生化分離檢測一體芯片及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種生化分離檢測一體芯片，該芯片包括襯底、分離層固定相以及表面增強拉曼信號檢測層，所述信號檢測層通過第一黏合層連接到所述分離層固定相上，其中，所述分離層固定相包括由多個納米單元構成的納米陣列薄膜層；所述納米陣列薄膜層的孔隙率為50%～70%；所述納米單元的材料為SiO2或Al2O3。本發明提供的檢測芯片可以實現對待測混合物樣品進行快速分離和高靈敏度檢測一體化，在食品、環境和臨床醫學等領域中具有廣泛的應用前景。
【專利說明】生化分離檢測一體芯片及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生化分析檢測【技術領域】，特別涉及一種集超薄薄層色譜分離和表面增 強拉曼檢測于一體的生化分離檢測一體芯片及其制備方法。

【背景技術】
[0002] 快速、高靈敏度和高特異性的生化檢測手段在食品、環境和臨床醫學領域有重要 作用，是建立有效的食品安全質量控制體系的重要保證；為醫學臨床診斷和疾病/流行病 預防控制提供依據；為環境污染的監控提供量化的佐證。然而，食品、環境和臨床醫學中的 生化樣品通常為復雜混合物，通常需要進行分離和純化W消除樣品基底對測定的干擾。尤 其對于痕量的環境樣品和醫學臨床樣品等，還需要恰當方法對樣品進行富集W彌補檢驗方 法靈敏度的不足。現有技術方法如高效液相色譜-質譜聯用技術、英光免疫分析和酶聯免 疫分析巧LISA)、聚合酶鏈反應（PCR)等通常步驟繁兀，并且需要依賴于昂貴的實驗室設備 和特殊試劑，不利于進行快速檢測。
[0003] 表面增強拉曼（Surface-EnhancedRamanScattering, S邸S)檢測方法具有極商的 靈敏度，可W用于單分子水平的檢測，其主要原理是在納米尺度巧?lOOnm)的金屬表面 受入射激光激發產生的局域電磁場增強效應，其表面增強效應與金屬種類、金屬納米結構 的形狀、粒徑大小等直接相關。SERS檢測方法中信號強度與英光信號強度在同一數量級，譜 峰信號尖銳，可W提供英光信號所不具備的分子結構特征指紋信息，既可W用于直接檢測， 也可W進行標記間接檢測，是進行生化檢測的強有力的工具。
[0004] 運用SERS檢測方法對食品、環境和臨床醫學等領域中由復雜基體組成的生化樣 品進行檢測時，主要有兩種檢測模式；其一是基于免疫夾也結構的間接檢測模式，檢測芯片 由第一(捕捉）抗體+SERS信號標記+第二(特異）抗體組成.該方法需要分別生長/固定 第一(捕捉）抗體的芯片，W及由第二(特異）抗體修飾的SERS標記單元，制備過程繁兀，成 本高昂；第二種檢測模式為直接檢測模式，將待測樣品直接吸附于SERS活性芯片表面，運 用化學計量學的多變量分析方法對SERS譜圖進行定性鑒別與定量分析，該方法簡單易行， 但容易受到大量的復雜樣品基體干擾，從而降低了檢測靈敏度。
[0005] 銀的斜納米棒陣列是一種高靈敏度和高效的表面增強拉曼芯片結構。該結構的表 面增強拉曼芯片使用直接檢測模式，在用于臨床樣品巧日病毒）檢測時，由于復雜樣品基體 的干擾，大大降低了該芯片的靈敏度。
[0006] 另一方面，雖然表面增強拉曼技術可W與傳統的薄層色譜（TLC)分離技術聯用，即 首先使用薄層色譜對混合物樣品進行分離，然后在分離的樣品斑點原位點滴加Au或Ag溶 膠納米顆粒，形成檢測"熱點"化ot spot),進行的表面增強拉曼檢測，但由于Au/Ag溶膠顆 粒形成的"熱點"不穩定，導致該方法可靠性較低。


【發明內容】

[0007] 針對上述提到的現有技術的不足，本發明提出了一種生化分離檢測一體芯片及其 制備方法，該檢測芯片可w實現對待測混合物樣品進行快速分離和高靈敏度檢測一體化， 在食品、環境和臨床醫學等領域中具有廣泛的應用前景。
[0008] 為了實現上述目的，本發明采用了如下的技術方案：
[0009] -種生化分離檢測一體芯片，包括襯底、分離層固定相W及表面增強拉曼信號檢 測層，所述信號檢測層通過第一黏合層連接到所述分離層固定相上。
