以糖蜜為原料提取生物素的方法及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種以糖蜜為原料提取生物素的方法，以糖蜜原料，加入乙醇，40KHz超聲處理，得糖蜜渣塊后，再加入乙醇，20KHz超聲處理，并配合N,N-二甲基甲酰胺提取，最終得到含生物素的樣品液。本發明還提供了一種生物素的薄層層析掃描檢測方法，(1)取待檢測樣品液，點在硅膠板上，加入展開劑，在展開缸內展開，然后將薄層板拿出放在通風柜中晾干；(2)展完后晾干的展板，用染色液噴霧染色，得到與背景對比明顯的標準品的斑點和樣品的斑點；(3)利用薄層掃描儀以530nm吸收波長進行薄層層析掃描，計算出樣品液中生物素的質量濃度。具有簡單、快速、準確、可靠、穩定等優點。
【專利說明】以糖蜜為原料提取生物素的方法及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種以糖蜜為原料提取生物素的方法，以及生物素的檢測方法。
【背景技術】
[0002]生物素是生命活動中必需的維生素之一，是機體內許多酶的輔助因子，參加機體的羧化、脫羧和脫氫反應，參與糖類、脂肪、蛋白質三大營養物質的代謝。生物素已廣泛應用于食品、化工、醫藥、畜牧、生物發酵等領域。在谷氨酸發酵生產中，生物素用量的控制直接影響著生產菌的生長、增殖、代謝和細胞壁、細胞膜的滲透性以及谷氨酸產酸率的高低，由于大多數谷氨酸菌都是生物素缺陷型的，所以生物素的含量對生產起著至關重要的作用，因此開展對生物素檢測的研究具有重要的意義。
[0003]糖蜜是一種粘稠、黑褐色、呈半流動態的物質，是制糖工業上不能再用來煮制糖品的廢料，但糖蜜中生物素的含量豐富，可作為良好的谷氨酸發酵的原料和添加劑，是目前谷氨酸生產中生物素的主要來源。但由于其中生物素的含量與糖蜜的來源、生產批次等密切相關，因此，為穩定生產、提高產酸率必須密切關注糖蜜的組成變化，準確測定其中的生物素含量，以實現谷氨酸發酵中對生物素用量的控制。
[0004]現有技術文獻報道的生物素的檢測方法有微生物法、熒光法、分光光度法、酶聯免疫法、氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層掃描法等等。目前，對糖蜜中生物素的檢測，微生物法和高效液相色譜法最為常用，但存在以下缺陷:微生物法由于大多數菌株都不是專一性的，因此會帶來較大的檢測誤差，并且整個操作過程費時、費力。高效液相色譜法投資大、溶劑用量大、成本較高，又由于糖蜜粘稠、色深、含有雜質較多，故樣品處理即生物素的提取純化過程困難，且高效液相色譜法對樣品的純度要求又較高，對成分復雜、色素含量高、雜質干擾大的糖蜜樣品，不宜用該法檢測。

【發明內容】

[0005]針對上述現有技術，本發明提供了一種以糖蜜為原料提取生物素的方法，本發明還提供了一種生物素的薄層層析掃描檢測方法。
[0006]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0007]以糖蜜為原料提取生物素的方法，步驟如下:
[0008](I)取糖蜜10?15g,加入100?150ml的80?95% (體積百分數)乙醇溶液于燒杯中，在40KHz，功率為300?500W，溫度60?70°C條件下超聲處理20?30分鐘，此過程中糖蜜由液體變為塊狀；超聲處理后，取出塊狀糖蜜，剩余乙醇溶液降溫至5°C以下，過濾得殘渣；將塊狀糖蜜與殘渣合并，用100?150ml與超聲處理同溫度、同濃度的乙醇溶液沖洗過濾，得糖蜜渣塊；
[0009](2)將上述糖蜜渣塊加入到100?150ml的95?100% (體積百分數)的乙醇溶液(當為100%時，為無水乙醇)中，在20KHz，300?500W，溫度為55?65°C，超聲探頭深入液面下3cm，間隔5秒超聲3分鐘設置下連續超聲20?30分鐘，此過程中，糖蜜塊已成黃土色粉狀；超聲處理后，趁熱過濾，得濾液和濾渣，用45?55ml的55?65°C的95?100%(體積百分數)乙醇溶液洗濾渣，得洗液和濾渣，合并濾液和洗液得乙醇濾液，濾渣加入5?8ml的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，攪拌提取20分鐘，過濾得DMF濾液；
