本發明涉及農產質量安全檢測
技術領域：
，具體地說涉及一種谷物中赭曲霉毒素A的檢測方法。
背景技術：
：赭曲霉毒素(ochratoxins)是由曲霉屬和青霉屬等產毒菌株產生的一組結構類似的有毒代謝物質。赭曲霉毒素包括7種結構類似的化合物，其中以赭曲霉毒素A(ochratoxinsA，OTA)毒性最強，分布最廣。赭曲霉毒素A是一種可溶于極性有機溶劑和稀碳酸氫鈉溶液，微溶于水，赭曲霉毒素A的化學名稱為7-(L-β-苯基丙氨基-羰基)-羧基-5-氯代-8-羥基-3,4-二氫化-3R-甲基異氧雜奈鄰酮(香豆素)，分子式為C2OH18ClNO6。動物毒性試驗表明，赭曲霉毒素A具有免疫抑制毒性、神經毒性、致畸性及致癌性。1993年，國際癌癥研究中心已將赭曲霉毒素A列為可能的人類致癌物。因此世界各國均重視對赭曲霉毒素A的檢測和控制，制定了相關的限量標準。我國在2011年最新頒布的國家食品安全標準《食品中真菌毒素限量》規定了谷物及其制品中赭曲霉毒素A的最高限量值為5μg/kg。目前，對于赭曲霉毒素A的分析方法主要包括液相色譜串聯質譜法，高效液相色譜法和酶聯免疫法。國內外對于谷物中赭曲霉毒素A檢測的前處理方法主要是免疫親和柱法，因其選擇性高，特異性強，樣品回收率較高，準確度高，但缺點是成本太高。為評價我國谷物中赭曲霉毒素A的污染情況，當前急需建立一種簡單、快捷、靈敏、成本較低的谷物中赭曲霉毒素A的快速定量檢測方法。技術實現要素：本發明的目的在于：提供一種谷物中赭曲霉毒素A的檢測方法，該方法為：先對樣品進行提取凈化，凈化液經高效液相色譜串聯質譜技術(LC/MS/MS)檢測，最后通過基質標準曲線定量測定樣品中赭曲霉毒素A的含量。該方法適用于檢測小麥和玉米中赭曲霉毒素A。具體的說，本發明的一種谷物赭曲霉毒素A的檢測方法，包括如下步驟：一種谷物中赭曲霉毒素A的液相色譜串聯質譜檢測方法，具體步驟如下：(1)樣品提純將乙腈與水按體積比4:1混合配制成乙腈溶液，按體積質量比(mL/g)5:1加入谷物樣品粉末中，置于搖床中180rpm振蕩30min后，2500rpm離心5min收集上清液；將5mL乙腈溶液通過氨基固相萃取柱(500ng,6mL.安譜公司)，棄淋洗液；取5mL上清液過氨基固相萃取柱，棄過柱液；再取5mL乙腈溶液過柱淋洗兩次，棄淋洗液；將乙腈與甲酸按體積比17:3配制成色譜乙腈-甲酸溶液，取10mL乙腈-甲酸溶液加入氨基固相萃取柱，洗脫富集在柱上的赭曲霉毒素A，收集洗脫液于干凈的玻璃試管中，氮氣吹干；取吹干后的殘渣用甲醇溶解，過0.22μm的濾膜(SCAA-104，上海安譜科學儀器有限公司)，濾液即為樣品提純液；(2)取濃度依次為0.5、1、5、10、20μg/L的赭曲霉毒素A標準溶液，分別進行高效液相色譜串聯質譜檢測，獲得赭曲霉毒素A標準曲線；(1)(3)對步驟(1)獲得的樣品提純液進行高效液相色譜串聯質譜檢測，檢測結果帶入步驟(2)獲得的標準曲線進行比對，以外標法測得樣品中赭曲霉素A的濃度，在依據公式(1)計算樣品中赭曲霉毒素A的含量；式(1)中：X——樣品中赭曲霉素A含量，單位為微克每克，μg/g；C——待測液中赭曲霉素A的濃度，單位為微克每毫升，μg/mL；V——定容體積，單位為毫升，mL；M——樣品稱樣量，單位為克，g。