一種食用香精香料中八種成分同時測定的方法
【專利摘要】本發明公開了一種食用香精香料中八種成分同時測定的方法，包括以下步驟：萃取溶液的配制、標準溶液的配制、樣品溶液的制備、超高效液相色譜-串聯質譜分析以及含量的計算。本發明通過對食用香精香料中八種成分測定方法的前處理條件、液相色譜條件和質譜條件的優化，建立了一種簡便、快速、高通量的測定方法，本發明具有操作簡單、靈敏度高、回收率好、重現性好且檢測時間短、溶劑消耗小、檢測通量高、檢測效率高的優點。
【專利說明】一種食用香精香料中八種成分同時測定的方法
[0001]

【技術領域】： 本發明屬于理化檢驗【技術領域】，具體涉及一種食用香精香料中八種成分硫脲、芝麻酚、 脫氫乙酸、對乙氧基苯脲、鄰氨基苯甲酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和山梨酸同時 測定的方法。
[0002]

【背景技術】： 硫脲即硫代尿素，是一種重要的化工原料，主要用于有機合成，紡織工業等，由于其具 有一定的漂白功能，還可應用于紡織品的漂白。有報道稱，接觸硫脲可能造成甲狀腺腫大等 疾病，硫脲還對上呼吸道、眼、胃腸道有刺激性，對皮膚有損害，國家規定嚴格禁止將硫脲添 加到食品中。硫脲的測定方法主要有液相色譜法、光度法、液相色譜-串聯質譜法和電化學 法等。
[0003] 芝麻酚為芳香族酚類化合物，天然存在于芝麻油中，具有抗氧化的作用，是芝麻油 重要的品質穩定劑，該物質具有較強的自由基清除能力，被廣泛用于制備防霉抗菌劑、抗 癌、抗高血壓藥品、高檔洗發香波的頭發調理劑等。基于該物質的致腫瘤可能性，2006年日 本厚生勞動省將芝麻酚列入禁用的42種食品添加劑名單一。國標GB2760- 2011《食品添 加劑使用衛生標準》中也未將芝麻酚列入許可使用的食品添加劑名單。研究報道的芝麻酚 的檢測方法主要集中在氣相色譜/質譜法，超高效液相色譜法等。
[0004] 脫氧乙fe對霉囷、酵母囷、腐敗囷均有一定的抑制作用。在食品中被用作防腐劑、 防霉劑，用于以碳水化合物為主要成分的食品防腐，主要應用于醬菜、腐乳、果汁、糕點等。 脫氫乙酸為酸型防腐劑，其效力隨pH值而定，酸性越強效果越好，而在堿性條件下幾乎無 效。脫氫乙酸能迅速被人體所吸收，進入人體后即分散于血漿和許多器官中，有抑制體內多 種氧化酶的作用。目前，歐共體已明確禁止使用，日本對其使用也進行了限制，我國在一定 范圍內允許其使用，但最大允許使用量為300 μ g/mL。脫氫乙酸的檢測方法主要有氣相色譜 法、高效液相色譜法等。
[0005] 甘素，學名為對乙氧基苯脲，是一種人工合成甜味劑，其甜度相當于蔗糖的200 倍。甘素具有致癌性，因而被列為禁用物質。甘素的測定方法主要有液相色譜法、液質聯用 法、毛細管電泳法等。
[0006] 鄰氨基苯甲酸肉桂酯可作為調味劑或香味劑，從而被用于化妝品、食品等行業，在 最終加香食品中濃度約為1.7-730mg/Kg。由于鄰氨基苯甲酸肉桂酯是一種合成產品，一些 研究表明該物質具有致癌性，對人體具有較大的危害，從而在多個國家被禁止使用。1940開 始，鄰氨基苯甲酸肉桂酯作為一種合成的調味劑用于葡萄或櫻桃風味的食品中，并獲得美 國食品和藥物管理局批準作為食品添加劑，歐盟也將鄰氨基苯甲酸肉桂酯作為人工香味物 質，建議使用濃度為25mg/Kg。1980年，英國國家癌癥研究院研究發現高濃度地將鄰氨基苯 甲酸肉桂酯添加于食品中導致雜交小鼠體內肝細胞發生癌變，英國食品專家委員會因此而 將其禁止應用于食品工業。隨后，美國食品和藥物管理局也將鄰氨基苯甲酸肉桂酯列為食 品中禁止使用的添加劑。鄰氨基苯甲酸肉桂酯的檢測方法主要有高效液相色譜法等。
[0007] 正二氫愈創酸（NDGA)為抗氧化劑，是從常青灌木中提取的一種天然產物，具有多 種生物活性，包括抑制脂氧化酶、乳頭狀瘤病毒、單純皰疹病毒和降血糖的作用等。近年 NDGA腫瘤血管生成抑制作用的發現，及其具有抑制多種腫瘤的發生和發展的作用，尤其是 NDGA對人腦惡性膠質瘤的治療作用，為治療腫瘤、癌癥提供了新的途徑。高效立體選擇性 的合成NDGA為發展新型治療腫瘤、癌癥新藥提供了物質基礎，使抗癌新藥的研發工作得以 開展。正二氫愈創酸的測定方法主要有高液相色譜法、液相色譜-質譜法等。
[0008] 馬兜鈴酸是硝基菲類化合物，具有提高機體抗菌能力，提高細胞免疫功能的作用， 普遍存在于馬兜鈴科馬兜鈴屬植物中。該類植物在中國、印度等國較廣泛地用于醫藥配制。 2000年5月美國食品藥品管理局（FDA)禁止了包括關木通、馬兜鈴、青木香、天仙藤、廣防 己、木防己等同名異物、異名同物品種的相關草藥和中成藥的進口和銷售。隨后，英國、加拿 大、澳大利亞、新西蘭和馬來西亞等國家也采取了同樣的措施。在自然界發現的6種馬兜鈴 酸中，馬兜鈴酸A的毒性最強。文獻報道馬兜鈴酸類物質的檢測方法已有很多，主要有薄層 色譜法、高效液相色譜法（HPLC)、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS)等。
