一種便于形態學觀察的粘孢子蟲染色封存方法
【專利摘要】本發明公開了一種便于形態學觀察的粘孢子蟲染色封存方法，包括制作粘孢子蟲懸浮液、制作蛋白甘油粘性玻片、烘片、染色、脫色洗片以及脫水封片步驟。本發明的方法整個流程制作一般不超過2小時，如果使用染色架和染缸進行，還可以實現批量制作。染色效果好，在40倍物鏡下，粘孢子蟲孢質被染成深藍色、極囊被染成淺紫紅色、殼片不著色，這樣極囊、孢質和殼片界線分明，孢子的形態結構一目了然；100倍油鏡下，極囊極絲著色較深，極囊其它部分著色較淺，極絲清晰可見，制好的玻片可以重復觀察使用，且能常年保存。
【專利說明】一種便于形態學觀察的粘孢子蟲染色封存方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物學領域，具體而言，涉及一種便于形態學觀察的粘孢子蟲染色封存方法。
【背景技術】
[0002]粘孢子蟲(Myxosporea)是一類種類繁多的寄生蟲。目前，發現的粘孢子蟲種類已超過2200種，并且每年都有新種被發現。除少數種類寄生在兩棲動物、水禽及哺乳動物外，絕大多數寄生于魚類不同組織器官上，嚴重影響寄主的健康生長。粘孢子蟲作為最為常見的魚類等水生動物寄生蟲之一，經常在科研或教學中被研究觀察。
[0003]目前最常用的粘孢子蟲的觀察方法:事先把患粘孢子蟲的病魚保存在福爾馬林溶液中，需要觀察時，從溶液中取出粘孢子蟲的孢囊，制作水浸片，然后在顯微鏡下觀察。這種方法明顯有如下缺點:其一、粘孢子蟲基本透明，在顯微鏡下折光率低，不容易看清楚其形態結構(圖2、圖4、圖6);其二、水浸片中的粘孢子蟲位置不固定，會隨液體而流動，不利于顯微鏡下蟲體結構觀察和拍照；其三、每次觀察都要制作水浸片，耗時耗力，浪費粘孢子蟲樣品和玻片；其四、用于長期保存粘孢子蟲的福爾馬林溶液有效成分為甲醛，有刺激氣味，有毒，制作水浸片過程影響使用者身體健康。

【發明內容】

[0004]為了彌補上述缺陷，本發明自創出一種簡單易行，便于攜帶，觀察效果好，一次做好可常年保存并且可反復使用的粘孢子蟲玻片標本的制作方法，以期給寄生蟲實驗科研和教學帶來便利。為了實現本發明的目的，擬采用如下技術方案:
[0005]本發明涉及一種便于形態學觀察的粘孢子蟲染色封存方法，其特征在于包括如下步驟:
[0006](I)粘孢子蟲懸浮液制作:從保存于福爾馬林中的患粘孢子蟲病病魚上取出孢囊放入適量蒸餾水中，弄破孢囊使得粘孢子蟲分散懸浮于蒸餾水中，粘孢子蟲懸浮液中的孢子蟲盡可能有較高濃度，一般以0.01?IXio6Ail為最宜；
[0007](2)甘油蛋白粘性玻片制作:用大頭針取芝麻大小的甘油蛋白均勻涂在載玻片上，用滴管滴2?3滴粘孢子蟲懸浮液于甘油蛋白粘性玻片上，搖晃玻片使粘孢子蟲懸浮液均勻地分布于玻片上；
[0008](3)烘片:把帶有粘孢子蟲的玻片在38?42°C干燥箱里烘干，以玻片上液體剛蒸發了為止；或者可以自然條件下晾干；
[0009](4)染色:用滴管吸取瑞氏-姬姆薩A液(常規血細胞染色用瑞氏染液和姬姆薩1:1混合液)0.5?0.8ml覆蓋于帶有粘孢子蟲的烘干玻片上，染色5?8min ;再將瑞氏-姬姆薩B液(pH=6.4?6.8的磷酸鹽緩沖液)滴加于A液上，滴加量是A液的3倍，以嘴或洗耳球吹出微風使得液面產生漣漪狀而充分混合，染色8?IOmin ;用蒸餾水緩慢細流沖掉玻片上多余的染料，直到流下的蒸餾水變為無色為止；[0010](5)脫色洗片:把染好的玻片浸入甲醇溶液中I?3min進行脫色洗片；
[0011](6 )脫水及封片:脫色的洗片依次經過70%、80%、95%、100%梯度酒精分別脫水2min，然后分別經二甲苯純酒精1:1混合液和二甲苯2min后用中性樹膠封片。
[0012]在本發明的一個優選實施方式中，所述的甘油蛋白為甘油(丙三醇)與雞蛋蛋清1:1體積比的混勻液。
