薄層色譜法半定量測定氨基甲酸乙酯的方法
【專利摘要】本發明提供薄層色譜法半定量測定氨基甲酸乙酯的方法。該法以肉桂醛、磷酸混合液做熒光衍生劑，以甲基叔丁基醚、石油醚、甲醇混合液為流動相展開劑，薄層色譜板為固定相，經薄層展開的氨基甲酸乙酯與熒光衍生劑反應后，結果可在普通紫外分析儀365nm,Rf值為0.85處觀察到綠色熒光點，薄層板的最低載藥量為50ng的氨基甲酸乙酯。如果按照酒中氨基甲酸乙酯5mg/L的限定標準，則本發明可以直接檢測出2.5mg/L的EC，薄層板的點樣量一般最大為20μL，方法所需樣品少，快速，靈敏度高，步驟簡單，所需設備少，且易于操作。可依據該法原理，研發出一種速測試劑盒，用于酒精飲料及發酵食品中氨基甲酸乙酯的快速檢測。
【專利說明】薄層色譜法半定量測定氨基甲酸乙酯的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測氨基甲酸乙酯含量的方法，具體涉及薄層色譜法半定量測定 氨基甲酸乙酯含量的方法。

【背景技術】
[0002] 氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate,簡稱EC)是一種具有潛在致癌作用的化合物， 可導致肝癌、皮膚癌、肺癌和淋巴癌等疾病，是發酵食品和酒精飲料的伴隨產物。EC早在 1943 年就被證實為致癌物質。1976 年，0ugh(0ugh C S. Ethyl carbamate in fermented beverages and foods. II . Possible formation of ethyl carbamate from diethyl dicarbonate additionto wine [J]· Agric FoodChem, 1976，24(2): 328-331.)發現在 酒精飲料中含有EC。研究表明，對嚙齒類動物，EC是一種多位點致癌物，并且乙醇(酒精)對 其致癌性有促進作用。2007年，國際癌癥研究所把EC對人類的致癌毒性由2B組(或可能令 人類患癌的物質）改為2A組(可能令人類患癌的物質)。目前氨基甲酸乙酯的污染，被認為 是食品中繼黃曲霉毒素之后的又一重要問題，我國尚未制定酒精飲料和發酵食品中氨基甲 酸乙酯的限量標準。
[0003] 自發酵酒精飲料中發現EC以來，國內外都致力于簡便、快速、準確的EC含量檢測 方法研究，樣品的前處理方法及檢測方法都在不斷改進。目前國內外對酒精飲料中EC的儀 器分析檢測方法有氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜法、液相色譜-質譜法、薄層色 譜法、傅立葉變換紅外光譜法等，其中最常用的是氣相色譜-質譜法。上述檢測方法準確度 高，但存在儀器設備昂貴、前處理方法復雜、人員專業技術要求高、檢測成本高等缺點。因 此，建立簡便、快捷、準確的檢測方法成為了酒精飲料中EC檢測迫切需要解決的重要內容。
[0004] 薄層色譜具有操作簡單、快捷、靈敏度高和準確可靠等特點，廣泛應用于食品營 養，合成藥物和藥物代謝，醫學和臨床，毒物分析和法醫化學，農殘檢測等。對于使用薄 層色譜法檢測氨基甲酸乙酯，國內外報道并不多見。國內的納新力（納新力，陳介華， 代海香.酒中氨基甲酸乙酯的薄層分析[J].衛生研究，1991，20(6):45-46.)運用薄層 色譜法在365nm下直接展開，方法的檢測限為10mg/L，國外的Eugenie Jaryj (Eugenie Jaryj, Klemens Lorenz, Spangenberg B. A Simple Method for the Quantification of Urethane in Spirits [J]. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2008，31: 1969-1976.)使用薄層色譜法，展開后與EC衍生劑反應，結果 可見藍色熒光點。
