Uhplc-cad技術同時測定血清中6種鎮靜催眠類藥物含量的方法
【專利摘要】本發明涉及UHPLC-CAD聯用技術同時測定血清中6種鎮靜催眠類藥物含量的方法，所述的6種鎮靜催眠類藥物為地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、取酒石酸唑吡坦其特征在于該方法包括以下的步驟：1）對照品的配制、2）內標溶液的配制、3）樣品溶液制備、4）流動相溶液的配制、5）色譜條件的設置、6）電噴霧檢測器條件的優化、7）樣品測定、8）梯度濃度對照品溶液的配制、9）標準曲線制備、?10）數據分析計算。本發明的方法先進，臨床應用前景及作用良好，能夠為臨床合理用藥，提高藥物療效、減低毒副作用及藥物費用，發揮積極的作用。
【專利說明】UHPLC-CAD技術同時測定血清中6種鎮靜催眠類藥物含量的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種屬于藥物領域，尤其涉及一種采用高效液相-電噴霧檢測聯用技術，同時測定血清中6種鎮靜催眠類藥物的檢測方法。

【背景技術】
[0002]現代社會生活由于工作競爭激烈，生活節奏緊張，外界各種刺激因素影響著人們的情緒，產生失眠、緊張，進而發展為焦慮、抑郁等各種心理和生理問題，給家庭和社會都造成巨大的壓力。國外的一項調查顯示50%-60%的成年人患有不同程度的睡眠障礙，我國失眠的發病率高達40%。巴比妥類藥物作為第I代鎮靜催眠藥，由于有抑制呼吸等不良反應，近年來已基本被其他有關藥物所取代。目前臨床上常用的鎮靜、催眠和抗焦慮藥物為苯二氮卓類藥物(第2代鎮靜催眠藥物)，以及新一代的非苯二氮卓類藥物(第3代鎮靜催眠藥物)，均可引起中樞神經系統不同部位的抑制，隨著用量的加大，臨床表現可自輕度的鎮靜到催眠甚至昏迷。苯二氮卓類藥物中代表藥物主要有地西泮、阿普唑侖、勞拉西泮等，其主要作用機制為通過與中樞神經系統內主要的抑制性受體GABAa( Y -氨基丁酸A)受體復合體中的Y -亞單位結合，活化GABAa受體，促進GABA ( Y -氨基丁酸)與GABAa受體的結合，使Cl—通道開放頻率增加，誘導更多的Cl—內流，加強GABA對神經系統的效應。第3代非苯二氮卓類藥物中代表藥物主要有酒石酸唑吡坦、扎來普隆、佐匹克隆等，其中酒石酸唑吡坦的作用機制為選擇性地作用于苯二氮卓集合位點的BZ1 ( ω P亞型，增進GABA對GABAa受體親和性，導致Cl—通道開放。上述藥物通常用于睡眠障礙的治療，但在重度抑郁癥，文化相關精神障礙，強迫癥以及精神分裂癥等精神疾病的對癥治療中也有廣泛應用，與抗抑郁藥物、抗精神分裂藥物以及其他精神類藥物聯合應用，對緩解躁狂、焦慮、妄想等精神癥狀療效確切，顯著提高綜合療效。
[0003]然而，臨床上鎮靜催眠類藥物往往按藥物半衰期連續給藥或根據臨床醫生經驗給藥，由于患者病情程度不同以及個體差異，藥物的開始起效時間和在體內達到穩態的時間差異較大，常導致藥物的過量使用。再者，由于此類患者的特殊性，依從性較差，藥物使用中時常出現頓服過量或自行減藥等現象，直接影響治療效果，并且易導致戒斷綜合征，甚至可能出現嚴重的并發癥。因此鎮靜催眠類藥物的合理使用是與臨床療效及病人安全密切相關的關鍵因素，若能做到血藥濃度的快速檢測，并進行實時監測，治療時即可根據患者個體特點調給藥方案，則可能采用最小有效劑量，達到發揮療效的目的，避免精神藥物的過量使用。
[0004]目前對于鎮靜催眠類藥物的含量方法主要有高效液相色譜-紫外檢測器(HPLC-UV)、高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)、氣相色譜(GC)、質譜(MS)等分析方法。GC以及GC-MS對檢測低沸點樣品具有優勢，對苯二氮卓類藥物的檢測并非最佳，且儀器價格昂貴，維護成本高，普及程度不夠，推廣性較差；HPLC-UV及HPLC-DAD作為檢測手段的文獻，多采用不同檢測波長，分別進行分析檢測，對于同時服用兩種或兩種以上的鎮靜催眠類藥物的患者，無法提供一測多評的圖譜信息。
