本發(fā)明涉及基因芯片技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高密度、高穩(wěn)定性的核酸芯片的制備方法。

背景技術(shù)：

基因芯片又稱dna芯片，廣泛應(yīng)用于dna測(cè)序，基因表達(dá)和表達(dá)差異，基因突變和基因組多態(tài)性檢測(cè)，病原分析，基因診斷和疾病預(yù)后分析，病理學(xué)、毒理學(xué)、藥理學(xué)、疫苗研究和腫瘤研究等多個(gè)方面。

基因芯片的制備方法主要有物理吸附、共價(jià)鍵連接、鏈親和霉素-生物素三種方法。第一，物理吸附主要是利用dna探針帶負(fù)電荷與固相支持表面的正電荷之間的吸引力的作用。物理吸附的優(yōu)點(diǎn)是不需要對(duì)核酸進(jìn)行修飾，簡(jiǎn)單、直接、快速等；缺點(diǎn)是連接dna探針雜亂無(wú)章?lián)頂D沒有方向性，比較容易解析，不能夠重復(fù)利用等。第二，共價(jià)鍵連接是利用固相支持物表面進(jìn)行化學(xué)修飾活化，對(duì)核酸末端進(jìn)行化學(xué)官能團(tuán)修飾，通過(guò)化學(xué)共價(jià)鍵將dna探針連接到固相基底。共價(jià)鍵連接的優(yōu)點(diǎn)是連接穩(wěn)定好，鍵合力強(qiáng)，可以重復(fù)利用等；缺點(diǎn)是需要利用各種化學(xué)分子進(jìn)行鍵合作用，鍵合時(shí)間長(zhǎng)，不可逆轉(zhuǎn)性，局部擁擠效應(yīng)等。第三，鏈親和霉素-生物素是利用鏈親和霉素修飾在固相支持物上，將生物素修飾在dna末端，通過(guò)利用鏈親和霉素與生物素之間的相互作用使得dna固定化。鏈親和霉素-生物素的優(yōu)點(diǎn)是有比較好的方向性、特異性和功能性，比較容易控制，可逆轉(zhuǎn)性等；缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，芯片生產(chǎn)緩慢，擁擠效應(yīng)，特定的生物適合的條件要求，不能重復(fù)利用等。圖1是dna芯片的制備方法的示意圖。

目前，商業(yè)化基因芯片主要為氨基芯片和醛基芯片，二者都屬于共價(jià)鍵連接的芯片。其中醛基芯片適用于dna富集，但醛基芯片上的化學(xué)官能團(tuán)修飾為可逆反應(yīng)，dna探針容易脫落，連接不穩(wěn)定。圖2是商業(yè)化dna芯片醛基芯片的制備示意圖。

因此，本領(lǐng)域需要改進(jìn)核酸與固相支持表面的連接。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服目前現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種新型的、簡(jiǎn)單的化學(xué)修飾方法，高密度、高穩(wěn)定地連接目標(biāo)核酸探針。本發(fā)明通過(guò)對(duì)固相基底材料表面進(jìn)行氨基衍生、活性基團(tuán)氯修飾，進(jìn)而連接氨基核酸探針,制備出高密度，高穩(wěn)定性的核酸芯片。

因此，本發(fā)明提供了一種高密度、高穩(wěn)定性的核酸芯片的制備方法，所述方法包括步驟：

(1)將硅基固相基底羥基化，得到羥基化的固相基底；

(2)將所述羥基化的固相基底與第一氨基衍生試劑進(jìn)行偶聯(lián)，得到氨基化的固相基底；

(3)將所述氨基化的固相基底與氯修飾試劑在-2℃至6℃，優(yōu)選0℃至4℃下反應(yīng)，得到偶聯(lián)活性基團(tuán)氯的固相基底；

(4)將步驟(3)得到的固相基底與第二氨基衍生試劑在室溫下反應(yīng)；

(5)將步驟(4)得到的固相基底與氯修飾試劑在-2℃至6℃，優(yōu)選0℃至4℃下反應(yīng)；

(6)重復(fù)步驟(4)、(5)一次或多次；

(7)將氨基修飾的探針與步驟(6)得到的固相基底在60℃至70℃，優(yōu)選65℃下進(jìn)行反應(yīng)獲得基因芯片。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二氨基衍生試劑選自：多聚賴氨酸、不同類型的氨基硅烷偶聯(lián)劑、不同分子量的聚乙烯亞胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺、五乙烯六胺、乙二胺、己二胺等帶有伯氨基、仲氨基化合物中的任意一種。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一氨基衍生試劑為氨基硅烷偶聯(lián)劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二氨基衍生試劑為聚乙烯亞胺。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述氯修飾試劑為三聚氰氯。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(6)中，重復(fù)步驟(4)、(5)1-5次。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(6)中，重復(fù)步驟(4)、(5)直至所述固相基底上達(dá)到最大活性基團(tuán)氯數(shù)量。