[0005] 本發明提供一種用于快速檢測氨基甲酸乙酯的方法。該法基于Eugenie Jaryj的 研究，經過改進后可以使用更加廉價的薄層板，經展開后與肉桂醛衍生劑反應，結果可在普 通紫外分析儀365nm，Rf值為0. 85處觀察到綠色熒光點，薄層板的最低載藥量為50ng的 氨基甲酸乙酯。如果按照酒中氨基甲酸乙酯5mg/L的限定標準，則本發明可以直接檢測出 2. 5mg/L的EC (薄層板的點樣量一般最大為20 μ L)，因此本發明能夠快速、簡單、廉價檢測 出至少2. 5mg/L的氨基甲酸乙酯。


【發明內容】

[0006] 本發明提供薄層色譜法半定量測定氨基甲酸乙酯的方法。以肉桂醛、磷酸混合液 做熒光衍生劑，以甲基叔丁基醚、石油醚、甲醇混合液為流動相展開劑，薄層色譜板為固定 相，經薄層展開的氨基甲酸乙酯與熒光衍生劑反應后，在紫外分析儀（365nm處，暗環境）可 肉眼觀察到綠色的氨基甲酸乙酯熒光斑點，Rf值固定； 具體步驟為： (1) 取出薄層硅膠板于105°C ~110°C烘箱內活化半小時，放入干燥器中備用； (2) 配制展開劑，攪拌后倒入雙槽薄層色譜展開缸中，靜置0. 5~1小時，使之飽和； (3) 配制熒光衍生劑溶液：將肉桂醛，丙酮，磷酸混合，攪拌后備用； (4) 在距薄層硅膠板下端lcm處點樣，于同一側面上距薄層硅膠板上端2cm處鉛筆標記 作為展開前沿線，點樣樣品為至少含有50ng的氨基甲酸乙酯待測液； (5) 在薄層展開缸中展開，展開劑到達展開前沿線后取出，晾干； (6) 將晾干后的薄層板浸于熒光衍生劑中后取出，之后再在烘箱反應5 - 20分鐘； (7) 在紫外分析儀于365nm處暗環境條件下觀察薄層板，此時薄層板背景顏色為藍白 色，若在點有氨基甲酸乙酯的展據范圍內有清晰的綠色斑點，此斑點即是氨基甲酸乙酯衍 生后的熒光斑點，若點樣量中含有的氨基甲酸乙酯含量小于50ng時，斑點不可見。
[0007] 上述方法中，所述步驟（1)中，所述薄層硅膠板為青島海洋薄層硅膠板，其規格為 G 或 GF，5cmX 10cm 或 10cmX 10cm。
[0008] 上述方法中，步驟（2)中所述展開劑的組成為甲基叔丁基醚：石油醚(高沸程)和甲 醇，其體積比為甲基叔丁基醚：石油醚(高沸程）：甲醇=(3-6): (3-10): (1-5);優選 甲基叔丁基醚：石油醚(高沸程）：甲醇=(4一6) : (5 - 7) : (2 - 4)。
[0009] 上述方法中，步驟（3)中所述熒光顯色劑用量分別為，肉桂醛20 μ L- lmL，丙酮 10 - 80ml，磷酸0. 1 - 10ml ;優選肉桂醛為60- 200μ L，丙酮為30- 50mL，磷酸為2 - 5ml。
[0010] 上述方法中，步驟（4)中所述樣品中的氨基甲酸乙酯含量在薄層硅膠板上的點樣 量至少為50ng。
[0011] 上述方法中，步驟（6)中所述浸于熒光衍生劑中時間為廣20秒鐘，優選1~3秒鐘； 反應為在烘箱80- 150°C，優選100- 140°C，反應5 - 20分鐘，優選5 -12分鐘。
[0012] 本發明的薄層色譜法與現有技術相比，具有以下優點： (1)本發明不需要用大型儀器即可檢測出至少2. 5mg/L的氨基甲酸乙酯，Rf值為0.85。
[0013] (2)本發明所需樣品少，成本低廉，步驟簡單，反應條件易于控制，所需設備少，易 于操作。
[0014] (3)由于氨基甲酸乙酯極易溶于水和乙醇，薄層層析時斑點非常容易擴散，所以選 用適當的展開劑使斑點處于最佳的觀察位置及減小擴散效應非常重要，本方法選用的展開 劑已嘗試用于加標酒中氨基甲酸乙酯的檢測，結果表明，斑點清晰，肉眼可觀測。

【具體實施方式】
[0015] 下面結合實施例對本發明進一步詳細說明：實施例中述及的Rf值，是薄層展開中 待分析物在特定的固定相和流動相中展開的固定常數，通過與標準品的Rf值比較，即可對 待分離物進行定性分析。在本發明中，展開后需與衍生劑反應，在365nm處觀察，測量。通 過以下公式計算Rf值： _原點到斑點中心的距離 _=原點到溶刑前沿的距離 式中：原點即最初點樣的位置；斑點即薄層展開后的樣品點。
