量為10mg/mL，在20°C和磁力攪拌下，在pH 7.5的磷酸緩沖液中反應6h，制備出BSA穩定的Au納米粒。將此Au納米粒加入溶有硝酸銀和BSA的20mL均質水溶液中，調節硝酸銀的摩爾濃度為lmM，BSA的用量為5mg/mL，Au納米粒的用量為0.2mg/mL，在20°C和磁力攪拌下,在pH7.5的磷酸緩沖液中反應12h,制備出BSA穩定的Au/Ag核/殼量子點。通過滲析，旋轉蒸發、離心分離、真空干燥，然后得到量子點干粉溶于去離子水，配置成0.5mg/mL的量子點溶液備用。向此溶液中加入不同摩爾濃度的半胱氨酸(O 40 μ M)/Cu2+(O 10 μ M)，測定混合體系的熒光強度，并擬合半胱氨酸/Cu2+摩爾濃度與對應的熒光強度之間的關系，以構建相應的熒光探針體系。采用透射電子顯微鏡觀察Au/Ag核/殼量子點的形貌與尺寸(參見圖2);采用紫外-可見光譜儀和熒光光譜儀測定Au/Ag核/殼量子點的吸收光譜和發射光譜；(參見圖
3);采用熒光光譜法測定Au/Ag核/殼量子點的熒光強度隨半胱氨酸/Cu2+摩爾濃度增加而逐漸淬滅的變化，及半胱氨酸/Cu2+摩爾濃度與對應的熒光強度之間的線性擬合(參見圖4和圖5)。采用上述熒光探針探測樣品中的半胱氨酸/Cu2+的濃度，可將Au/Ag核/殼量子點溶于混合水樣和生物樣品中，量子點濃度為0.5mg/mL，根據擬合的線性關系，計算出樣品中半胱氨酸/Cu2+的濃度。 實施例2詳細的制備步驟如下:將氯金酸與BSA溶于20mL去離子水，調節氯金酸的摩爾濃度為5mM，BSA的用量為20mg/mL，在25°C和磁力攪拌下，在pH 8.0的磷酸緩沖液中反應12h，制備出BSA穩定的Au納米粒。將此Au納米粒加入溶有硝酸銀和BSA的20mL均質水溶液中，調節硝酸銀的摩爾濃度為2mM，BSA的用量為10mg/mL，Au納米粒的用量為0.5mg/mL,在25°C和磁力攪拌下，在pH 8.0的磷酸緩沖液中反應24h，制備出BSA穩定的Au/Ag核/殼量子點。通過滲析，旋轉蒸發、離心分離、真空干燥，然后得到量子點干粉溶于去離子水，配置成0.5mg/mL的量子點溶液備用。向此溶液中加入不同摩爾濃度的半胱氨酸(O 40 μ Μ) /Cu2+(O 10 μ Μ)，測定混合體系的熒光強度，并擬合半胱氨酸/Cu2+摩爾濃度與對應的突光強度之間的關系，以構建相應的突光探針體系。Au/Ag核/殼量子點的性能表征方法同實施例1。實施例3詳細的制備步驟如下:將氯金酸與BSA溶于20mL去離子水，調節氯金酸的摩爾濃度為8mM，BSA的用量為30mg/mL，在37°C和磁力攪拌下，在pH 8.5的磷酸緩沖液中反應18h，制備出BSA穩定的Au納米粒。將此Au納米粒加入溶有硝酸銀和BSA的20mL均質水溶液中，調節硝酸銀的摩爾濃度為3mM，BSA的用量為15mg/mL，Au納米粒的用量為0.8mg/mL,在37°C和磁力攪拌下，在pH 8.5的磷酸緩沖液中反應36h，制備出BSA穩定的Au/Ag核/殼量子點。通過滲析，旋轉蒸發、離心分離、真空干燥，然后得到量子點干粉溶于去離子水，配置成0.5mg/mL的量子點溶液備用。向此溶液中加入不同摩爾濃度的半胱氨酸(O 40 μ Μ) /Cu2+(O 10 μ Μ)，測定混合體系的熒光強度，并擬合半胱氨酸/Cu2+摩爾濃度與對應的突光強度之間的關系，以構建相應的突光探針體系。Au/Ag核/殼量子點的性能表征方法同實施例1。實施例4詳細的制備步驟如下:將 氯金酸與BSA溶于20mL去離子水，調節氯金酸的摩爾濃度為lOmM，BSA的用量為40mg/mL，在40°C和磁力攪拌下，在pH9.0的磷酸緩沖液中反應24h，制備出BSA穩定的Au納米粒。將此Au納米粒加入溶有硝酸銀和BSA的20mL均質水溶液中，調節硝酸銀的摩爾濃度為4mM，BSA的用量為20mg/mL，Au納米粒的用量為1.0mg/mL,在40°C和磁力攪拌下，在pH 9.0的磷酸緩沖液中反應48h，制備出BSA穩定的Au/Ag核/殼量子點。