[0009] 山梨酸是我國允許使用的食品防腐劑，其化學名稱為2, 4-己二烯酸，具有較好的 穩定性。由于山梨酸對霉菌、酵母菌、好氣性細菌具有較好的抑制作用，且其毒性較小、安全 性較高，常作為食品的防腐劑使用，但過量、長期食用會危害人體肝臟、腎臟功能，國家標準 GB2760-2007中明確規定了山梨酸的最大使用限量。山梨酸的防腐效果隨pH值的升高而降 低，其pH值一般為5. 0-6. 0。山梨酸含量的測定方法主要有分光光度法、色譜法、紫外吸收 光度法等。
[0010]目前，國內外公開文獻暫無關于這八種成分同時檢測的方法。
[0011]


【發明內容】
： 本發明的目的在于提供一種食用香精香料中八種成分硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧 基苯脲、鄰氨基苯甲酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和山梨酸同時測定的方法。
[0012] 本發明針對現有技術的不足，通過長期的研究和探索，在方法對比、優化的基礎上 提出了一種食用香精香料中八種成分(硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基苯脲、鄰氨基苯甲 酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和山梨酸）測定的方法，用于檢測食用香精香料中硫 脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基苯脲、鄰氨基苯甲酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和 山梨酸。本發明考察研究了食用香精香料中硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基苯脲、鄰氨基 苯甲酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和山梨酸的前處理條件、液相色譜條件和質譜條 件，為簡便、快速、高通量的測定食用香精香料中的八種成分提供了技術支持。
[0013] 本發明的技術方案為：所述的測定方法包括以下步驟： A、 萃取溶液的配制：取甲醇制備成體積比7:3的甲醇-水溶液即為萃取溶液； B、 標準溶液的配制：用含內標的萃取溶液分別配制硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基 苯脲、鄰氨基苯甲酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和山梨酸的標準溶液； C、 樣品溶液的制備：使用含內標的萃取溶液萃取食用香精香料樣品，過有機相濾膜后 得到樣品溶液； D、 超高效液相色譜-串聯質譜儀分析：利用超高效液相色譜-串聯質譜儀分別對標準 溶液和樣品溶液進行檢測分析； E、 食用香精香料中八種成分硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基苯脲、鄰氨基苯甲酸肉 桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和山梨酸含量的計算。
[0014] B步驟中所述標準溶液的配制是：分別稱取硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基苯 脲、鄰氨基苯甲酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和山梨酸各20mg，用甲醇溶解后轉移 至100mL棕色容量瓶中，定容至刻度，分別得到單一標準儲備液；稱取水楊酸-d4 10mg，用 甲醇溶解后轉移至50mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到內標儲備液；分別取單一標 準儲備液0. Ι-lmL至50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一級混合標準溶液；取內 標儲備液lmL至50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一級內標標準溶液；分別準確 移取0. lmL、0. 51^、11^、21^、51^的一級混合標準溶液至5〇11^棕色容量瓶中，每個棕色容量 瓶均加入2mL -級內標標準溶液，用萃取溶液定容至刻度，得到系列標準溶液。
[0015] 取0.8mL內標儲備液至1L棕色容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，得到含內標的 萃取溶液。所述含內標的萃取溶液中的內標物為水楊酸-d4。