[0010] 優選地，所述分離層固定相包括由多個納米單元構成的納米陣列薄膜層；所述納 米陣列薄膜層的孔隙率為50%?70% ;所述納米單元的材料為Si化或Al2〇3。
[0011] 優選地，所述納米單元為斜納米棒；其中，W垂直于襯底的方向為基準，斜納米棒 傾斜的角度為20?50。。
[0012] 優選地，所述分離層固定相包括多個納米陣列薄膜層，其中相鄰兩層納米陣列薄 膜層中的斜納米棒呈相反方向傾斜。
[0013] 優選地，所述納米單元為螺旋狀納米棒，并且所述螺旋狀納米棒的軸線垂直于襯 底。
[0014] 優選地，所述信號檢測層為金屬斜納米棒陣列薄膜層，所述金屬為Au或Ag，所述 信號檢測層的厚度為800?1000皿。
[0015] 優選地，所述信號檢測層500還包覆有一表面化學修飾材料層。
[0016] 優選地，所述分離層固定相的厚度為3?Sum。
[0017] 優選地，所述第一黏合層的材料為Ti或者化。
[0018] 優選地，所述襯底與分離層固定相之間還設置有第二黏合層，所述第二黏合層的 材料為Ti或者Si〇2。
[0019] 本發明的另一方面是提供了如上所述的生化分離檢測一體芯片的制備方法，包括 步驟，首先采用斜/掠角沉積工藝在襯底上生長分離層固定相，然后在分離層固定相上生 長第一黏合層，最后采用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層上生長具有斜納米棒陣列的信號 檢測層，獲得所述檢測芯片；其中，所述分離層固定相包括由多個納米單元構成的納米陣列 薄膜層；所述納米陣列薄膜層的孔隙率為50%?70% ;所述納米單元的材料為Si〇2或Al2〇3。
[0020] 優選地，所述芯片的分離層固定相包括多個納米陣列薄膜層，所述襯底與所述分 離層固定相之間還包括第二黏合層，所述制備方法具體包括步驟：
[0021] S101、在襯底上生長第二黏合層；
[0022] S102、采用斜/掠角沉積工藝在第二黏合層上生長具有斜納米棒陣列的第一薄膜 層；
[0023] S103、旋轉樣品臺180°，生長具有斜納米棒陣列的第二薄膜層；其中，第二薄膜 層的納米棒的傾斜角度與所述第一薄膜層的相反；
[0024] S104、重復步驟S103,獲得具有多個納米陣列薄膜層的分離層固定相；
[00巧]S105、采用電子束沉積在所述分離層固定相上生長第一黏合層；
[0026] S106、采用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層上生長具有斜納米棒陣列的信號檢測 層；
[0027] 其中，所述斜/掠角沉積工藝中沉積角度的范圍是80?86°，沉積速率范圍是 0? 2 ?0? 4nm/s。
[002引優選地，所述斜納米棒的直徑為60?510nm，斜納米棒么間的間隙為40?240nm ; 每一層納米陣列薄膜層的厚度為500?1500nm。
[0029] 在另外一個優選的實施方案中，所述芯片的分離層固定相為螺旋狀納米棒陣列的 薄膜層，所述襯底與所述分離層固定相之間還包括第二黏合層，所述制備方法具體包括步 驟：
[0030] S201、在襯底上生長第二黏合層；
[0031] S202、采用斜/掠角沉積工藝，并且在沉積過程中控制樣品臺旋轉，在所述第二黏 合層生長具有螺旋狀納米棒陣列，獲得具有多個螺旋狀納米棒陣列薄膜層的分離層固定 相；
[0032] S203、采用電子束沉積工藝在所述分離層固定相上生長第一黏合層；
[0033] S204、采用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層上生長具有斜納米棒陣列的信號檢測 層；
[0034] 其中，所述斜/掠角沉積工藝中沉積角度的范圍是80?85°，沉積速率范圍是 0. 2 ?0. 4nm/s。
[00巧]優選地，所述沉積速率與樣品臺旋轉速率的比值范圍是100:1?200: Inm/rev。
[0036] 優選地，所述螺旋狀納米棒的直徑為60?160nm，螺旋狀納米棒之間的間隙為 40?160nm ;螺旋狀納米棒陣列薄膜層的厚度為3000?5000nm。
[0037] 優選地，所述分離層固定相的厚度為3?5 y m。