[0013]本發明中，粘孢子蟲(Myxosporea)是一類種類繁多的寄生蟲。目前，發現的粘孢子蟲種類已超過2200種，并且每年都有新種被發現。除少數種類寄生在兩棲動物、水禽及哺乳動物外，絕大多數寄生于魚類不同組織器官上。為了在取材上更具代表性，本發明的技術方案選用標本是單極囊的武漢單極蟲(Thelohanellus wuhanensis)和雙極囊的咽碘泡蟲(Myxobolus pharynae),兩種蟲體均屬于碘泡蟲屬(Myxobolus Biitschli, 1882),碘泡蟲屬是粘孢子蟲種類最多的一個屬，目前已經超過820種，超過粘孢子蟲全部種類的1/3。所以，雖然本發明優選了單極囊的武漢單極蟲和雙極囊的咽碘泡蟲，但本發明的方法具有普遍意義，其它粘孢子蟲的染色封存也可以采用該方法進行。
[0014]本發明所述的方法具有如下優點:
[0015]( I)用玻片標本成品觀察粘孢子蟲形態效果好:在40倍物鏡下，粘孢子蟲孢質被染成深藍色、極囊被染成淺紫紅色、殼片不著色，這樣極囊、孢質和殼片界線分明，整個孢子的形態結構顯得一目了然(圖3、7);在100倍油鏡下，極囊極絲著色較深，極囊其它部分著色較淺，極絲的結構顯得清晰可見(圖5)。這樣就克服了傳統粘孢子蟲顯微鏡下觀察，折光率低，蟲體形態結構不清晰的弊端。
[0016](2)標本制作最后采用梯度酒精脫水后中性樹膠封片，做好的玻片標本可常年保存樣品，多次重復使用，節約玻片等耗材，而且攜帶方便，可作為實驗教學上粘孢子蟲形態結構觀察玻片標本實驗材料。
[0017](3)該制作過程，設備和工藝要求相對簡單，整個操作流程一般不超過2小時，而且可以批量制作。
[0018](4)粘孢子蟲是水生動物最常見的寄生蟲之一，制作好的玻片標本可作為水生動物病害寄生蟲學教學用的觀察材料，在開設水產養殖等相關專業的高等院校中有一定市場，所以制作好的粘孢子蟲標本可成為商品，具有較好的經濟價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1:本發明所述粘孢子蟲玻片染色封存方法的流程示意圖；
[0020]圖2:40倍物鏡下水浸片咽碘泡蟲，bar=15 μ m ；
[0021]咽碘泡蟲折光率低，極囊、孢質和殼片結構不清晰，界限不分明
[0022]圖3:40倍物鏡下染色封存的咽碘泡蟲，bar=15 μ m ；
[0023]蟲體孢質被染成深藍色、極囊被染成淺紫紅色、殼片不著色，極囊、孢質和殼片界線分明
[0024]圖4:100倍油鏡下水浸片咽碘泡蟲，bar=10 μ m ；
[0025]透明度高，折光率低，不易觀察極絲
[0026]圖5:100倍油鏡下染色封存咽碘泡蟲，bar=10 μ m ；
[0027]極囊極絲著色較深，極囊其它部分著色較淺，極絲的結構清晰可見[0028]圖6:40倍物鏡下水浸片武漢單極蟲，bar=15 μ m ；
[0029]蟲體折光率低，極囊、孢質和殼片結構不清晰，界限不分明
[0030]圖7:40倍物鏡下染色封存武漢單極蟲，bar=15 μ m。
[0031]蟲體孢質被染成深藍色、極囊被染成淺紫紅色、殼片不著色，極囊、孢質和殼片界線分明，可見極絲
【具體實施方式】:
[0032]下面結合圖1所示的流程圖對本發明的技術方案做進一步說明。
[0033]實施例1:
[0034]粘孢子蟲懸浮液制作:從保存于福爾馬林中的患粘孢子蟲病病魚上取出孢囊放入適量蒸餾水中，弄破孢囊使得粘孢子蟲分散懸浮于蒸餾水中，防止孢子成團，影響制片效果和觀察，粘孢子蟲懸浮液中的孢子蟲盡可能達到較高的濃度，一般以0.01?IXio6Ail為最宜。
[0035]甘油蛋白粘性玻片制作:用大頭針取芝麻大小的甘油蛋白均勻涂在載玻片上。甘油蛋白有兩個作用:其一、讓粘孢子蟲粘附在玻片上，使其在染色和封片過程中不易脫落；其二、能夠降低粘孢子蟲懸浮液在玻片上的表面張力，使粘孢子蟲能均勻地分布在玻片表面。甘油蛋白為甘油(丙三醇)與雞蛋蛋清1:1體積比的混勻液。因甘油蛋白易著色，不能涂的過多，避免干擾粘孢子蟲的觀察。
[0036]用滴管滴2?3滴粘孢子蟲懸浮液于甘油蛋白粘性玻片上，搖晃玻片使粘孢子蟲懸浮液均勻地分布于玻片上。
[0037]烘片:把帶有粘孢子蟲的玻片在38?42°C干燥箱里烘干，約需5?8min，以玻片上液體剛蒸發完為至。烘片不能時間過長，否則粘孢子蟲容易萎縮變形。如果沒有干燥箱，也可以自然條件下晾干。