[0005]電噴霧檢測器(CAD)是目前通用的檢測器，與HPLC聯用時，HPLC洗脫液經霧化器中氮氣的作用而霧化，其中較大的液滴在碰撞器的作用下經廢液管流出，較小的溶質(分析物)液滴在室溫下干燥，形成溶質顆粒。同時，用于載氣的氮氣分流形成的第二股氮氣流經過電暈式裝置(含高壓鉬金絲電極)形成帶正電荷的氮氣顆粒，與溶質顆粒反向相遇時經碰撞使溶質顆粒帶上正電。它不依賴于分析物的結構，也不需要將分析物電離，只要該物質屬于半揮發性或非揮發性化合物就可以被檢出，且靈敏度可以達到Pg級別，重現性良好，是紫外(UV)、質譜(MS)、示差折光(RI)與蒸發光散射(ELSD)等常用檢測器的有力補充。本項目采用UHPLC-CAD的檢測技術，分析壓力較常規液相有所增大，使分析時間明顯縮短，提高了分析效率；同時檢測器既能克服DAD檢測器對于痕量成分檢測時響應值較低的劣勢，又能解決不同紫外吸收波長的藥物無法一次性檢測的問題，獲得低檢測限的含量測定結果，實現多種該類藥物一次性、快速的測定，且該項技術相較于GC、HPLC-MS等分析技術，操作簡便，維護及使用成本較低。
[0006]因此，本發明建立的針對多種鎮靜催眠類藥物的檢測，分析時間短、靈敏度高，重現性好，能實現一測多評的檢測方法，能夠為臨床藥物濃度檢測提供檢測方法，達到提高藥物使用效率，降低毒副反應的目的。經文獻檢索，目前采用UHPLC-CAD方法測定血清中6種鎮靜催眠類藥物(包含2代及3代藥物)含量的方法，以及精神科患者血藥監測應用，未見文獻報道及專利公開。


【發明內容】

[0007]本發明的目的是建立一種同時測定血清中6種苯二氮卓類藥物含量的檢測方法，為臨床藥物濃度監測提供方案。
[0008]為了實現上述目的，本發明建立了一種應用高液相色譜-電噴霧檢測器聯用技術(UHPLC-CAD),同時測定血清6種苯二氮卓類藥物含量的方法，該方法包括以下的步驟:
1)對照品的配制
精密稱取地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西對照品，分別置于容量瓶中，加入乙腈溶解，配成所需質量濃度的對照品溶液，備用，精密稱取酒石酸唑吡坦對照品，置于容量瓶中，加入純水溶解，配成所需質量濃度的對照品溶液，備用，精密量取6種對照品溶液，配成所需質量濃度的混合對照品溶液，備用；
2)內標溶液的配制
精密稱取秋水仙堿對照品，置于容量瓶中，加入乙腈溶解，配成所需質量濃度的內標溶液，備用；
3)樣品溶液制備
精密量取睡眠障礙患者服藥后血清，置于具塞離心試管中，定量加入步驟2)的秋水仙堿內標溶液，渦旋混勻，高速離心后，分離上清液；上清液中加入至甲醇和水活化后的SPE柱，上樣后用水淋洗，適當濃度的甲醇洗脫，洗脫液揮干，用乙腈溶解，即得樣品溶液，備用；
4)流動相溶液的配制
取一定量的色譜純乙腈，作為流動相A相，備用；取一定量的純水，作為流動相B相，備用；
5)色譜條件的設置
選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規格為4.6 X 250_，填料內徑為5μπι的色譜柱；柱溫為30°C，流動相流速為0.8mL/min ;取步驟I)的對照品溶液與步驟2)的內標溶液，定量進樣，進行梯度洗脫；采用電噴霧檢測器進行色譜峰檢測；
6)電噴霧檢測器條件的優化
選擇電噴霧檢測器，氮氣壓力為35psi，量程ΙΟΟρΑ，霧化溫度30°C ；
取步驟I)對照品溶液、步驟2)的內標溶液，定量進樣，并由此得到對照品及內標物的色譜圖；
7)樣品測定
取步驟3)的樣品溶液，分別定量進樣，在步驟5)與步驟6)的條件下，測定，分別得到地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對照品，秋水仙堿內標物以及樣品的色譜圖，樣品圖譜中，與地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對照品以及秋水仙堿內標物相同保留時間處，為血清樣品中的待測地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦，以及定量加入的秋水仙堿內標物；
8)梯度濃度對照品溶液的配制