進一步，本發明所述谷物中赭曲霉毒素A的液相色譜串聯質譜檢測方法，所述高效液相色譜串聯質譜檢測具體是指：(1)色譜條件：a)色譜柱：WatersT-3色譜柱(4.6×150mm,5μm)；b)進樣量：2μL；c)柱溫：40℃；d)流速：0.4mL/min；e)流動相和洗脫時間：流動相A：含5mmol/L乙酸銨的水溶液；流動相B：甲醇；采用線性梯度洗脫：90％A，10％B初始，0-3min，A為90％-10％，B為10％-90％，3-5min，A為10％，B為90％；5-7min,，A為10％-90％，B為10％-90％；平衡3min，總共單次樣品運行時間10min；(2)質譜條件：離子化模式為電噴霧電離正離子模式(ESI+)；多反應監測(MRM)；離子源溫度500℃；駐留時間100ms；霧化氣壓50psi；輔助氣壓50psi；噴霧電壓5500V；碰撞室射出電壓6V；赭曲霉毒素A質譜條件參數如表1所示：表1赭曲霉毒素A質譜條件參數注*：定量離子。進一步，如本發明所述谷物中赭曲霉毒素A的液相色譜串聯質譜檢測方法中，所述谷物為小麥或玉米。進一步，如本發明所述谷物中赭曲霉毒素A的液相色譜串聯質譜檢測方法中，所述谷物樣品粉末是指過0.5mm孔篩后的谷物樣品粉末。本發明的一種谷物中赭曲霉素A的檢測方法可應用于小麥和玉米等谷物中赭曲霉素A的提取、凈化和檢測。與其他檢測方法相比具有簡單、快捷、靈敏準確的特點，可適用于大批量樣品的檢測。同時本發明解決了傳統的赭曲霉素A采用免疫親和柱檢測成本高的問題。本方法的建立使小麥和玉米等谷物中赭曲霉素A的含量得以準確測定，能為農產品質量安全風險評估提供準確的分析方法。附圖說明圖1為小麥、玉米空白樣品離子色譜圖。圖2為濃度為2g/L的OTA標準品離子色譜圖。圖3為小麥空白基質標準曲線。圖4為玉米空白基質標準曲線。圖5為OTA樣品色譜圖。具體實施方式實施例中所用的高效液相色譜串聯質譜為日本島津20ADXR液相色譜系統串聯美國AB3500質譜。實施例1建立標準曲線(1)按GB/T25220-2010的方法對從市場購買的小麥樣品和玉米樣品進行檢測，取OTA未檢出的小麥和玉米(如圖1所示，其中圖1A為小麥空白樣品，圖1B為玉米空白樣品)作為空白樣品；將乙腈與水按體積比4:1混合配制成乙腈溶液，按體積質量比(mL/g)5:1分別加入空白樣品粉末(磨碎過0.5mm孔篩)中，搖床180rpm振蕩30min后，2500rpm離心5min收集上清液；將5mL乙腈溶液通過氨基固相萃取柱(500ng,6mL.安譜公司)，棄淋洗液；取5mL上清液過氨基固相萃取柱，棄過柱液；再取5mL乙腈溶液過柱淋洗兩次，棄淋洗液；將乙腈與甲酸按體積比17:3配制成色譜乙腈-甲酸溶液，取10mL乙腈-甲酸溶液加入氨基固相萃取柱，洗脫富集在柱上的赭曲霉毒素A，收集洗脫液于干凈的玻璃試管中，氮氣吹干；取吹干后的殘渣用甲醇溶解，過0.22μm的濾膜(SCAA-104，上海安譜科學儀器有限公司)，濾液即為樣品提純液(空白基質)；(2)取2g/L赭曲霉素A標準母液(OTA標準品離子色譜圖如圖2所示)置于棕色小瓶中，用乙腈稀釋成濃度為50μg/L的標準儲備液；分別用步驟(1)中的空白小麥和玉米基質稀釋上述標準儲備液，分別配成0.5、1、5、10、20μg/L的赭曲霉毒素A標準溶液，再分別進行高效液相色譜串聯質譜檢測獲得標準曲線，小麥和玉米的空白基質標準曲線分別如圖3、4所示。具體高效液相色譜串聯質譜檢測方法為：進樣量2μL，柱溫40℃。高效液相色譜分離的條件為：色譜柱為WatersT-3色譜柱(4.6×150mm,5μm)，流動相：A為水(含5mmol/L乙酸銨)，B為甲醇，采用線性梯度洗脫：洗脫時間：90％A，10％B初始，0-3min，A為90％-10％，B為10％-90％，3-5min，A為10％，B為90％；5-7min,，A為10％-90％，B為10％-90％；平衡3min，總共單次樣品運行時間10min。