在另一方面，本發(fā)明還涵蓋利用本發(fā)明的方法制備的核酸芯片以及用于核酸芯片的片基。

因此，本發(fā)明還提供了一種核酸芯片，所述核酸芯片包括：表面上連接有活性基團(tuán)氯的片基和氨基修飾的探針，所述氨基修飾的探針的氨基通過(guò)與所述片基表面上的活性基團(tuán)氯的sn2親核取代反應(yīng)固定于所述片基表面。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種用于核酸芯片的片基，所述用于核酸芯片的片基包括：

硅基固相基底、第一氨基衍生試劑、第二氨基衍生試劑和氯修飾試劑；

所述第一氨基衍生試劑通過(guò)-o-與所述硅基固相基底偶聯(lián)；

所述氯修飾試劑通過(guò)兩種方式連接在所述硅基固相基底表面上：

(1)所述氯修飾試劑的第一活性基團(tuán)氯與連接在固相基底上的第一氨基衍生試劑的氨基發(fā)生sn2親核取代反應(yīng)；或

(2)所述第二氨基衍生試劑的第一氨基與連接在所述硅基固相基底表面上的氯修飾試劑的第二活性基團(tuán)氯發(fā)生sn2親核取代反應(yīng)，連接在所述硅基固相基底表面上；所述氯修飾試劑的第一活性基團(tuán)氯與連接在所述硅基固相基底表面上的第二氨基衍生試劑的第二氨基發(fā)生sn2親核取代反應(yīng)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述氯修飾試劑為三聚氰氯。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述硅基固相基底表面有最大活性基團(tuán)氯數(shù)量。

利用本發(fā)明的方法制備的核酸芯片密度高，穩(wěn)定性高。

附圖說(shuō)明

通過(guò)以下附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明

圖1是dna芯片的制備方法的示意圖，從a-c分別示例性給出了物理吸附、共價(jià)鍵連接、鏈親和霉素-生物素結(jié)合。

圖2是商業(yè)化dna芯片醛基芯片的制備示意圖。

圖3示出了本發(fā)明的dna芯片的制備方法一個(gè)示例。a示出玻片上的硅被濃硫酸雙氧水羥基化，得到羥基化玻片；b示出將所述羥基化玻片與氨基硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行偶聯(lián)；c示出將所述氨基化玻片與三聚氰氯反應(yīng)，三聚氰氯通過(guò)與聚乙烯亞胺發(fā)生sn2親核取代反應(yīng)連接至所述氨基化玻片上；d示出將c中得到的玻片與聚乙烯亞胺反應(yīng)；e示出將d中得到的玻片與三聚氰氯反應(yīng)，三聚氰氯通過(guò)氨基連接至所述氨基化玻片上；f示出將氨基修飾的探針與連接三聚氰氯的玻片進(jìn)行反應(yīng)獲得核酸芯片。圖c-e中，(a)和(b)為同一結(jié)構(gòu)的不同表示。

圖4示出了利用x射線光電子能譜儀(xps)獲得芯片表面活性基團(tuán)的圖譜，通過(guò)所述圖譜可以確定每步反應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)：a為羥基片表征圖譜；b為氨基片表征圖譜；c為聚合物玻片表征圖譜；d為dna芯片表征圖譜。

圖5示出了通過(guò)qpcr檢測(cè)目標(biāo)dna濃度。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過(guò)利用化學(xué)方法將目標(biāo)核酸探針固定于固相基底材料上的核酸芯片技術(shù)，尤其是利用特定的固相基底材料及特殊的化學(xué)修飾把大量目標(biāo)核酸探針高密度、高穩(wěn)定地固定于基底材料上