[0038] 優選地，如上所述的制備方法還包括步驟，對所述芯片進行表面化學修飾與改性。 [00測有益效果：
[0040] 第一、本發明提供了一種采樣量小0. 1 y L)，并且將快速分離與高靈敏度檢測 有機結合的快速生化分析檢測芯片；該芯片使用斜/掠角沉積技術，在一個工藝過程內依 次生長制備超薄薄層色譜扣Itra化in-Laye;K：虹omatogra地y，ITTLC)分離層固定相和表面 增強拉曼（Surface-EnhancedRamanScattering, S邸S)信號檢測層；
[0041] 第二、用于生長UTLC分離層固定相的材料為Si化或Al2〇3,通過控制沉積角度(入 射氣流角度與襯底法線之夾角）的變化，控制精度《r，可W方便的調節控制不同材料的 UTLC分離層固定相的孔隙率和厚度，從而形成特定的UTLC分離層固定相孔隙結構；
[004引第H、與傳統的在薄層色譜CTLC)色譜樣品斑點原位點上滴加Au/Ag納米溶膠顆 粒進行SERS信號采集的方法相比，本發明將分離層固定相和信號檢測層集合到同一芯片 上，可W克服使用Au/Ag納米溶膠顆粒不易形成穩定的檢測"熱點"（hot spots)、可靠性 (均一度和重現性)差等缺陷，并且使用斜/掠角沉積技術生長的SERS信號檢測層的靈敏度 和可靠性都得到大大提高；
[0043] 第四、本發明方法所生長制備生長的分離檢測納米結構層可W進一步進行表面化 學修飾與改性，為進一步擴展提高本發明芯片的性能提供了有利條件。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044] 圖1為本發明實施例中提供的生化分離檢測一體芯片的結構示意圖。
[0045] 圖2為本發明另一實施例中提供的表生化分離檢測一體芯片的結構示意圖。
[0046] 圖3為如圖1所示的生化分離檢測一體芯片的制備方法流程圖。
[0047] 圖4為如圖2所示的生化分離檢測一體芯片的制備方法流程圖。
[004引圖5為本發明實施例中應用生化分離檢測一體芯片進行檢測的圖示；其中，圖5a 為將點樣后的芯片在玻璃染色缸中使待測樣品展開的圖示；圖化為應用拉曼光譜儀對展 開后的待測樣品進行掃描的圖示。

【具體實施方式】
[0049] 如前所述，鑒于現有技術存在的不足，本發明提出了一種集快速分離與高靈敏度 檢測為一體的生化分離檢測一體芯片，所述芯片包括襯底W及襯底上的超薄薄層色譜 (OTLC)分離層固定相，W及表面增強拉曼（S邸S)信號檢測層，其中，所述信號檢測層通過 第一黏合層連接到所述分離層固定相上。該檢測芯片可W實現對待測樣品進行分離和檢測 一體化，在食品、環境和臨床醫學等領域的快速檢測中具有廣泛的應用前景。
[0050] 下面將結合附圖用實施例對本發明做進一步說明。
[00川 實施例1
[0052] 如圖1所示，本實施例提供的生化分離檢測一體芯片包括襯底100 W及依次設置 于襯底100上的分離層固定相300和信號檢測層500,所述分離層固定相300通過第二黏合 層200連接到所述襯底100上，所述信號檢測層500通過第一黏合層400連接到所述分離 層固定相300上。
[0053] 在本實施例中，所述襯底100的材料為娃；所述第二黏合層200的材料為Ti，第二 黏合層200的厚度為20nm ;所述分離層固定相300包括4個納米陣列薄膜層（30U302);所 述第一黏合層400的材料為Ti，第一黏合層400的厚度為lOnm ;所述信號檢測層500為具 有金屬斜納米棒陣列的薄膜層，其厚度為800nm，所述金屬為Ag，其中，W垂直于襯底的方 向為基準，金屬斜納米棒傾斜的角度為71 + 4°。
[0054] 其中，所述納米陣列薄膜層（30U302)由多個納米單元300a構成，納米陣列薄 膜層（30U302)的孔隙率為50%，其厚度為lOOOnm ;所述納米單元300a為斜納米棒，W垂 直于襯底的方向為基準，斜納米棒傾斜的角度為28 + 4°，所述納米單元300a的材料為 Al2〇3 ;并且，在所述分離層固定相300中，相鄰的兩層納米陣列薄膜層中的斜納米棒呈相反 方向傾斜，例如，相鄰的兩層納米陣列薄膜層301和302中，W垂直于襯底的方向為基準， 薄膜層301中斜納米棒的傾斜角度為+ (28 + 4° )，則薄膜層302中斜納米棒的傾斜角度 為-(28 + 4。）。