通過滲析，旋轉蒸發、離心分離、真空干燥，然后得到量子點干粉溶于去離子水，配置成0.5mg/mL的量子點溶液備用。向此溶液中加入不同摩爾濃度的半胱氨酸(O 40 μ Μ) /Cu2+(O 10 μ Μ)，測定混合體系的熒光強度，并擬合半胱氨酸/Cu2+摩爾濃度與對應的突光強度之間的關系，以構建相應的突光探針體系。Au/Ag核/殼量子點的性能表征方法同實施例1。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種基于Au/Ag核/殼量子點的半胱氨酸和Cu2+突光探針的制備方法,其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)溶解氯金酸和牛血清白蛋白BSA形成均質的水溶液，在一定的溫度和磁力攪拌下，在堿性環境下反應一定的時間，制得Au納米粒； (2)溶解硝酸銀和牛血清白蛋白BSA形成均質的水溶液，然后加入一定量的Au納米粒形成混合溶液體系，在一定的溫度和磁力攪拌下，在堿性環境下反應一定的時間，制得Au/Ag核/殼量子點； (3)將Au/Ag核/殼量子點配成量子點溶液，向此量子點溶液中加入半胱氨酸/Cu2+，測定含不同半胱氨酸/Cu2+摩爾濃度的量子點熒光強度，擬合該熒光強度與半胱氨酸/Cu2+摩爾濃度之間的關系，以構建基于此量子點的熒光探針。
2.根據權利要求1所述的一種基于Au/Ag核/殼量子點的半胱氨酸和Cu2+熒光探針的制法，其特征在于，步驟⑴中所述的氯金酸摩爾濃度為I 10mM，BSA的用量為10 50mg/mL,反應溫度為20 40°C，反應時間為6 24h，所述的堿性環境是指采用NaOH調節堿性pH為7.5 9.0。
3.根據權利要求1所述的一種基于Au/Ag核/殼量子點的半胱氨酸和Cu2+熒光探針的制法，其特征在于，步驟⑵中所述的硝酸銀摩爾濃度為I 5mM，BSA的用量為5 20mg/mL,反應溫度為20 40°C，反應時間為12 48h，采所述堿性環境是指用NaOH調節堿性pH為7.5 9.0，Au納米粒的用量為0.1 lmg/mL。
4.根據權利要求1所述的一種基于Au/Ag核/殼量子點的半胱氨酸和Cu2+熒光探針的制法，其特征在于，步驟(3)中所述的量子點溶液的濃度為0.5mg/mL，半胱氨酸/Cu2+摩爾濃度為O 40/0 10 μ M，熒光強度與半胱氨酸和Cu2+摩爾濃度之間均呈線性關系。
5.根據權利要求4 所述的一種基于Au/Ag核/殼量子點的半胱氨酸和Cu2+突光探針的制法，其特征在于，在待檢測的混合水樣和生物樣品中加入Au/Ag核/殼量子點，根據所述的線性關系探測混合水樣和生物樣品中半胱氨酸/Cu2+的熒光強度。
全文摘要
本發明涉及一種基于Au/Ag核/殼量子點的半胱氨酸和Cu2+熒光探針的制備方法，該方法包括以下步驟(1)選用牛血清白蛋白BSA為還原劑/穩定劑，在堿性水溶液中與氯金酸反應，制備出Au納米粒；2)將此納米粒與BSA和硝酸銀混合，在堿性水溶液中反應，制備出Au/Ag核/殼量子點；3)該Au/Ag核/殼量子點的熒光強度與外加的半胱氨酸/Cu2+的摩爾濃度呈線性關系，可發展為一種新型的半胱氨酸/Cu2+熒光探針。與現有技術相比，本發明方法簡單、制備產物具有生物相容性，可發展為雙功能熒光探針用于混合水樣和生物樣品的檢測，且檢測過程快捷、靈敏度高、選擇性好、檢測限低，對于其它生物相容性熒光探針的設計與應用具有一定的參考價值。
文檔編號G01N21/64GK103217406SQ20131009161
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月21日 優先權日2013年3月21日
發明者萬錒俊, 桂日軍, 李慧麗, 金輝 申請人:上海交通大學