[0016] C步驟中所述樣品溶液的制備方法是：稱取0. 5g試樣于50mL具塞錐形瓶中，準 確加入25mL含內標的萃取溶液，用150r/min振蕩萃取20min，取上清液過有機相濾膜，濾 液為樣品溶液。所述的有機相濾膜為0.22 μ m聚醚砜濾膜。所述振蕩萃取的振蕩頻率為 120-180r/min，萃取時間為 10-30min。
[0017] D步驟中所述的色譜分析條件為色譜柱采用C18,1.7 μ m，2. IX 100mm色譜柱；流 動相為甲醇A和0. 05%甲酸水溶液B ;流速：0. 4mL/min ;進樣量：5 μ L ;柱溫：40°C ;樣品溫 度：l〇°C ;采用梯度洗脫程序，即初始A是10%，B是90%，lmin時A是35%，B是65%，4min 時 A 是 65%，B 是 35%，6min 時初始 A 是 90%，B 是 10%，7min 時 A 是 90%，B 是 10%，8min 時 A 是10%，B是90%，lOmin時A是10%，B是90% ;所述的質譜條件為：電噴霧離子源（ESI)正 離子模式，掃描方式為多反應監測模式，電噴霧電壓為5500V，離子源溫度600°C，氣簾氣 ： 25Psi，霧化氣：55Psi，輔助加熱氣：50Psi，硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基苯脲、鄰氨基 苯甲酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A、山梨酸和水楊酸-d4的定量離子對分別為：m/z 60. 0, 109. 1，127. 1，108. 0, 117. 1，193. 2, 265. 1，95. 1，97· 1。其它質譜參數見表 1。
[0018] Ε步驟中所述含量的計算是：首先以標準溶液所檢測出的目標物和內標物的色譜 峰面積比對應其相應濃度比進行回歸分析得到標準曲線線性方程，然后將樣品溶液檢出的 目標物的色譜峰面積，代入標準曲線線性方程，即得到樣品中硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙 氧基苯脲、鄰氨基苯甲酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸Α、山梨酸的含量。
[0019] 本發明針對現有技術的不足，通過對食用香精香料中硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對 乙氧基苯脲、鄰氨基苯甲酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸Α和山梨酸的前處理條件、色 譜條件和質譜條件的優化，建立了一種簡便、快速、高通量的測定方法，為食用香精香料中 的八種成分的檢測提供了技術支持。本發明具有操作簡單、靈敏度高、回收率好、重現性好 且檢測時間短、溶劑消耗小、檢測通量高、檢測效率高的優點，對于監督食用香精香料的質 量安全具有非常重要的意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為本發明的測定方法的流程圖。
[0021] 圖2為硫脲的標準曲線線性方程及線性回歸系數坐標圖。
[0022] 圖3為芝麻酚的標準曲線線性方程及線性回歸系數坐標圖。
[0023] 圖4為脫氫乙酸的標準曲線線性方程及線性回歸系數坐標圖。
[0024] 圖5為對乙氧基苯脲的標準曲線線性方程及線性回歸系數坐標圖。
[0025] 圖6為鄰氨基苯甲酸肉桂酯的標準曲線線性方程及線性回歸系數坐標圖。
[0026] 圖7為正二氫愈創酸的標準曲線線性方程及線性回歸系數坐標圖。
[0027] 圖8為馬兜鈴酸A的標準曲線線性方程及線性回歸系數坐標圖。
[0028] 圖9為山梨酸的標準曲線線性方程及線性回歸系數坐標圖。
[0029] 圖10為標準溶液中硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基苯脲、鄰氨基苯甲酸肉桂 酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和山梨酸的色譜圖。

【具體實施方式】
[0030] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以 限制，基于本發明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發明的保護范圍。