[0055] 在本實施例中，所述A12化斜納米棒的平均直徑為410±95nm，相鄰A12化斜納米棒 間的平均間隙為160 ± 80nm。
[0056] 下面介紹如上所述的生化分離檢測一體芯片的制備方法，參閱圖3,該方法具體包 括步驟：
[0057] S101、采用電子束沉積工藝，在娃襯底100上沉積一層20nm厚的Ti薄膜層作為第 二黏合層200 ;
[005引 S102、固定樣品臺，采用A12化為沉積物原料，應用斜/掠角電子束沉積工藝在第二 黏合層200上生長具有斜納米棒300a陣列的第一薄膜層301 ;所述第一薄膜層301的厚度 為1000皿，所述AI2O3斜納米棒300a的平均直徑為410 ±95皿，相鄰AI2O3斜納米棒300a之 間的平均間隙為160±80nm 垂直于襯底的方向為基準，所述A12化斜納米棒300a傾斜的 角度為28 + 4° ;其中，電子束沉積工藝的沉積角度為86°，沉積速率為0.4nm/s，所述沉積 角度是指待沉積物的入射方向與襯底法線方向的夾角。
[0059] S103、旋轉樣品臺180°，參照步驟S102中的電子束沉積工藝生長具有斜納米棒 陣列的第二薄膜層302 ;其中，第二薄膜層302的納米棒的傾斜角度與所述第一薄膜層301 的相反；
[0060] S104、重復步驟S103,獲得具有4個納米陣列薄膜層（30U302)的分離層固定相 300 ;其中相鄰兩層納米陣列薄膜層中的斜納米棒呈相反方向傾斜；
[0061] S105、采用電子束沉積工藝，在所述分離層固定相300上沉積一層lOnm厚的Ti薄 膜層作為第一黏合層400 ;電子束沉積工藝的沉積角度為80°，沉積速率為0. 2nm/s，所述 沉積角度是指待沉積物的入射方向與襯底法線方向的夾角；
[0062] S106、采用Ag為沉積物原料，應用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層400上生長具 有斜納米棒陣列的信號檢測層500,所述信號檢測層500的厚度為800nm ;其中，電子束沉積 工藝的沉積角度為84°，沉積速率為0. 32nm/s，所述沉積角度是指待沉積物的入射方向與 襯底法線方向的夾角；W垂直于襯底的方向為基準，信號檢測層500中斜納米棒的傾斜角 度為（71 + 4° );獲得所述生化分離檢測一體芯片。
[0063] 在本實施例中，使用如上所述的芯片進行葉綠體色素的分離檢測。本實例首先 在芯片上對植物的葉綠體色素，包括葉綠素和葉黃素等進行超薄薄層色譜分離，葉綠體色 素的各個組分由于在色譜展開溶劑中具有不同的溶解性能，通過色譜展開溶劑帶動，從原 混合物樣點在芯片固定相上分離并依次展開，然后在分離展開后的各個組分斑點位置使用 特定波長的激光激發，在信號層產生表面增強拉曼信號，使用拉曼光譜儀采集相應組分的 表面增強拉曼譜圖，根據各個組分物質的特征譜峰進行物質的鑒別檢測。檢測的具體步驟 為：
[0064] (1)采用新鮮洗凈的綠葉片2-3片，用剪刀剪成約6mmX3mm的碎片放入瑪瑤研鉢 中，加入約2-3血己醇，使用研鉢棒不斷壓擠碎葉片，壓棒出葉綠素。使用快速定性濾紙，將 壓棒出的汁液過濾進入具塞玻璃試管，蓋瓶塞振蕩搖勻待用；
[0065] (2)配制色譜展開溶劑；將石油離與丙麗按體積比為3:1混合得到色譜展開溶劑， 然后在玻璃染色缸中加入3-4ml色譜展開溶劑，加蓋放置，使玻璃染色缸內色譜展開溶劑 蒸汽達到飽和；
[0066] (3)使用內徑為1mm的毛細點樣管吸取上述步驟（1)中的葉綠素己醇溶液 <0. 1 y以在本實施例中制備得到的生化分離檢測一體芯片一端距離邊緣7-8mm處進行點 樣，在空氣中靜置干燥；
[0067] (4)如圖5a所示，將上述步驟（3)點樣后的芯片插入上述步驟（2)的玻璃染色缸 中，保持樣品點0接近但不接觸展開溶劑的彎月面A-A，加蓋并靜置20min，使溶劑在毛細管 作用下向上移動，對葉綠體色素樣品進行展開，其中B-B為樣品展開的前沿面；得到葉綠體 色素中的組分展開次序從展開溶劑一端向上依次為葉黃素和葉綠素；