精密吸取步驟I)的地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對照品溶液，配制成混合對照品溶液，加乙腈，稀釋成梯度濃度的混合對照品溶液，備用；
9)標準曲線制備
取睡眠障礙的患者空白組織液多份，分別定量加入步驟8)的梯度濃度混合對照品溶液，按照步驟3)方法操作，得到梯度加標樣品溶液，在步驟7)的條件下進行測定；以地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦峰面積與內標物峰面積的比值對地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦峰的濃度進行線性回歸，得到回歸方程，地西泮的標準曲線:y = 0.0635x-0.5842 (r=0.9940)，勞拉西泮的標準曲線:y=0.0758x- 0.5796 (r=0.9968)，阿普唑侖的標準曲線:y =0.0813χ_0.6502(r=0.9946)，艾司唑侖的標準曲線:y=0.0666χ-0.5455 (r=0.9939)，氯硝西泮的標準曲線:y= 0.0622x-0.4402 (r=0.9972)，酒石酸唑吡坦的標準曲線:y=0.1428x_0.6019(r=0.9963)。其中y為被測物峰面積與內標物峰面積的比值，x為被測物質量濃度；
10)數據分析計算
記錄地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦和秋水仙堿的峰面積，計算6種藥物與內標秋水仙堿峰面積的比值，分別代入各自的標準曲線，計算出6種藥物的質量濃度；即為血清中藥物的濃度。
[0009]作為進一步改進,上述的步驟5)中流動相梯度洗脫程序如下:0-7.0Omin, 45%A相和 55%B 相；7.01min-15.0Omin，70%A 相和 30%B 相；15.01min-20.0Omin，45%A 相和 55%B 相。
[0010]作為進一步改進，上述的步驟8)定量稀釋成濃度梯度為183.16 μ g/mL、91.58 μ g/mL、45.79 μ g/mL、18.32 μ g/mL、9.16 μ g/mL、1.83 μ g/mL 的地西泮對照品溶液，177.44 μ g/mL、88.72 μ g/mL、44.36 μ g/mL、17.74 μ g/mL、8.72 μ g/mL、1.77 μ g/mL 的艾司唑侖對照品溶液，173.56 μ g/mL,86.78 μ g/mL,43.39 μ g/mL、17.36 μ g/mL,8.68 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的勞拉西泮對照品溶液，190.04 μ g/mL,95.02 μ g/mL,47.51 μ g/mL、19.0O μ g/mL,9.52 μ g/mL、L 81 μ g/mL 的氯硝西泮對照品溶液，174.40 μ g/mL,87.20 μ g/mL、43.60 μ g/mL、17.44 μ g/mL,8.72 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的阿普唑侖對照品溶液，以及100.00 μ g/mL、50.00 μ g/mL、25.00 μ g/mL、10.00 μ g/mL、5.00 μ g/mL、1.00 μ g/mL 的酒石酸唑吡坦對照品溶液。
[0011]作為進一步改進，上述的步驟9)中取LOmL睡眠障礙的患者空白血清6份，編號I?6號，I號加入183.16 μ g/mL地西泮，177.44 μ g/mL艾司唑侖，173.56 μ g/mL勞拉西泮，190.04 μ g/mL氯硝西泮，190.04 μ g/mL阿普唑侖，100.00 μ g/mL酒石酸唑卩比坦對照品溶液各10 μ L ;2號加入91.58 μ g/mL, 88.72 μ g/mL艾司唑侖，86.78 μ g/mL勞拉西泮，95.02 μ g/mL氯硝西泮，87.20 μ g/mL阿普唑侖，50.