[0038]染色:用滴管吸取瑞氏-姬姆薩A液0.5?0.8ml覆蓋于帶有粘孢子蟲的烘干玻片上，染色5?8min ;再將瑞氏-姬姆薩B液滴加于A液上，滴加量是A液的3倍，以嘴或洗耳球吹出微風使得液面產生漣漪狀而充分混合，染色8?IOmin ;用蒸餾水緩慢細流沖掉玻片上多余的染料，直到流下的蒸餾水變為無色為止。瑞氏-姬姆薩A液為常規血細胞染色用瑞氏染液和姬姆薩1:1混合液，瑞氏-姬姆薩B液為磷酸鹽緩沖液，PH=6.4?6.8。
[0039]脫色洗片:把染好的玻片浸入甲醇溶液中I?3min。該過程有兩個作用:其一、洗去玻片上多余的瑞氏-姬姆薩的顏色，這樣顯微鏡下粘孢子的觀察就不會受到背景色的影響；其二、達到更好的染色效果，粘孢子蟲孢質呈深藍色，極囊淺紫紅色，殼片無色透明，整個粘孢子蟲形態結構更清晰。
[0040]瑞氏-姬姆薩染料能溶解于甲醇，所以選擇甲醇為脫色洗片劑。玻片在甲醇溶液中需要的脫色洗片時間會因玻片上粘孢子蟲的種類不同而稍有差異，該步驟對染色的效果起到了決定性作用，所以需在脫色洗片60S、90S、120S等時分別在顯微鏡下觀察脫色洗片效果，從而確定最佳的脫色洗片時間。
[0041]脫水及封片:染好的玻片，分別經過70%、80%、95%、100%梯度酒精脫水2min，然后分別經二甲苯和純酒精1:1混合液和二甲苯2min后用中性樹膠封片。
[0042]粘孢子蟲玻片制作方法操作過程簡單，整個流程制作一般不超過2小時，如果使用染色架和染缸進行，還可以實現批量制作。染色效果好，在40倍物鏡下，粘孢子蟲孢質被染成深藍色、極囊被染成淺紫紅色、殼片不著色，這樣極囊、孢質和殼片界線分明，孢子的形態結構一目了然；在100倍油鏡下，極囊極絲著色較深，極囊其它部分著色較淺，極絲清晰可見，制作好的玻片可以重復觀察使用，且能常年保存。
[0043]以上所述，僅為本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何不經過創造性勞動想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應該以權利要求書所限定的保護范圍為準。
【權利要求】
1.一種便于形態學觀察的粘孢子蟲染色封存方法，其特征在于包括如下步驟: (1)粘孢子蟲懸浮液制作:從保存于福爾馬林中的患粘孢子蟲病病魚上取出孢囊放入適量蒸餾水中，弄破孢囊使得粘孢子蟲分散懸浮于蒸餾水中，粘孢子蟲懸浮液中的孢子蟲盡可能有較高濃度，一般以0.01?IXio6Ail為最宜； (2)甘油蛋白粘性玻片制作:用大頭針取芝麻大小的甘油蛋白均勻涂在載玻片上，用滴管滴2?3滴粘孢子蟲懸浮液于甘油蛋白粘性玻片上，搖晃玻片使粘孢子蟲懸浮液均勻地分布于玻片上； (3)烘片:把帶有粘孢子蟲的玻片在38?42°C干燥箱里烘干，以玻片上液體剛蒸發完為止；或者可以自然條件下晾干； (4)染色:用滴管吸取瑞氏-姬姆薩A液(常規血細胞染色用瑞氏染液和姬姆薩1:1混合液)0.5?0.8ml覆蓋于帶有粘孢子蟲的烘干玻片上,染色5?8min ;再將瑞氏-姬姆薩B液(pH=6.4?6.8的磷酸鹽緩沖液)滴加于A液上，滴加量是A液的3倍，以嘴或洗耳球吹出微風使得液面產生漣漪狀而充分混合，染色8?IOmin ;用蒸餾水緩慢細流沖掉玻片上多余的染料，直到流下的蒸餾水變為無色為止； (5)脫色洗片:把染好的玻片浸入甲醇溶液中脫色洗片I?3min； (6)脫水及封片:脫色的洗片依次經過70%、80%、95%、100%梯度酒精分別脫水2min，然后分別經二甲苯純酒精1:1混合液和二甲苯2min后用中性樹膠封片。
2.根據權利要求1所述的方法，所述的甘油蛋白為甘油(丙三醇)與雞蛋蛋清1:1體積比的混勻液。
3.根據權利要求1或2所述的方法，所述的粘孢子蟲優選為單極囊的武漢單極蟲(Thelohanellus wuhanensis)和雙極囊的咽碘泡蟲(Myxobolus pharynae)。
【文檔編號】G01N1/30GK103808550SQ201410055606
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月19日 優先權日:2014年2月19日
【發明者】陸宏達, 毛毛, 竹攸汀, 李振偉, 盧俊, 余偉楠, 柴下 申請人:上海海洋大學