[0068] (5)從上述步驟（4)玻璃染色缸中取出芯片，對展開的樣品點作標記，使用干燥氮 氣小也吹干殘余溶劑；
[0069] (6)將上述步驟（5)的芯片置于拉曼光譜儀600下，使用633皿激發波長，功率 《5mW，聚焦在標記點，沿溶劑展開方向，在包括點樣點原點和展開色譜點的區間內，分別 掃描采集分離后的樣品點表面增強拉曼光譜，在400-1800cnTi內進行光譜掃描，曝光時長 10s，掃描2次，如圖化所示。
[0070] 由上述步驟（6)在分離斑點得到分離后葉綠素各個組分的特征拉曼譜圖。例如， 葉綠素在IHlcnfi和1166cnTi處有一對特征雙峰；葉黃素在971cnTi有區別于葉綠素的特 征譜峰。
[00川 實施例2
[0072] 如圖2所示，本實施例提供的生化分離檢測一體芯片包括襯底100 W及依次設置 于襯底100上的分離層固定相300和信號檢測層500,所述分離層固定相300通過第二黏合 層200連接到所述襯底100上，所述信號檢測層500通過第一黏合層400連接到所述分離 層固定相300上。
[0073] 在本實施例中，所述襯底100的材料為玻璃載玻片；所述第二黏合層200的材料為 Si〇2,第二黏合層200的厚度為50nm ;所述分離層固定相300包括螺旋狀納米棒陣列薄膜 層；所述第一黏合層400的材料為化，第一黏合層400的厚度為lOnm ;所述信號檢測層500 為具有金屬斜納米棒陣列的薄膜層，其厚度為1000皿，所述金屬為Au，其中，W垂直于襯底 的方向為基準，金屬斜納米棒傾斜的角度為70 + 4°。
[0074] 其中，所述分離層固定相300是由多個螺旋狀納米棒30化構成的納米陣列薄膜 層，其厚度為3000nm，所述螺旋狀納米棒30化的材料為Si〇2,所述Si〇2螺旋狀納米棒30化 的平均直徑為75± 15nm，并且所述螺旋狀納米棒的軸線垂直于襯底，其中，相鄰Si化螺旋狀 納米棒30化間的平均間隙為100 +25nm。
[00巧]下面介紹如上所述的檢測芯片的制備方法，參閱圖4,該方法具體包括步驟：
[0076] S201、采用電子束沉積工藝，在玻璃載玻片襯底100上沉積一層50皿厚的Si化薄 膜層作為第二黏合層200 ;
[0077] S202、采用斜/掠角沉積工藝，沉積角度為85。，沉積速率為0.4nm/s，同時控 制樣品臺旋轉，樣品臺旋轉的速率為〇.〇〇2rev/s，此時沉積速率與襯底旋轉速率之比為 200: Inm/rev，在第二黏合層上生長具有螺旋狀納米棒陣列的分離層固定相300,其厚度為 3000nm ;所述螺旋狀納米棒30化的材料為Si化，所述Si化螺旋狀納米棒30化的平均直徑為 75 +15nm，并且所述螺旋狀納米棒的軸線垂直于襯底，其中，相鄰Si化螺旋狀納米棒30化 間的平均間隙為l〇〇±25nm ;
[0078] S203、采用電子束沉積工藝，在所述分離層固定相300上沉積一層lOnm厚的化薄 膜層作為第一黏合層400 ;電子束沉積工藝的沉積角度為80°，沉積速率為0. 2nm/s，所述 沉積角度是指待沉積物的入射方向與襯底法線方向的夾角；
[0079] S204、采用Au為沉積物原料，應用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層400上生長具 有斜納米棒陣列的信號檢測層500,所述信號檢測層500的厚度為lOOOnm ;其中，電子束沉 積工藝的沉積角度為80°，沉積速率為0. 3nm/s，所述沉積角度是指待沉積物的入射方向 與襯底法線方向的夾角；W垂直于襯底的方向為基準，信號檢測層500中斜納米棒的傾斜 角度為（70 + 4° );獲得所述生化分離檢測一體芯片。
[0080] 在本實施例中，使用如上所述的芯片進行混合物體系分離檢測，本實例首先在芯 片上對混合物體系，包括亞甲基藍、結晶紫和羅丹明6G等進行超薄薄層色譜分離，混合物 體系的各個組分由于在色譜展開溶劑中具有不同的溶解性能，通過色譜展開溶劑帶動，從 原混合物樣點在芯片固定相上分離并依次展開，然后在分離展開后的各個組分斑點位置使 用特定波長的激光激發，在信號層產生表面增強拉曼信號，使用拉曼光譜儀采集相應組分 的表面增強拉曼譜圖，根據各個組分物質的特征譜峰進行物質的鑒別檢測。檢測方法的具 體步驟為：