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對照品溶液各10 μ L ; 3號加入45.79 μ g/mL地西泮，44.36 μ g/mL艾司唑侖，43.39 μ g/mL勞拉西泮，47.51 μ g/mL氯硝西泮，43.60 μ g/mL阿普唑侖，25.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對照品溶液各10 μ L ;4號加入18.32 μ g/mL地西泮，17.74 μ g/mL艾司唑侖，17.74 μ g/mL勞拉西泮，19.00 μ g/mL氯硝西泮，17.44 μ g/mL阿普唑侖，10.00 μ g/mL酒石酸唑卩比坦對照品溶液各1yL; 5號加入9.16 μ g/mL地西泮，8.72 μ g/mL艾司唑侖，8.68 μ g/mL勞拉西泮，9.52 μ g/mL氯硝西泮，8.72 μ g/mL阿普唑侖，8.72 μ g/mL酒石酸唑吡坦對照品溶液各1yL; 6號加入1.83 μ g/mL地西泮，1.77 μ g/mL艾司唑侖，1.74 μ g/mL勞拉西泮，1.81 μ g/mL氯硝西泮，1.74 μ g/mL阿普唑侖，1.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對照品溶液各10 μ L0
[0012]本發明由于采用了上述的技術方案及步驟，具有以下的特點:
1、方法先進性
UHPLC-CAD聯用技術是目前國內較先進的分析檢測手段，與傳統的液相色譜-紫外檢測器聯用、氣相色譜、光譜分析方法比，分析時間較常規液相顯著縮短，同時由于采用通用檢測器，實現了不同種類、不同波長的藥物的同時測定，具有一測多評的優越性。本發明首次采用該技術同時測定睡眠障礙患者血液中地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦的含量，方法先進可行，能夠為該聯用技術開展多組分化合物的同時定量測定應用提供實驗依據。
[0013]2、臨床應用前景及作用良好
藥物濃度檢測作為臨床安全、合理用藥的重要手段，能夠提供體內藥物濃度數據。本方法建立的方法能夠為地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦的藥物濃度監測提供切實可行的方法，臨床應用前景良好，能夠為臨床合理用藥，提高藥物療效、減低毒副作用及藥物費用，發揮積極的作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為混合對照品色譜圖。
[0015]圖2為內標物秋水仙堿色譜圖。
[0016]圖3為臨床樣品色譜圖。
[0017]圖4為地西泮標準曲線圖。
[0018]圖5為勞拉西泮標準曲線圖。
[0019]圖6為氯硝西泮標準曲線圖。
[0020]圖7為艾司唑侖標準曲線圖。
[0021 ] 圖8為阿普唑侖標準曲線圖。
[0022]圖9為酒石酸唑吡坦標準曲線圖。

【具體實施方式】
[0023]下面對本發明的【具體實施方式】做一個詳細的說明。
[0024]UHPLC-CAD聯用技術同時測定血清中6種鎮靜催眠類藥物含量的方法，該方法包括以下的步驟:
I)對照品的配制
精密稱取地西泮對照品45.79mg、勞拉西泮對照品43.39mg、氯硝西泮對照品47.51mg、艾司唑侖對照品44.36mg、阿普唑侖對照品43.60mg,酒石酸唑吡坦對照品25.00 mg分別置于10mL容量瓶中，加入乙腈溶解，分別定量配成質量濃度為0.4579mg/mL的地西泮對照品溶液、0.4339mg/mL的勞拉西泮對照品溶液、0.475 lmg/mL的氯硝西泮對照品溶液、
0.4436mg/mL的艾司唑侖對照品溶液、0.4360mg/mL的阿普唑侖對照品溶液和0.2500mg/mL的酒石酸唑吡坦對照品溶液，備用。
[0025]2)內標溶液的配制
精密稱取秋水仙堿對照品13.37mg，置于1mL容量瓶中，加入乙腈溶解，精密吸取上述溶液2ml，置于1mL容量瓶中，加入乙腈溶解，配成質量濃度為26.74 μ g/mL的秋水仙堿內標溶液，備用。
[0026]3)樣品溶液制備