[0010](3)將乙醇濾液和DMF濾液合并，得生物素溶液(含有生物素的溶液)，旋轉蒸發至2?3ml，作為下述檢測的樣品液。
[0011]一種生物素的薄層層析掃描檢測方法，步驟如下:
[0012](I)取待檢測樣品液(即上述方法制備得到的生物素溶液)4μ1，點在硅膠板(優選IOcmXlOcm的涂有娃膠GF254高效薄層板)上，加入展開劑，在展開缸(IOcmX 12cmX 15cm)內展開,展開劑的飽和時間為60分鐘,展開距離為6cm,展開時間為15分鐘，然后將薄層板拿出放在通風柜中晾干；同時，采用外標一點法點4μ I不同濃度的生物素標準品溶液，同時展開；
[0013]所述展開劑為二氯甲烷-氯仿-甲醇-冰乙酸混合液，其中，二氯甲烷、氯仿、甲醇、冰乙酸四者的體積比為I?3:1?3:1?2:0.04?0.06，優選3:3:2:0.06 ；
[0014]所述生物素標準品溶液包括濃度分別為0.05 μ g/μ 1,0.2 μ g/μ 1,0.25 μ g/μ I,
0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I的一系列標準品溶液；
[0015]所述生物素標準品溶液的配制方法為:精密稱取生物素標準品(購自Sigma公司)1.29mg,加入N，N-二甲基甲酰胺1.29ml,配制成濃度為lmg/ml的標準溶液；精密吸取50，200，250，300，400μ llmg/ml 的標準溶液，配制成濃度分別 0.05 μ g/μ 1，0.2 μ g/μ 1，
0.25 μ g/ μ I, 0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I 的一系列標準品溶液；
[0016](2)將2，4-二甲氨基肉桂醛、硫酸和無水乙醇混合，配成染色液，其中2，4-二甲氨基肉桂醛終濃度為0.1?0.2% (質量體積分數，單位g/ml)，硫酸終濃度為I?2% (質量體積分數，單位g/ml);展完后晾干的展板，用染色液噴霧染色，得到與背景對比明顯的標準品的斑點和樣品的斑點(桔紅色)；
[0017](3)利用Camag3型薄層掃描儀以530nm吸收波長進行薄層層析掃描，掃描速度為20mm/s,分辨率為50 μ m/step,得Rf = 0.69 ;照射燈為鎢燈，檢測計算得到生物素標準品溶液質量和峰面積積分值的關系的回歸方程(通過薄層色譜儀管理軟件winCATSl.4.1計算出，為常規手段)，然后根據樣品液的峰面積積分值計算出樣品液中生物素的質量濃度。
[0018]本發明的以糖蜜為原料提取生物素的方法，操作簡單、可靠，本發明的生物素的檢測方法，具有簡單、快速、準確、可靠、穩定等優點。
【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0020]實施例1以糖蜜為原料提取生物素
[0021]取糖蜜10g，加入80%的乙醇(V/V)溶液IOOml攪拌均勻，放在40KHz，功率為300W，溫度為60°C條件下超聲30分鐘。糖蜜逐漸由液體變成塊狀，將糖蜜塊取出，乙醇溶液速冷至5°C以下后將乙醇溶液倒出得剩余殘渣。
[0022]將糖蜜塊和殘渣合并，用已準備好的60°C的同濃度的乙醇溶液沖洗，冷至5°C以下倒掉乙醇溶液，得糖蜜渣塊。
[0023]向糖蜜渣塊中加入95%乙醇IOOml，在20KHz，300W，溫度為55°C，超聲探頭深入液面下3cm。間隔5秒，超聲3分鐘設置下連續超聲提取30分鐘。糖蜜由塊狀已成土黃色粉狀，趁熱過濾，得濾液和濾渣，550C，95 %乙醇沖洗濾渣，得洗液，合并濾液和洗液，共得乙醇濾液150ml。
[0024]濾渣加入二甲基甲酰胺(DMF) 5ml，攪拌提取20分鐘。過濾得DMF濾液。
[0025]將DMF濾液和乙醇濾液合并，經旋轉蒸發至液體為2ml，作為樣品液。