[00則 （1)配制亞甲基藍（10-5M)、結晶紫（10-4M)和羅丹明6G (10-5M)的己醇混合物溶 液；
[008引（2)配制色譜展開溶劑，將甲苯和己醇按體積比為2:1混合得到色譜展開溶劑，然 后在玻璃染色缸中加入3-4ml色譜展開溶劑，加蓋放置，使玻璃染色缸內的展開溶劑蒸汽 達到飽和；
[0083] (3)使用移液槍吸取上述步驟（1)中的混合物溶液0. 1 y L在本實施例制備得到 的生化分離檢測一體芯片一端距離邊緣7-8mm處進行點樣，在空氣中靜置干燥；
[0084] (4)如圖5a所示，將上述步驟（3)點樣后的芯片插入上述步驟（2)的玻璃染色缸 中，保持樣品點0接近但不接觸展開溶劑的彎月面A-A，加蓋并靜置lOmin，使溶劑在毛細管 作用下向上移動，對混合物樣品進行展開，其中B-B為樣品展開的前沿面；得到混合物中的 組分展開次序從展開溶劑一端向上依次為亞甲基藍、結晶紫和羅丹明6G。
[0085] (5)從上述步驟（4)的玻璃染色缸中取出芯片，對展開的樣品點作標記，使用干燥 氮氣小也吹干殘余溶劑；
[0086] (6)如圖化所示，將上述步驟（5)的芯片置于拉曼光譜儀600下，使用633皿激發 波長，功率《5mW，聚焦在標記點，沿溶劑展開方向，在包括混合物點樣原點和展開色譜點的 區間內，分別掃描采集分離后的樣品點表面增強拉曼光譜，在400-1800cnTi內進行光譜掃 描，曝光時長10s,掃描2次。
[0087] 由上述步驟（6)在分離斑點得到分離后混合物各個組分的特征拉曼譜圖。例如，亞 甲基藍的C-S鍵在480cm-i處有特征強峰；結晶紫在1619cm-i、1588cm-i、1374cm-i、1175cm-i、 918cm-i、808cm-i、763cm-i 和 733cm-i 處有特征組峰，羅丹明 6G 在 1513cm-i、1364cm-i、 1313cm-i、775cm-i 和 614cm-i 有特征組峰。
[008引 實施例3
[0089] 本實施例與實施例1的不同的是，所述分離層固定相300的材料為Si化；此外，為 進一步改善樣品在分離層固定相300和信號檢測層500之間分布的均勻性，本實例中進一 步采用正娃酸己醋水解法對信號檢測層500的金屬斜納米棒進行多孔Si化薄層包覆。
[0090] 參閱圖1，本實施例提供的檢測芯片包括襯底100 W及依次設置于襯底100上的分 離層固定相300和信號檢測層500,所述分離層固定相300通過第二黏合層200連接到所述 襯底100上，所述信號檢測層500通過第一黏合層400連接到所述分離層固定相300上，其 中，所述信號檢測層500上還包覆有一多孔Si化薄層包覆層（圖中未標示出）。
[0091] 在本實施例中，所述襯底100的材料為玻璃；所述第二黏合層200的材料為Si〇2， 第二黏合層200的厚度為50nm ;所述分離層固定相300包括4個納米陣列薄膜層（301、 302);所述第一黏合層400的材料為Ti，第一黏合層400的厚度為10皿；所述信號檢測層 500為具有金屬斜納米棒陣列的薄膜層，其厚度為900nm，所述金屬為Ag，其中，W垂直于襯 底的方向為基準，金屬斜納米棒傾斜的角度為70 + 4°。
[0092] 其中，所述納米陣列薄膜層（30U302)由多個納米單元300a構成，納米陣列薄 膜層（30U302)的孔隙率為70%，其厚度為lOOOnm ;所述納米單元300a為斜納米棒，W垂 直于襯底的方向為基準，斜納米棒傾斜的角度為46 + 4°，所述納米單元300a的材料為 Si化；并且，在所述分離層固定相300中，相鄰的兩層納米陣列薄膜層中的斜納米棒呈相反 方向傾斜，例如，相鄰的兩層納米陣列薄膜層301和302中，W垂直于襯底的方向為基準， 薄膜層301中斜納米棒的傾斜角度為+ (46 + 4° )，則薄膜層302中斜納米棒的傾斜角度 為-(46 + 4。）。
[009引在本實施例中，所述Si化斜納米棒的平均直徑為65 +8nm，相鄰Si化斜納米棒間 的平均間隙為l00±30nm。
[0094] 下面介紹如上所述的檢測芯片的生長方法，參閱圖2,該方法具體包括步驟：