[0031] 實施例1 : 本發明所述食用香精香料中八種成分同時測定的方法，包括以下步驟： (1) 萃取溶液的配制：取甲醇制備成體積比7:3的甲醇-水溶液即為萃取溶液； (2) 標準溶液的配制：用含內標的萃取溶液分別配制硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基 苯脲、鄰氨基苯甲酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和山梨酸的標準溶液； (3 )樣品溶液的制備：使用含內標的萃取溶液萃取食用香精香料樣品，過有機相濾膜后 得到樣品溶液； (4) 超高效液相色譜-串聯質譜儀分析：利用超高效液相色譜-串聯質譜儀分別對標 準溶液和樣品溶液進行檢測分析； (5) 食用香精香料中八種成分硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基苯脲、鄰氨基苯甲酸肉 桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和山梨酸含量的計算。
[0032] B步驟中所述標準溶液的配制是：分別稱取硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基苯 脲、鄰氨基苯甲酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和山梨酸各20mg，用甲醇溶解后轉移 至100mL棕色容量瓶中，定容至刻度，分別得到單一標準儲備液；稱取水楊酸-d4 10mg，用 甲醇溶解后轉移至50mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到內標儲備液；分別取單一標 準儲備液0. Ι-lmL至50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一級混合標準溶液；取內 標儲備液lmL至50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一級內標標準溶液；分別準確 移取0. lmL、0. 5mL、lmL、2mL、5mL的一級混合標準溶液至50mL棕色容量瓶中，每個棕色容量 瓶均加入2mL -級內標標準溶液，用萃取溶液定容至刻度，得到系列標準溶液。所述分別取 單一標準儲備液0. lmL-lmL具體為分別取硫脲、芝麻酚、對乙氧基苯脲、正二氫愈創酸、馬 兜鈴酸A、山梨酸單一標準儲備液lmL和脫氫乙酸、鄰氨基苯甲酸肉桂酯0. lmL。
[0033] 取0. 8mL內標儲備液至1L棕色容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，得到含內標的 萃取溶液。所述含內標的萃取溶液中的內標物為水楊酸-d4。
[0034] C步驟中所述樣品溶液的制備方法是：稱取0. 5g試樣于50mL具塞錐形瓶中，準確 加入25mL含內標的萃取溶液，用150r/min振蕩萃取20min，取上清液過有機相濾膜，濾液為 樣品溶液。樣品溶液用超高效液相色譜-串聯質譜儀進行分析。
[0035] 所述的有機相濾膜為0.22 μ m聚醚砜濾膜。D步驟中所述的液相色譜分析條件 為：色譜柱：C18,1. 7 μ m，2. 1 X 100mm色譜柱；流動相為甲醇A和0· 05%甲酸水溶液B ;流 速：0. 4mL/min ;進樣量：5 μ L ;柱溫：40°C ;樣品溫度：10°C ;采用梯度洗脫程序，即初始A是 10%，B 是 90%，lmin 時 A 是 35%，B 是 65%，4min 時 A 是 65%，B 是 35%，6min 時初始 A 是 90%， B 是 10%，7min 時 A 是 90%，B 是 10%，8min 時 A 是 10%，B 是 90%，lOmin 時 A 是 10%，B 是 90% ; 所述的質譜條件為采用電噴霧離子源（ESI)正離子模式，掃描方式為多反應監測模式，電噴 霧電壓為5500V，離子源溫度600°C，氣簾氣：25Psi，霧化氣：55Psi，輔助加熱氣：50Psi，硫 脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基苯脲、鄰氨基苯甲酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A、山 梨酸和水楊酸-d4的定量離子對分別為： m/z 60. 0, 109. 1，127. 1，108. 0, 117. 1，193. 2, 265. 1，95. 1，97· 1。其它質譜參數見表 1〇
[0036] 表1食用香精香料中八種成分的質譜參數表

【權利要求】
1. 一種食用香精香料中八種成分同時測定的方法，其特征在于包括以下步驟： A、 萃取溶液的配制：取甲醇制備成體積比7:3的甲醇-水溶液即為萃取溶液； B、 標準溶液的配制：用含內標的萃取溶液分別配制硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基 苯脲、鄰氨基苯甲酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和山梨酸的標準溶液； C、 樣品溶液的制備：使用含內標的萃取溶液萃取食用香精香料樣品，過有機相濾膜后 得到樣品溶液； D、 超高效液相色譜-串聯質譜儀分析：利用超高效液相色譜-串聯質譜儀分別對標準 溶液和樣品溶液進行檢測分析； E、 食用香精香料中八種成分硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基苯脲、鄰氨基苯甲酸肉 桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和山梨酸含量的計算。