本發(fā)明提供了一種高密度、高穩(wěn)定性的核酸芯片的制備方法，所述方法包括步驟：

(1)將硅基固相基底羥基化，得到羥基化的固相基底；

(2)將所述羥基化的固相基底與氨基衍生試劑進(jìn)行偶聯(lián)，得到氨基化的固相基底；

(3)將所述氨基化的固相基底與氯修飾試劑反應(yīng)，得到偶聯(lián)活性基團(tuán)氯的固相基底；

(4)將步驟(3)得到的固相基底與氨基衍生試劑反應(yīng)；

(5)將步驟(4)得到的固相基底與氯修飾試劑反應(yīng)；

(6)重復(fù)步驟(4)、(5)直至所述固相基底上達(dá)到最大活性基團(tuán)氯數(shù)量；

(7)將氨基修飾的探針與步驟(6)得到的固相基底進(jìn)行反應(yīng)獲得核酸芯片。

優(yōu)選地，在步驟(3)中，在-2℃至6℃，優(yōu)選0℃至4℃下進(jìn)行反應(yīng)；在步驟(4)中，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)；在步驟(5)中，在-2℃至6℃，優(yōu)選0℃至4℃下進(jìn)行反應(yīng)；在步驟(7)中，在60℃至70℃，優(yōu)選65℃下進(jìn)行反應(yīng)。

在本發(fā)明中，步驟(4)中，固相支持物表面的三聚氰氯與氨基衍生試劑發(fā)生sn2親核取代反應(yīng)，使得氨基衍生試劑能夠共價(jià)連接于固相支持物表面；在步驟(5)中氯修飾試劑上的氯與連接在固相基底上的氨基發(fā)生sn2親核取代反應(yīng)，從而使得氯基團(tuán)固定于固相支持物表面。通過(guò)如此循環(huán)(步驟6)，放大活性基團(tuán)氯的數(shù)量。也就是說(shuō)，每次親核取代反應(yīng)引入更多的氨基和/或活性基團(tuán)氯，直至固相支持物表面達(dá)到飽和。

在本發(fā)明中，氨基修飾的核酸探針可以是dna探針、rna探針或其他核酸類似物探針。dna氨基修飾探針的制備方法是，首先通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)探針；通過(guò)高通量基因合成平臺(tái)合成探針；通過(guò)基因克隆技術(shù)制備探針模板；最終利用氨基修飾的引物，通過(guò)pcr技術(shù)生產(chǎn)出氨基修飾的dna探針。rna氨基修飾探針的方法：首先通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)探針；通過(guò)高通量基因合成平臺(tái)合成探針；通過(guò)基因克隆技術(shù)制備探針模板；最終通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)出氨基修飾的rna探針。

在本發(fā)明中，所述硅基固相基底可以為玻璃、陶瓷、硅、石英等材質(zhì)。這些材質(zhì)表面都可以提供用于羥化的硅。

本發(fā)明中，所使用的氨基衍生試劑指的是分子中含有伯氨基和仲氨基的有機(jī)試劑，可以為多聚賴氨酸、不同類型的氨基硅烷偶聯(lián)劑、不同分子量的聚乙烯亞胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺、五乙烯六胺、乙二胺、己二胺等帶有伯氨基、仲氨基化合物中的任意一種。

本發(fā)明中所使用氯修飾試劑優(yōu)選是有機(jī)試劑三聚氰氯。

本發(fā)明中所使用的溶劑為一般的有機(jī)溶劑，例如為正己烷、異辛烷、丙酮、四氫呋喃中的任意一種。

在本發(fā)明中，發(fā)明人不希望拘囿于任何理論，因?yàn)閱蝹€(gè)的固相支持物表面積是一定的，重復(fù)到一定次數(shù)芯片表面活性基團(tuán)數(shù)量就會(huì)達(dá)到相對(duì)飽和，達(dá)到所述固相基底上達(dá)到最大活性基團(tuán)氯數(shù)量。在本發(fā)明中，所述固相基底上達(dá)到最大活性基團(tuán)氯數(shù)量是指繼續(xù)重復(fù)的情況下活性基團(tuán)氯基本不增加，或者僅稍微增加，例如再增加重復(fù)每次僅增加小于5％，優(yōu)選小于2％，更優(yōu)選小于1％。