[0026]精密稱取生物素標準品(Sigma公司)1.29mg,加入N，N-二甲基甲酰胺1.29ml,配制成濃度為lmg/ml的標準溶液。精密吸取50，200, 250，300, 400 μ llmg/ml的標準溶液，配制成濃度分別 0.05 μ g/ μ 1，0.2 μ g/ μ I, 0.25 μ g/ μ I, 0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I 的一系列標準品溶液，分別取實施例1所得的樣品液4 μ I和標準液4 μ I點在涂有硅膠GF254高效薄層板(IOcmXlOcm)上，以二氯甲燒(V):氯仿(V):甲醇(V):冰乙酸(V) =3:3:2:0.06的比例配制8.06ml展開劑,在展開缸(IOcmX 12cmX 15cm)內層析,展開劑的飽和時間為60分鐘，展開距離為6cm，展開時間為15分鐘，然后將薄層板拿出放在通風柜中晾干。將2，4- 二甲氨基肉桂醛、硫酸和無水乙醇混合，配成染色液，其中2，4- 二甲氨基肉桂醛濃度為0.1%，硫酸濃度為1%，晾干后的薄層板用染色液噴霧染色，得到與背景對比明顯桔紅色的標準品斑點和樣品斑點。
[0027]利用Camag3型薄層掃描儀以530nm吸收波長進行薄層層析掃描，掃描速度為20mm/s,數據分辨率為50 μ m/step,得Rf = 0.69。照射燈為鎢燈進行檢測計算，以生物素標準品的質量(ng)為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)，由薄層色譜儀管理軟件winCATSl.4.1直接得到標準品與峰面積積分值關系的回歸方程Y = 73.4476+3.7771X，r =
0.99962，RSD = 1.98%。結果表明，樣品液在0.2?1.6 μ g/斑點線性良好，經檢測計算糖蜜中生物素含量為26.5 μ g/g。
[0028]實施例2以糖蜜為原料提取生物素
[0029]取糖蜜15g，加入95%的乙醇溶液(V/V) 150ml，攪拌均勻，在40KHz，功率為500W，溫度為70°C條件下超聲20分鐘。糖蜜逐漸由液體變成塊狀，將糖蜜塊取出，剩余乙醇溶液速冷至5°C以，后將乙醇溶液倒出得少量剩余殘渣。
[0030]將糖蜜塊和殘渣合并，用已準備好的70°C的同濃度的乙醇溶液沖洗，冷至5°C以下時倒掉乙醇溶液，得糖蜜渣塊。
[0031]向糖蜜渣塊中加入無水乙醇150ml，在20KHz，500W，溫度為65°C，超聲探頭深入液面下3cm。間隔5秒超聲3分鐘設置下連續超聲提取20分鐘。糖蜜塊成粉狀，趁熱過濾，得濾液和濾渣，65°C無水乙醇沖洗濾渣，得洗液，合并濾液和洗液，共得乙醇濾液200ml。
[0032]濾渣加入N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)8ml，攪拌提取20分鐘。過濾得DMF濾液。
[0033]將DMF濾液和乙醇濾液合并，經旋轉蒸發至液體為3ml，作為樣品液。
[0034]檢測方法同實施例1，糖蜜中生物素含量為26.4 μ g/g。
[0035]實施例3以糖蜜為原料提取生物素
[0036]取糖蜜12g，加入85%乙醇溶液(V/V) 120ml，攪拌均勻，放在40KHz，功率為400W，溫度為65°C下超聲25分鐘。超聲過程中糖蜜逐漸由液體變成塊狀，取出糖蜜塊，剩余乙醇溶液速冷至5°C以，后將乙醇溶液倒出得少量剩余殘渣。將糖蜜塊和殘渣合并，用已準備好的65°C的同濃度的乙醇溶液沖洗。冷至5°C以下時倒掉乙醇溶液，得糖蜜渣塊。
[0037]向糖蜜渣塊中加入95%乙醇120ml，在20KHz，400W，溫度為60°C，超聲探頭深入液面下3cm。間隔5秒，超聲3分鐘設置下連續超聲提取25分鐘。糖蜜塊成粉狀，趁熱過濾，得濾液和濾渣，600C 95%乙醇沖洗濾渣，得洗液，合并濾液和洗液，共得乙醇濾液170ml。
[0038]濾渣加入N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)6ml，攪拌提取25分鐘。過濾得DMF濾液。