[0095] S101、采用電子束沉積工藝，在玻璃襯底100上沉積一層50nm厚的Si化薄膜層作 為第二黏合層200 ;
[0096] S102、固定樣品臺，采用Si化為沉積物原料，應用斜/掠角電子束沉積工藝在第二 黏合層200上生長具有斜納米棒300a陣列的第一薄膜層301 ;所述第一薄膜層301的厚度 為lOOOnm,所述Si化斜納米棒300a的平均直徑為65 +8nm,相鄰Si化斜納米棒300a之間 的平均間隙為l〇〇±30nm 垂直于襯底的方向為基準，所述Si化斜納米棒300a傾斜的角 度為46 + 4° ;其中，電子束沉積工藝的沉積角度為85°，沉積速率為0.4nm/s，所述沉積角 度是指待沉積物的入射方向與襯底法線方向的夾角；
[0097] S103、旋轉樣品臺180°，參照步驟S102中的電子束沉積工藝生長具有斜納米棒 陣列的第二薄膜層302 ;其中，第二薄膜層302的納米棒的傾斜角度與所述第一薄膜層301 的相反；
[0098] S104、重復步驟S103,獲得具有5個納米陣列薄膜層（30U302)的分離層固定相 300 ;其中相鄰兩層納米陣列薄膜層中的斜納米棒呈相反方向傾斜；
[0099] S105、采用電子束沉積工藝，在所述分離層固定相300上沉積一層lOnm厚的Ti薄 膜層作為第一黏合層400 ;電子束沉積工藝的沉積角度為80°，沉積速率為0. 2nm/s，所述 沉積角度是指待沉積物的入射方向與襯底法線方向的夾角；
[0100] S106、采用Ag為沉積物原料，應用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層400上生長具 有斜納米棒陣列的信號檢測層500,所述信號檢測層500的厚度為900nm ;其中，電子束沉積 工藝的沉積角度為82°，沉積速率為0. 4nm/s，所述沉積角度是指待沉積物的入射方向與 襯底法線方向的夾角；W垂直于襯底的方向為基準，信號檢測層500中斜納米棒的傾斜角 度為70 + 4°。
[0101] S107、對上述步驟S106制備得到的芯片進行表面化學修飾與改性（附圖中未標示 出）；具體地，在本實施例中，使用正娃酸四己醋（TE0S)水解法對所述芯片進行多孔Si化薄 層包覆，包括W下步驟為：
[0102] (i)首先將上述步驟S106制備得到的芯片在0. 4M巧樣酸中靜置30分鐘取出，W 便清洗所述芯片并對所述芯片的納米結構表面進行酸化，然后使用超純水沖洗該芯片，并 使用干燥氮氣流吹干；
[0103] (ii)配制己醇、水和正娃酸己醋(體積比為50:8:1)的混合液，使用磁力攬拌使溶 液均勻混合，其中，己醇的加入有利于形成均相的混合溶液，W利于后續水解反應的發生；
[0104] (iii)將經上述步驟（i)處理的芯片浸入上述步驟（ii)制備的混合液中20分鐘， 保持對上述步驟（ii)中的磁力攬拌，并逐滴加入與正娃酸四己醋等體積的氨水（28%)作為 催化劑，水解30分鐘；
[0105] 其中，水解方程式為：
[0106]

【權利要求】
1. 一種生化分離檢測一體芯片，其特征在于，包括襯底、分離層固定相以及表面增強 拉曼信號檢測層，所述信號檢測層通過第一黏合層連接到所述分離層固定相上。
2. 根據權利要求1所述的生化分離檢測一體芯片，其特征在于，所述分離層固定相包 括由多個納米單元構成的納米陣列薄膜層；所述納米陣列薄膜層的孔隙率為50%?70% ;所 述納米單元的材料為Si02或A1203。
3. 根據權利要求2所述的生化分離檢測一體芯片，其特征在于，所述納米單元為斜納 米棒；其中，以垂直于襯底的方向為基準，斜納米棒傾斜的角度為20?50°。
4. 根據權利要求3所述的生化分離檢測一體芯片，其特征在于，所述分離層固定相包 括多個納米陣列薄膜層，其中相鄰兩層納米陣列薄膜層中的斜納米棒呈相反方向傾斜。
5. 根據權利要求2所述的生化分離檢測一體芯片，其特征在于，所述納米單元為螺旋 狀納米棒，并且所述螺旋狀納米棒的軸線垂直于襯底。
6. 根據權利要求1所述的生化分離檢測一體芯片，其特征在于，所述信號檢測層為金 屬斜納米棒陣列薄膜層，所述金屬為Au或Ag，所述信號檢測層的厚度為800?lOOOnm。