[0016] 實施例1 : (1) 取出薄層硅膠板5cmX 10cm于110°C烘箱內活化半小時，放入干燥器中備用； (2) 配制展開劑（甲基叔丁基醚：石油醚：甲醇=5:7:3 (體積比)，攪拌后倒入雙槽薄層 色譜展開缸中，靜置至少半個小時，使之飽和； (3) 配制熒光衍生劑溶液，肉桂醛160 μ L，丙酮40ml，磷酸2. 4ml于小燒杯中，攪拌后備 用； (4) 取出薄層板，在距薄層板下端lcm處點樣，距薄層板上端2cm處鉛筆標記作為展開 前沿，點樣。第一樣品點為20yL氨基甲酸乙酯標準溶液（5mg/L，40%乙醇水溶液)，在距離 第一個點水平2cm處點第二個點，樣品為20 μ L的氨基甲酸乙酯標準溶液（10mg/L，40%乙 醇水溶液）和尿素溶液（l〇mg/L，40%乙醇水溶液）體積比1:1混合液；氨基甲酸乙酯為純度 99%以上的購自阿拉丁試劑公司。
[0017] (5)在薄層展開缸中展開，展開劑到達劃線前沿后取出，晾干； (6) 將晾干后的薄層板迅速浸于熒光衍生劑中后取出，之后再在烘箱130°C反應10分 鐘； (7) 在紫外分析儀（365nm處，暗環境）觀察薄層板，清晰可見藍白色背景，第一點樣處 上方有綠色熒光點（Rf值為〇. 85)，第二點樣處有綠色熒光點（Rf值為0. 85)和藍色熒光點 (Rf值為0. 26)。即，尿素與氨基甲酸乙酯可經薄層展開得到分離，由于不同組分在同一色 譜條件下因為分子本身極性的不同會遷移到薄層板的不同高度，分別測量原點到斑點中心 的距離，原點到溶劑前沿的距離，根據Rf值計算公式，與標準品的Rf值對比，即可進行定性 分析。
[0018] 實施例2: (1) 取出薄層硅膠板5cmX 10cm于110°C烘箱內活化半小時，放入干燥器中備用； (2) 配制展開劑甲基叔丁基醚：石油醚：甲醇=5:7:3 (體積比)，攪拌后倒入薄層展開缸 中，靜置至少半個小時，使之飽和； (3) 配制熒光衍生劑溶液，肉桂醛160 μ L，丙酮40ml，磷酸2. 4ml于小燒杯中，攪拌后備 用； (4) 取出薄層板，在距薄層板下端lcm處點樣，距薄層板上端2cm處鉛筆標記作為展開 前沿，點樣。第一樣品點為20yL氨基甲酸乙酯標準溶液（5mg/L，40%乙醇水溶液)，在距離 第一個點水平2cm處點第二個點，樣品為20 μ L氨基甲酸乙酯標準溶液（10mg/L，40%乙醇 水溶液)和市售龍方三星白蘭地酒（1:1)混合液；氨基甲酸乙酯為純度99%以上的購自阿拉 丁試劑公司； (5) 在薄層展開缸中展開，展開劑到達劃線前沿后取出，晾干； (6) 將晾干后的薄層板迅速浸于熒光衍生劑中后取出，之后再在烘箱130°C反應10分 鐘； (7)在紫外分析儀（365nm處，暗環境）觀察薄層板，清晰可見藍白色背景，第一點樣處 上方有綠色熒光點（Rf值為〇. 85)，第二點樣處有綠色熒光點（Rf值為0. 85)和經薄層展開 的白蘭地酒。即，白蘭地酒與氨基甲酸乙酯可經薄層展開得到分離，白蘭地酒中的化合物對 EC薄層展開基本沒有影響。
[0019] 本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對本發明 的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出 其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。凡在本發明的 精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明權利要求的保護 范圍之內。
【權利要求】