在本發(fā)明中，室溫是指15℃-40℃，優(yōu)選20℃-30℃，最優(yōu)選25℃。

氨基修飾的核酸或氨基修飾的探針，氨基修飾可以是內(nèi)部氨基修飾、5'氨基修飾和3'氨基修飾：

(1)內(nèi)部氨基修飾，主要用c6-dtaminolinker來(lái)加到胸腺嘧啶殘基上來(lái)進(jìn)行內(nèi)部修飾。修飾后氨基與主鏈相距10個(gè)原子距離，可用于進(jìn)一步的標(biāo)記和酶連接，目前提供內(nèi)部氨基修飾介導(dǎo)的dt-dabcyl、dt-biotin和dt-digoxingenin修飾。

(2)5'氨基修飾，可用于制備功能化的寡核苷酸，廣泛應(yīng)用在dna芯片(dnamicroarray)和多重標(biāo)記診斷系統(tǒng)。目前提供5'c6氨基修飾和5'c12氨基修飾兩種，前者可用于連接一些即便靠近寡核苷酸也不會(huì)影響其功能的化合物，后者用于親和純化基團(tuán)的連接和一些熒光標(biāo)記，尤其是當(dāng)熒光可能會(huì)因標(biāo)記太靠近dna鏈而被淬滅時(shí)。

(3)3'氨基修飾，目前提供3'c6氨基修飾。它可用于設(shè)計(jì)新的診斷探針和反義核苷酸，例如5'端可用高度敏感的32p或熒光素標(biāo)記的同時(shí)3'可用氨基修飾以進(jìn)行其他的連接。此外，3'修飾可以抑制3'外切酶酶解，從而可用于反義實(shí)驗(yàn)。

對(duì)于本發(fā)明使用的氨基修飾的探針，可以通過(guò)探針提供商商業(yè)化獲得。

在本發(fā)明中，只要能夠提供活性氨基與活性基團(tuán)氯發(fā)生sn2親核取代反應(yīng)，用于與反應(yīng)即可，并不局限于任何氨基修飾方式。雖然內(nèi)部氨基修飾、5'氨基修飾和3'氨基修飾都可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，但優(yōu)選使用5'氨基修飾的探針。5'氨基修飾的探針在探針擴(kuò)增時(shí)，可以通過(guò)5'氨基修飾的引物擴(kuò)增獲得，5'氨基修飾的引物通?？梢酝ㄟ^(guò)引物提供商商業(yè)化獲得。

在本發(fā)明中，優(yōu)選所使用的dna探針為氨基修飾dna探針。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的高密度、高穩(wěn)定性的dna芯片的制備方法包括步驟：

(1)將玻片上的硅羥基化，得到羥基化玻片；

(2)將所述羥基化玻片與氨基硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行偶聯(lián)，得到氨基化玻片；

(3)將所述氨基化玻片與三聚氰氯(例如三聚氰氯的四氫呋喃溶液)反應(yīng)；

(4)將步驟(3)得到的玻片與聚乙烯亞胺反應(yīng)；

(5)將步驟(4)得到的玻片與三聚氰氯(例如三聚氰氯的四氫呋喃)反應(yīng)，

(6)重復(fù)步驟(4)、(5)直至芯片表面達(dá)到最大活性基團(tuán)氯數(shù)量；

(7)將氨基修飾的探針與步驟(6)得到的玻片進(jìn)行反應(yīng)獲得核酸芯片。

優(yōu)選地，在步驟(3)中，在-2℃至6℃，優(yōu)選0℃至4℃下進(jìn)行反應(yīng)；在步驟(4)中，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)；在步驟(5)中，在-2℃至6℃，優(yōu)選0℃至4℃下進(jìn)行反應(yīng)；在步驟(7)中，在60℃至70℃，優(yōu)選65℃下進(jìn)行反應(yīng)。

實(shí)施例

制備實(shí)施例

本發(fā)明的核酸芯片的制備的具體操作工藝如下：

(1)將玻片用蒸餾水、鉻酸洗液清洗過(guò)后，浸沒于濃硫酸：雙氧水(30％)＝1：1混合溶液中，70℃條件下反應(yīng)2h，得到羥基化玻片，見圖3a；圖3a示出玻片上的硅被濃硫酸雙氧水羥基化，得到羥基化玻片。