7. 根據權利要求1-6任一所述的生化分離檢測一體芯片，其特征在于，所述信號檢測 層500還包覆有一表面化學修飾材料層。
8. 根據權利要求1-6任一所述的生化分離檢測一體芯片，其特征在于，所述分離層固 定相的厚度為3?5 y m。
9. 一種如權利要求1所述的生化分離檢測一體芯片的制備方法，其特征在于，首先采 用斜/掠角沉積工藝在襯底上生長分離層固定相，然后在分離層固定相上生長第一黏合 層，最后采用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層上生長具有斜納米棒陣列的信號檢測層，獲 得所述檢測芯片；其中，所述分離層固定相包括由多個納米單元構成的納米陣列薄膜層； 所述納米陣列薄膜層的孔隙率為50%?70% ;所述納米單元的材料為Si02或A1203。
10. 根據權利要求9所述的生化分離檢測一體芯片的制備方法，其特征在于，所述芯片 的分離層固定相包括多個納米陣列薄膜層，所述襯底與所述分離層固定相之間還包括第二 黏合層，所述制備方法具體包括步驟： 5101、 在襯底上生長第二黏合層； 5102、 采用斜/掠角沉積工藝在第二黏合層上生長具有斜納米棒陣列的第一薄膜層； 5103、 旋轉樣品臺180°，生長具有斜納米棒陣列的第二薄膜層；其中，第二薄膜層的 納米棒的傾斜角度與所述第一薄膜層的相反； 5104、 重復步驟S103,獲得具有多個納米陣列薄膜層的分離層固定相； 5105、 采用電子束沉積在所述分離層固定相上生長第一黏合層； 5106、 采用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層上生長具有斜納米棒陣列的信號檢測層； 其中，所述斜/掠角沉積工藝中沉積角度的范圍是80?86°，沉積速率范圍是0. 2? 0? 4nm/s〇
11. 根據權利要求10所述的生化分離檢測一體芯片的制備方法，其特征在于，所述斜 納米棒的直徑為60?510nm，斜納米棒之間的間隙為40?240nm ;每一層納米陣列薄膜層 的厚度為500?1500nm。
12. 根據權利要求9所述的生化分離檢測一體芯片的制備方法，其特征在于，所述芯片 的分離層固定相為螺旋狀納米棒陣列的薄膜層，所述襯底與所述分離層固定相之間還包 括第二黏合層，所述制備方法具體包括步驟： 5201、 在襯底上生長第二黏合層； 5202、 采用斜/掠角沉積工藝，并且在沉積過程中控制樣品臺旋轉，在所述第二黏合層 生長具有螺旋狀納米棒陣列，獲得具有多個螺旋狀納米棒陣列薄膜層的分離層固定相； 5203、 采用電子束沉積工藝在所述分離層固定相上生長第一黏合層； 5204、 采用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層上生長具有斜納米棒陣列的信號檢測層； 其中，所述斜/掠角沉積工藝中沉積角度的范圍是80?85°，沉積速率范圍是0. 2? 0? 4nm/s〇
13. 根據權利要求12所述的生化分離檢測一體芯片的制備方法，其特征在于，所述沉 積速率與樣品臺旋轉速率的比值范圍是100:1?200: lnm/rev。
14. 根據權利要求12所述的生化分離檢測一體芯片的制備方法，其特征在于，所述螺 旋狀納米棒的直徑為60?160nm，螺旋狀納米棒之間的間隙為40?160nm ;螺旋狀納米棒 陣列薄膜層的厚度為3000?5000nm。
15. 根據權利要求10或12所述的生化分離檢測一體芯片的制備方法，其特征在于，所 述分離層固定相的厚度為3?5 y m。
16. 根據權利要求10或12所述的生化分離檢測一體芯片的制備方法，其特征在于，該 方法還包括步驟，對所述芯片進行表面化學修飾與改性。
【文檔編號】G01N30/92GK104422751SQ201310368510
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月22日 優先權日:2013年8月22日
【發明者】朱煜, 趙奕平, 趙一兵, 張耀輝 申請人:中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所, 趙奕平