2. 根據權利要求1所述食用香精香料中八種成分同時測定的方法，其特征在于B步驟 中所述標準溶液的配制是：分別稱取硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基苯脲、鄰氨基苯甲酸 肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A和山梨酸各20mg,用甲醇溶解后轉移至lOOmL棕色容量 瓶中，定容至刻度，分別得到單一標準儲備液；稱取水楊酸-d4 10mg，用甲醇溶解后轉移至 50mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到內標儲備液；分別取單一標準儲備液0. Ι-lmL至 50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一級混合標準溶液；取內標儲備液lmL至50mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一級內標標準溶液；分別準確移取〇. lmL、0. 5mL、 lmL、2mL、5mL的一級混合標準溶液至50mL棕色容量瓶中，每個棕色容量瓶均加入2mL -級 內標標準溶液，用萃取溶液定容至刻度，得到系列標準溶液。
3. 根據權利要求1所述食用香精香料中八種成分同時測定的方法，其特征在于取 0. 8mL內標儲備液至1L棕色容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，得到含內標的萃取溶液。
4. 根據權利要求1或3所述食用香精香料中八種成分同時測定的方法，其特征在于所 述含內標的萃取溶液中的內標物為水楊酸-d4。
5. 根據權利要求1所述食用香精香料中八種成分同時測定的方法，其特征在于C步驟 中所述樣品溶液的制備方法是：稱取〇. 5g試樣于50mL具塞錐形瓶中，準確加入25mL含內 標的萃取溶液，用150r/min振蕩萃取20min，取上清液過有機相濾膜，濾液為樣品溶液。
6. 根據權利要求1或5所述食用香精香料中八種成分同時測定的方法，其特征在于所 述的有機相濾膜為〇. 22 μ m聚醚砜濾膜。
7. 根據權利要求1所述食用香精香料中八種成分同時測定的方法，其特征在于D步驟 中所述的液相色譜分析條件為：色譜柱采用C18,1. 7 μ m，2. 1 X 100mm色譜柱；流動相為甲 醇A和0. 05%甲酸水溶液B ;流速：0. 4mL/min ;進樣量：5 μ L ;柱溫：40°C ;樣品溫度：10°C ; 采用梯度洗脫程序，即初始A是10%，B是90%，lmin時A是35%，B是65%，4min時A是65%， B 是 35%，6min 時初始 A 是 90%，B 是 10%，7min 時 A 是 90%，B 是 10%，8min 時 A 是 10%，B 是 90%，lOmin時A是10%，B是90% ;所述的質譜條件為采用電噴霧離子源（ESI)正離子模式， 掃描方式為多反應監測模式，電噴霧電壓為5500V，離子源溫度600°C，氣簾氣：25Psi，霧化 氣：55Psi，輔助加熱氣：50Psi，硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基苯脲、鄰氨基苯甲酸肉桂 酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A、山梨酸和水楊酸-d4的定量離子對分別為：m/z 60. 0, 109. 1 ,127. 1, 108. 0, 117. 1, 193. 2, 265. 1, 95. 1,97. 1〇
8. 根據權利要求1所述食用香精香料中八種成分同時測定的方法，其特征在于E步驟 中所述含量的計算是：首先以標準溶液所檢測出的目標物和內標物的色譜峰面積比對應其 相應濃度比進行回歸分析得到標準曲線線性方程，然后將樣品溶液檢出的目標物的色譜峰 面積，代入標準曲線線性方程，即得到樣品中硫脲、芝麻酚、脫氫乙酸、對乙氧基苯脲、鄰氨 基苯甲酸肉桂酯、正二氫愈創酸、馬兜鈴酸A、山梨酸的含量。
【文檔編號】G01N30/88GK104090059SQ201410362516
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】王素娟, 繆明明, 秦云華, 張承明, 夏建軍, 李勁竹, 王嵐, 蔣次清, 曹紅云, 吳億勤, 羅林 申請人:云南中煙工業有限責任公司