[0039]將DMF濾液和乙醇濾液合并，經旋轉蒸發至液體為2.5ml，作為樣品液。
[0040]檢測方法同實施例1，糖蜜中生物素含量為26.6 μ g/g。
【權利要求】
1.一種以糖蜜為原料提取生物素的方法，其特征在于:步驟如下: (1)取糖蜜10?15g,加入100?150ml的80?95%乙醇溶液于燒杯中，在40KHz,功率為300?500W，溫度60?70°C條件下超聲處理20?30分鐘；超聲處理后，取出塊狀糖蜜，剩余乙醇溶液降溫至5°C以下，過濾得殘渣；將塊狀糖蜜與殘渣合并，用100?150ml乙醇溶液沖洗過濾，得糖蜜渣塊； (2)將上述糖蜜渣塊加入到100?150ml的95?100%的乙醇溶液中，在20KHz，300?500W，溫度為55?65°C，間隔5秒超聲3分鐘設置下連續超聲20?30分鐘；超聲處理后，趁熱過濾，得濾液和濾渣，用55?65°C的95?100%乙醇溶液洗濾渣，得洗液和濾渣，合并濾液和洗液得乙醇濾液，濾渣加入N，N- 二甲基甲酰胺，攪拌提取，過濾得DMF濾液； (3)將乙醇濾液和DMF濾液合并，得生物素溶液。
2.一種生物素的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:步驟如下: (1)取待檢測樣品液，點在硅膠板上，加入展開劑，在展開缸內展開，然后將薄層板拿出放在通風柜中晾干；同時，采用外標一點法點不同濃度的生物素標準品溶液，同時展開； 所述展開劑為二氯甲烷-氯仿-甲醇-冰乙酸混合液，其中，二氯甲烷、氯仿、甲醇、冰乙酸四者的體積比為I?3:1?3:1?2:0.04?0.06，優選3:3:2:0.06 ； 所述生物素標準品溶液包括濃度分別為0.05 μ g/μ 1,0.2μ g/μ 1,0.25 μ g/μ I,0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I的一系列標準品溶液； (2)將2，4-二甲氨基肉桂醛、硫酸和無水乙醇混合，配成染色液，其中2，4-二甲氨基肉桂醛終濃度為0.1?0.2%，硫酸終濃度為I?2%;展完后晾干的展板，用染色液噴霧染色，得到與背景對比明顯的標準品的斑點和樣品的斑點； (3)利用薄層掃描儀以530nm吸收波長進行薄層層析掃描，照射燈為鎢燈，檢測計算得到生物素標準品溶液質量和峰面積積分值的關系的回歸方程，然后根據樣品液的峰面積積分值計算出樣品液中生物素的質量濃度。
3.根據權利要求2所述的生物素的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:所述硅膠板為涂有硅膠GF254高效薄層板。
4.根據權利要求2所述的生物素的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于:所述樣品液是通過以下方法制備得到的: (1)取糖蜜10?15g,加入100?150ml的80?95%乙醇溶液于燒杯中，在40KHz,功率為300?500W，溫度60?70°C條件下超聲處理20?30分鐘；超聲處理后，取出塊狀糖蜜，剩余乙醇溶液降溫至5°C以下，過濾得殘渣；將塊狀糖蜜與殘渣合并，用100?150ml乙醇溶液沖洗過濾，得糖蜜渣塊； (2)將上述糖蜜渣塊加入到100?150ml的95?100%的乙醇溶液中，在20KHz，300?500W，溫度為55?65°C，間隔5秒超聲3分鐘設置下連續超聲20?30分鐘；超聲處理后，趁熱過濾，得濾液和濾渣，用55?65°C的95?100%乙醇溶液洗濾渣，得洗液和濾渣，合并濾液和洗液得乙醇濾液，濾渣加入N，N- 二甲基甲酰胺，攪拌提取，過濾得DMF濾液； (3)將乙醇濾液和DMF濾液合并，得生物素溶液，即為樣品液。
【文檔編號】G01N21/25GK103926130SQ201410188963
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月6日 優先權日:2014年5月6日
【發明者】劉代成 申請人:山東師范大學