經醫院倫理委員審核同意，經患者知情告知后，文化相關精神障礙(幻聽幻想、被害妄想)患者服用勞拉西泮后，取血3mL，分離得到血清，精密量取血清1.0mL，置于具塞離心試管中，定量加入步驟2)的秋水仙堿內標溶液25uL，渦旋混勻，13000r/min高速離心15min后，取上清液60 uL過SPE柱；SPE柱首先用甲醇3mL和水3mL活化SPE柱，活化時控制流速3-5min/mL,上樣后用ImL的水淋洗,再用80%甲醇ImL洗脫,洗脫時控制流速l-2mL/min,洗脫下來的溶液，水浴揮干溶劑，用50 μ L乙腈溶解，即得樣品溶液，備用。
[0027]4)流動相溶液的配制
精密量取色譜純乙腈，作為流動相A相，備用；精密量取純水，作為流動相B相，備用。
[0028]5)色譜條件的設置
選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規格為4.6X250mm，填料內徑為5.0 μ m的色譜柱；柱溫為30°C，流動相流速為0.8mL/min ;取步驟I)的對照品溶液與步驟2)的內標溶液，進樣10yL，優化的流動相梯度洗脫程序:0-7.00min，45%A相和55%B相；
7.01min-15.0Omin，70%A 相和 30%B 相；15.01min-20.0Omin，45%A 相和 55%B 相，進行梯度洗脫；采用電噴霧檢測器進行色譜峰檢測。
[0029]6)電噴霧檢測器條件的優化
選擇電噴霧檢測器，氮氣壓力為35psi，量程ΙΟΟρΑ，霧化溫度30°C ；
取步驟I)對照品溶液、步驟2)的內標溶液，分別進樣10 μ L，由此得到對照品及內標物的標準色譜圖。
[0030]7)樣品測定取步驟3)的樣品溶液，分別進樣20 μ L，在步驟5)的色譜條件與步驟6)的檢測條件下，測定，分別得到地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦混合對照品、秋水仙堿內標物以及樣品的色譜圖，樣品色譜中，與地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對照品以及秋水仙堿內標物相同保留時間處，為血清樣品中的待測藥物，以及定量加入的秋水仙堿內標物；且各物質色譜圖與對照品色譜圖一致。[0031 ] 8)梯度濃度對照品溶液的配制
各精密吸取步驟I)的混合對照品溶液，置于容量瓶中，加乙腈，定量稀釋成為濃度梯度為 183.16 μ g/mL、91.58 μ g/mL、45.79 μ g/mL、18.32 μ g/mL、9.16 μ g/mL、1.83 μ g/mL 的地西泮對照品溶液，177.44 μ g/mL,88.72 μ g/mL,44.36 μ g/mL、17.74 μ g/mL,8.72 μ g/mL、1.77 μ g/mL 的艾司唑侖對照品溶液，173.56 μ g/mL,86.78 μ g/mL,43.39 μ g/mL、17.36 μ g/mL、8.68 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的勞拉西泮對照品溶液，190.04 μ g/mL、95.02 μ g/mL、47.51 μ g/mL、19.00 μ g/mL、9.52 μ g/mL、1.81 μ g/mL 的氯硝西泮對照品溶液，174.40 μ g/mL、87.20 μ g/mL,43.60 μ g/mL、17.44 μ g/mL,8.72 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的阿普唑侖對照品溶液，以及 100.00 μ g/mL、50.00 μ g/mL、25.00 μ g/mL、10.00 μ g/mL、5.00 μ g/mL、1.00 μ g/mL的酒石酸唑吡坦對照品溶液，備用。
[0032]9)標準曲線制備