串聯質譜檢測條件為：電噴霧電離正離子模式(ESI+)；多反應監測(MRM)；離子源溫度500℃；駐留時間100ms；霧化氣壓50psi；輔助氣壓50psi；噴霧電壓5500V；碰撞室射出電壓6V；赭曲霉毒素A質譜條件參數如表1所示：表1赭曲霉毒素A質譜條件參數注*：定量離子。赭曲霉毒素A線性方程、檢出限和定量限如表2所示:表2赭曲霉毒素A線性方程、檢出限和定量限采用基質加標法建立標準曲線，在相應的線性范圍內，赭曲霉素A在不同的基質中均線性良好，相關系數(R)≥0.99。靈敏度：將標準品溶液用基質梯度稀釋的方法測定方法的靈敏度，方法的定量為0.5μg/L，檢出限為0.25μg/L。回收率：采用基質加標法對方法的回收率進行考察，高、中、低(1、2、5μg/kg)三個濃度3個平行的添加回收率范圍為81.2-102.6％，相對標準偏差(RSD)為3.41-4.26％。精密度：赭曲霉素A在小麥和玉米基質中的日內精密度相對標準偏差(RSD)為1.71-3.53％，日間精密度相對標準偏差(RSD)為0.69-1.58％，重復性：赭曲霉素A在小麥和玉米基質中的重復性相對標準偏差(RSD)為3.72-4.56％。實施例2樣品檢測1、制備樣品提純液取市場采集的小麥和玉米樣品，分別按下述操作過程進行分析檢測：(1)取小麥和玉米樣品，粉碎后過篩(樣品經粉碎機粉碎至能完全通過0.5mm篩為止)，置于4℃冰箱內保存待用；(2)將樣品取出恢復至室溫后，取5g樣品粉末置于150mL三角瓶中，加入25mL乙腈-水80:20(v/v)的溶液，搖床180r/min震蕩30min后，2500rpm離心5min，取上清液；(3)將5mL乙腈-水80:20(v/v)通過氨基固相萃取柱，棄淋洗液；(4)取5mL上清液通過氨基固相萃取柱，棄過柱液，分別取5mL乙腈-水80:20(v/v)的溶液過柱淋洗，棄淋洗液；(5)將色譜乙腈和甲酸按體積比85:15(v/v)混合后，準確取10mL混合液加入氨基固相萃取柱進行洗脫，收集全部洗脫液于干凈的玻璃試管中，氮氣吹干；(6)吹干后殘渣用1mL甲醇溶液溶解，過0.22μm的濾膜后，過濾液待進樣分析。(2)對本實施例中獲得的樣品(玉米樣品1、玉米樣品2、小麥樣品1、小麥樣品2)提純液進行液相色譜串聯質譜檢測，OTA樣品色譜圖如圖5所示，其中，圖5A為玉米樣品1檢測結果，圖5B為玉米樣品2檢測結果，圖5C為小麥樣品1檢測結果，圖5D為小麥樣品2檢測結果；再將檢測結果帶入實施例1獲得的標準曲線進行比對，以外標法測得樣品中赭曲霉素A的濃度，在依據公式(1)計算樣品中赭曲霉毒素A的含量；式(1)中：X——樣品中赭曲霉素A含量，單位為微克每克，μg/g；C——待測液中赭曲霉素A的濃度，單位為微克每毫升，μg/mL；V——定容體積，單位為毫升，mL；M——樣品稱樣量，單位為克，g。本實施例中不同樣品中赭曲霉毒素A的檢測結果見表3:表3不同樣品中赭曲霉毒素A的檢測結果名稱濃度(ug/kg)玉米1玉米2小麥1小麥2赭曲霉素A4.521.891.01-aa低于檢出限同時，為了驗證方法的精密度及準確性，采用國標GB/T25220-2010測定谷物中赭曲霉毒素A，通過本方法所得到的赭曲霉毒素A含量與國標方法得到的含量偏差≤5％，證明方法準確可靠。并且本方法使用的氨基固相萃取柱價格遠低于國標方法的免疫親和柱，極大的節省了成本。本發明的保護范圍并不限于實施例中所作的描述，不偏離本發明方案中心的修改都屬于本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3