(2)將上述羥基化玻片浸沒于15％氨基硅烷偶聯(lián)劑(本實(shí)施例中使用的是γ-氨丙基三乙氧基硅烷)的乙醇溶液中，50℃反應(yīng)24h，得到氨基化玻片，見圖3b；圖3b示出將所述羥基化玻片與氨基硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行偶聯(lián)。

(3)稱取三聚氰氯5mmol，將其溶于300ml四氫呋喃(thf)溶劑中，將氨基化處理的玻片置于該反應(yīng)體系，冰浴超聲4℃條件下反應(yīng)1h，四氫呋喃超聲清洗，空氣中干燥，該過(guò)程如圖3c所示；圖3c示出將氨基化玻片與三聚氰氯反應(yīng)，三聚氰氯上的氯與連接在固相基底上的氨基衍生試劑的氨基發(fā)生sn2親核取代反應(yīng)，連接至所述氨基化玻片上，(a)和(b)為同一結(jié)構(gòu)的不同表示。

(4)將步驟(3)得到的玻片置于0.1％聚乙烯亞胺水溶液中，室溫超聲反應(yīng)1h，去離子水超聲清洗，氮?dú)獯蹈?，該過(guò)程如圖3d所示；圖3d示出將步驟(3)中得到的玻片與聚乙烯亞胺反應(yīng)，(a)和(b)為同一結(jié)構(gòu)的不同表示。

(5)稱取三聚氰氯5mmol，將其溶于300ml四氫呋喃(thf)溶劑中，將步驟(4)得到的玻片置于該反應(yīng)體系中，冰浴超聲4℃條件下反應(yīng)1h，四氫呋喃超聲清洗，空氣中干燥，該過(guò)程如圖3e所示；圖3e示出將步驟(4)中得到的玻片與三聚氰氯反應(yīng)，三聚氰氯上的氯與連接在固相基底上的氨基衍生試劑的氨基發(fā)生sn2親核取代反應(yīng)，連接至所述氨基化玻片上，(a)和(b)為同一結(jié)構(gòu)的不同表示。

(6)重復(fù)步驟(4)、(5)步驟一次；

(7)將10¹²個(gè)氨基修飾的dna探針涂布于步驟(6)得到的芯片表面，65℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，制備成芯片，通過(guò)富集目標(biāo)dna并進(jìn)行濃度檢測(cè)得到芯片表面探針數(shù)量為10⁹個(gè)。

在本實(shí)施例中，氨基修飾探針制備原理：首先通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)探針；通過(guò)高通量基因合成平臺(tái)合成探針；通過(guò)基因克隆技術(shù)制備探針模板；最終利用氨基修飾的引物為5'c6氨基修飾(該氨基修飾的引物由蘇州泓迅科技股份有限公司提供)，通過(guò)pcr技術(shù)生產(chǎn)出氨基修飾的探針。

方法如下：

a.top10感受態(tài)細(xì)胞制備-cacl2熱激法；

b.將目的探針序列轉(zhuǎn)化至質(zhì)粒puc57中構(gòu)建重組質(zhì)粒；

c.采用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞top10中；

d.采用amp抗性平板篩選陽(yáng)性克隆后用于pcr擴(kuò)增模板；

e.目的片段獲得：

pcr反應(yīng)體系：

反應(yīng)程序：95℃3min；29個(gè)循環(huán)：(95℃30s，初次66℃，每個(gè)循環(huán)-0.2℃72℃60s)；72℃5min；12℃維持。

f.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr產(chǎn)物，對(duì)目的片段采用天根凝膠回收試劑盒純化回收。

g.quit測(cè)定純化產(chǎn)物的濃度。

在本實(shí)施例中，探針固定方法步驟如下：

將氨基dna探針點(diǎn)制在芯片上后，探針上的氨基將和基片表面的氯發(fā)生置換反應(yīng)而固定dna探針，具體的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程如圖3f所示，圖3f示出將氨基修飾的探針與連接三聚氰氯的玻片進(jìn)行反應(yīng)獲得核酸芯片：