經醫院倫理委員審核同意，經患者知情告知后，取1.0mL睡眠障礙患者的空白血清，分為6份，編號I?6號，I號加入183.16 μ g/mL地西泮，177.44 μ g/mL艾司唑侖，173.56 μ g/mL勞拉西泮，190.04 μ g/mL氯硝西泮，190.04 μ g/mL阿普唑侖，100.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對照品溶液各10 μ L ;2號加入91.58 μ g/mL, 88.72 μ g/mL艾司唑侖，86.78 μ g/mL勞拉西泮，95.02 μ g/mL氯硝西泮,87.20 μ g/mL阿普唑侖,50.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對照品溶液各10 μ L ; 3號加入45.79 μ g/mL地西泮，44.36 μ g/mL艾司唑侖，43.39 μ g/mL勞拉西泮，47.51 μ g/mL氯硝西泮,43.60 μ g/mL阿普唑侖,25.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對照品溶液各10 μ L ;4號加入18.32 μ g/mL地西泮，17.74 μ g/mL艾司唑侖，17.74 μ g/mL勞拉西泮，19.00 μ g/mL氯硝西泮，17.44 μ g/mL阿普唑侖，10.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對照品溶液各1yL; 5號加入9.16 μ g/mL地西泮，8.72 μ g/mL艾司唑侖，8.68 μ g/mL勞拉西泮，9.52 μ g/mL氯硝西泮，8.72 μ g/mL阿普唑侖，8.72 μ g/mL酒石酸唑吡坦對照品溶液各1yL; 6號加入1.83μ g/mL地西泮，1.77μ g/mL艾司唑侖，1.74μ g/mL勞拉西泮，
1.81 μ g/mL氯硝西泮，1.74 μ g/mL阿普唑侖，1.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對照品溶液各1uL0按照步驟3)方法操作，得到梯度加標樣品溶液；在步驟7)的條件下進行測定。以6種藥物各自峰面積與內標物峰面積的比值對萬古霉素濃度進行線性回歸，得到回歸方程，地西泮的標準曲線:y = 0.0635x-0.5842 (r=0.9940)，勞拉西泮的標準曲線:y=0.0758χ-
0.5796 (r=0.9968)，阿普唑侖的標準曲線:y =0.0813x_0.6502 (r=0.9946)，艾司唑侖的標準曲線:y=0.0666x-0.5455 (r=0.9939)，氯硝西泮的標準曲線:y= 0.0622χ_0.4402(r=0.9972)，酒石酸唑吡坦的標準曲線:y=0.1428χ-0.6019 (r=0.9963)。其中y為被測物峰面積與內標物峰面積的比值，X為被測物質量濃度。
[0033]10)數據分析計算
記錄患者血清中勞拉西泮和秋水仙堿的峰面積，計算藥物與內標秋水仙堿峰面積的比值，代入勞拉西泮的標準曲線，計算出藥物的質量濃度，即為血清中的藥物濃度。結果見表I。
[0034]表1.臨床文化相關精神疾病患者服用勞拉西泮后血藥濃度表
羅號|取血時間I血清藥物濃度(ng/mL)

12014.07.0122:0014.33

22014.07.0206:0072.43

32014.07.0222:0093.79
4|2Q14.07.1106:00+53.38■
【權利要求】
1.UHPLC-CAD聯用技術同時測定血清中6種鎮靜催眠類藥物含量的方法，所述的6種鎮靜催眠類藥物為地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、取酒石酸唑吡坦其特征在于該方法包括以下的步驟: . 