1. 薄層色譜法半定量測定氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，以肉桂醛、磷酸混合液做 熒光衍生劑，以甲基叔丁基醚、石油醚、甲醇混合液為流動相展開劑，薄層色譜板為固定相， 經薄層展開的氨基甲酸乙酯與熒光衍生劑反應后，在紫外分析儀可肉眼觀察到綠色的氨基 甲酸乙酯熒光斑點，Rf值固定；具體步驟為： (1) 取出薄層硅膠板于105°C ~110°C烘箱內活化半小時，放入干燥器中備用； (2) 配制展開劑，攪拌后倒入雙槽薄層色譜展開缸中，靜置0. 5~1小時，使之飽和； (3) 配制熒光衍生劑溶液：將肉桂醛，丙酮，磷酸混合，攪拌后備用； (4) 在距薄層硅膠板下端lcm處點樣，于同一側面上距薄層硅膠板上端2cm處鉛筆標記 作為展開前沿線，點樣樣品為至少含有50ng的氨基甲酸乙酯待測液； (5) 在薄層展開缸中展開，展開劑到達展開前沿線后取出，晾干； (6) 將晾干后的薄層板浸于熒光衍生劑中后取出，之后再在烘箱反應5 - 20分鐘； (7) 在紫外分析儀于365nm處暗環境條件下觀察薄層板，此時薄層板背景顏色為藍白 色，若在點有氨基甲酸乙酯的展據范圍內有清晰的綠色斑點，此斑點即是氨基甲酸乙酯衍 生后的熒光斑點，若點樣量中含有的氨基甲酸乙酯含量小于50ng時，斑點不可見。
2. 根據權利要求1所述的薄層色譜法半定量測定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，所 述步驟（1)中，所述薄層硅膠板為青島海洋薄層硅膠板，其規格為G或GF，5cmX 10cm或 10cmX 10cm。
3. 根據權利要求1所述的薄層色譜法半定量測定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，步 驟（2)中所述展開劑的組成為甲基叔丁基醚、石油醚(高沸程)和甲醇；其體積比為甲基叔丁 基醚：石油醚(高沸程）：甲醇=(3 - 6): (3 -10): (1 - 5)。
4. 根據權利要求1所述的薄層色譜法半定量測定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，步 驟（2)中所述展開劑的組成為甲基叔丁基醚、石油醚(高沸程)和甲醇；其體積比為甲基叔丁 基醚：石油醚(高沸程）：甲醇==(4一6) :(5 - 7) :(2 - 4)。
5. 根據權利要求1所述的薄層色譜法半定量測定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，步 驟（3)中所述熒光顯色劑用量分別為，肉桂醛20yL - lmL，丙酮10-80ml，磷酸0. 1-10ml。
6. 根據權利要求1所述的薄層色譜法半定量測定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，步 驟（3)中所述熒光顯色劑用量分別為，肉桂醛為60- 200 μ L，丙酮為30- 50mL，磷酸為2- 5ml 〇
7. 根據權利要求1所述的薄層色譜法半定量測定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，步 驟（4)中所述樣品中的氨基甲酸乙酯含量在薄層硅膠板上的點樣量至少為50ng。
8. 根據權利要求1所述的薄層色譜法半定量測定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，步 驟（6)中所述浸于熒光衍生劑中時間為1~20秒鐘，反應為在烘箱80- 150°C反應5 - 20分 鐘。
9. 根據權利要求1所述的薄層色譜法半定量測定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，步 驟（6)中所述浸于熒光衍生劑中時間為1~3秒鐘，反應為在烘箱100- 140°C反應5 -12分 鐘。
【文檔編號】G01N30/90GK104142378SQ201410365881
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】黃惠華, 王浩, 周端, 劉智鈞, 黃秋婷 申請人:華南理工大學