a.配制點(diǎn)樣液：將氨基修飾的dsdna探針與20×ssc緩沖液配制點(diǎn)樣液，探針終濃度為25mm，3×ssc；

b.準(zhǔn)備密閉水化容器：將飽和食鹽水浸濕的吸水紙置于密閉容器底部；

c.涂覆探針：用毛細(xì)管將點(diǎn)樣液均勻涂布于p-基片上；

d.紫外處理：將芯片放入紫外交聯(lián)儀，600mj處理；

e.過(guò)夜水化：將涂布好的芯片置于步驟(2)中備好的密閉玻容器中，懸浮于吸水紙上方，37℃處理過(guò)夜；

f.點(diǎn)樣后漂洗：含有0.2％sds的2×ssc清洗液搖床漂洗5min，1×ssc清洗液搖床漂洗5min，ddh2o搖床漂洗5min，氮?dú)飧稍铮?/p>

g.封閉：tris-hcl緩沖液(ph＝7.5)封閉處理5min；

h.蒸餾水漂洗三次，每次搖床處理5min；

i.氮?dú)飧稍铮?℃干燥密封保存。

所述反應(yīng)步驟(6)中，重復(fù)(4)、(5)步反應(yīng)一次即可達(dá)到最大活性基團(tuán)修飾數(shù)量。

所述反應(yīng)步驟(7)中所使用的氨基探針數(shù)量可以為10⁷-10¹³個(gè)。

通過(guò)x射線光電子能譜儀(xps)可以確定每步反應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)，對(duì)本發(fā)明核酸芯片的制備過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)的方法步驟如下：

1)通過(guò)利用x射線光電子能譜儀(xps)得到芯片表面活性基團(tuán)修飾成功(見圖4)。

圖4示出了利用x射線光電子能譜儀(xps)獲得芯片表面活性基團(tuán)的圖譜：a為羥基片表征圖譜，證明了將硅基固相基底羥基化，得到羥基化的固相基底；b為氨基片表征圖譜，證明了將所述羥基化的固相基底與第一氨基衍生試劑進(jìn)行偶聯(lián)，得到氨基化的固相基底；c為聚合物玻片表征圖譜，證明了將所述氨基化的固相基底與氯修飾試劑在得到偶聯(lián)活性基團(tuán)氯的固相基底；d為dna芯片表征圖譜，證明了將氨基修飾的探針與固相基底反應(yīng)獲得dna芯片。在圖4b中，結(jié)合能為400ev處比圖4a中多了一個(gè)n峰，表明氨基在固相支持物表面修飾成功；圖4c中結(jié)合能為200ev處比圖4b又多了一個(gè)cl峰，表明活性基團(tuán)cl在固相支持物表面修飾成功，而且圖4c中的n峰明顯比圖4b中的n峰高出很多，表明我們通過(guò)氨基衍生試劑來(lái)增加固相支持物表面活性基團(tuán)數(shù)量取得了極大的成功；圖4d中結(jié)合能為135ev處比圖4c又多出了一個(gè)p峰，表明氨基修飾dna成功連接于固相支持物表面。

2)利用dna雜交技術(shù)富集目標(biāo)dna，并回收目標(biāo)dna，通過(guò)qpcr檢測(cè)目標(biāo)dna濃度，得到芯片表面探針數(shù)目(見圖5)。

圖5示出了通過(guò)qpcr檢測(cè)目標(biāo)dna濃度。從圖5可以看出：本發(fā)明的方法制備的芯片(p1\p2\p3)通過(guò)qpcr檢測(cè)cq值約13～15，而商業(yè)醛基片檢測(cè)cq值約為23，這代表本發(fā)明的方法制備的芯片富集產(chǎn)物濃度是商業(yè)醛基片(cho)的10～100倍。

本發(fā)明有如下技術(shù)效果：

(1)本發(fā)明所使用的試劑三聚氰氯三個(gè)氯原子為可溫控反應(yīng)，第一個(gè)氯原子在0℃左右即可反應(yīng)，第二個(gè)氯原子在室溫條件下反應(yīng)，第三個(gè)氯原子在65℃左右才能反應(yīng)，這樣就能大大提高了芯片表面活性基團(tuán)的數(shù)量，而且三聚氰氯反應(yīng)生成三聚氰胺在dna雜交條件下性質(zhì)穩(wěn)定探針不易脫落，可重復(fù)利用多次。

(2)本發(fā)明所使用的氨基衍生試劑為各種多氨基化合物，其大大提高了芯片表面的活性位點(diǎn)，進(jìn)一步提升了芯片表面活性基團(tuán)的密度。