1)對照品的配制 精密稱取地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、取酒石酸唑吡坦對照品，分別置于容量瓶中，加入乙腈溶解，配成所需質量濃度的對照品溶液，備用，精密量取6種對照品溶液，配成所需質量濃度的混合對照品溶液，備用； .2)內標溶液的配制 精密稱取秋水仙堿對照品，置于容量瓶中，加入乙腈溶解,配成所需質量濃度的內標溶液，備用； .3)樣品溶液制備 按照睡眠障礙診斷標準，入選患者，臨床醫生根據癥狀給予I種或數種鎮靜催眠藥物進行治療，患者服藥后定時取血，分離血清，置于具塞離心試管中，定量加入步驟2)的秋水仙堿內標溶液，渦旋混勻，高速離心后，分離上清液；上清液中加入至甲醇和水活化后的SPE柱，上樣后用水淋洗，適當濃度的甲醇洗脫，洗脫液揮干，用乙腈溶解，即得樣品溶液，備用； .4)流動相溶液的配制 取色譜純乙腈，作為流動相A相，備用；取純水，作為流動相B相，備用； .5)色譜條件的設置 選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規格為4.6X250mm，填料內徑為5.0 μ m的色譜柱；柱溫為30°C，流動相流速為0.8mL/min ;取步驟I)的對照品溶液與步驟2)的內標溶液，定量進樣，進行梯度洗脫；采用電噴霧檢測器進行色譜峰檢測； .6)電噴霧檢測器條件優化 選擇電噴霧檢測器，氮氣壓力為35psi，量程ΙΟΟρΑ，霧化溫度30°C ； 取步驟I)對照品溶液、步驟2)的內標溶液，定量進樣，由此得到對照品及內標物的標準色譜圖； .7)樣品測定 取步驟3)的樣品溶液，分別定量進樣，在步驟5)與步驟6)的條件下，測定，分別得到地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對照品，秋水仙堿內標物以及樣品的色譜圖，樣品圖譜中，與地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對照品以及秋水仙堿內標物相同保留時間處，為血清樣品中的待測地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦，以及定量加入的秋水仙堿內標物； .8)梯度濃度對照品溶液的配制 精密吸取步驟I)的地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對照品溶液，配制成混合對照品溶液，加乙腈，稀釋成梯度濃度的混合對照品溶液，備用； .9)標準曲線制備 取睡眠障礙的患者空白血清多份，分別定量加入步驟8)的梯度濃度混合對照品溶液，按照步驟3)方法操作，得到梯度加標樣品溶液，在步驟7)的條件下進行測定；以地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦峰面積與內標物峰面積的比值對地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦峰的濃度進行線性回歸，得到回歸方程，地西泮的標準曲線:y = 0.0635x-0.5842 (r=0.9940)，勞拉西泮的標準曲線:y=0.0758x- 0.5796 (r=0.9968)，阿普唑侖的標準曲線:y =0.0813χ_0.6502(r=0.9946)，艾司唑侖的標準曲線:y=0.0666χ-0.5455 (r=0.9939)，氯硝西泮的標準曲線:y= 0.0622x-0.4402 (r=0.9972)，酒石酸唑吡坦的標準曲線:y=0.1428x_0.6019(r=0.9963);其中y為被測物峰面積與內標物峰面積的比值，x為被測物質量濃度； .10)數據分析計算 記錄地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦和秋水仙堿的峰面積，計算6種藥物與內標秋水仙堿峰面積的比值，分別代入各自的標準曲線，計算出6種藥物的質量濃度；即為血清中藥物的濃度。
2.根據權利要求1所述的UHPLC-CAD技術同時測定血清中6種鎮靜催眠類藥物含量的方法，其特征在于步驟5)的梯度洗脫程序如下:0-7.00min，45%A相和55%B相；.7.01min-15.0Omin, 70%A 相和 30%B 相；15.01min-20.0Omin, 45%A 相和 55%B 相。
3.根據權利要求1所述的UHPLC-CAD技術同時測定血清中6種鎮靜催眠類藥物含量的方法，其特征在于步驟6)的電噴霧檢測器條件如下:氮氣壓力為35psi，量程ΙΟΟρΑ，霧化溫度 30。。。
4.根據權利要求1所述的UHPLC-CAD技術同時測定血清中6種鎮靜催眠類藥物含量的方法，其特征在于步驟8)定量稀釋成濃度梯度為183.16yg/mL,91.58yg/mL,.45.79 μ g/mL、18.32 μ g/mL,9.16 μ g/mL、1.83 μ g/mL 的地西泮對照品溶液，177.44 μ g/mL、.88.72 μ g/mL,44.36 μ g/mL、17.74 μ g/mL,8.72 μ g/mL、1.77 μ g/mL 的艾司唑侖對照品溶液，173.56 μ g/mL、86.78 μ g/mL、43.39 μ g/mL、17.36 μ g/mL、8.68 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的勞拉西泮對照品溶液，190.04 μ g/mL、95.02 μ g/mL、47.51 μ g/mL、19.00 μ g/mL、9.52 μ g/mL、.1.81 μ g/mL 的氯硝西泮對照品溶液，174.40 μ g/mL,87.20 μ g/mL,43.60 μ g/mL、17.44 μ g/mL、8.72 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的阿普唑侖對照品溶液，以及 100.00 μ g/mL,50.00 μ g/mL、.25.00 μ g/mL、10.00 μ g/mL、5.00 μ g/mL、1.00 μ g/mL 的酒石酸唑批坦對照品溶液。
5.根據權利要求1所述的UHPLC-CAD技術同時測定血清中6種鎮靜催眠類藥物含量的方法，其特征在于步驟9)中取1.0mL睡眠障礙的患者空白血清6份，編號I?6號，I號加入 183.16 μ g/mL 地西泮，177.44 μ g/mL 艾司唑侖，173.56 μ g/mL 勞拉西泮，190.04 μ g/mL氯硝西泮，190.04 μ g/mL阿普唑侖，100.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對照品溶液各10 μ L ；.2號加入 91.58 μ g/mL, 88.72 μ g/mL 艾司唑侖，86.78 μ g/mL 勞拉西泮，95.02 μ g/mL 氯硝西泮，87.20 μ g/mL阿普唑侖，50.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對照品溶液各1yL; 3號加入 45.79 μ g/mL 地西泮，44.36 μ g/mL 艾司唑侖，43.39 μ g/mL 勞拉西泮，47.51 μ g/mL 氯硝西泮，43.60 μ g/mL阿普唑侖，25.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對照品溶液各10 μ L ;4號加入 18.32 μ g/mL 地西泮，17.74 μ g/mL 艾司唑侖，17.74 μ g/mL 勞拉西泮，19.00 μ g/mL 氯硝西泮，17.44 μ g/mL阿普唑侖，10.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對照品溶液各10 μ L ; 5號加入.9.16 μ g/mL地西泮，8.72 μ g/mL艾司唑侖，8.68 μ g/mL勞拉西泮，9.52 μ g/mL氯硝西泮，.8.72 μ g/mL阿普唑侖，8.72 μ g/mL酒石酸唑吡坦對照品溶液各10 μ L ; 6號加入1.83 μ g/mL地西泮，1.77 μ g/mL艾司唑侖，1.74 μ g/mL勞拉西泮，1.81 μ g/mL氯硝西泮，1.74 μ g/mL阿普唑侖，1.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對照品溶液各10 μ L0
【文檔編號】G01N30/88GK104133030SQ201410362714
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】張揚, 陳炯, 壽旦, 馬永春 申請人:浙江省中醫藥研究院