本發明涉及一種基于石墨烯量子點檢測血紅蛋白的方法。

背景技術：

血紅蛋白 (Hemoglobin) 是生物界分布最廣的一種蛋白質，在各種生物體內起著輸氧、分解H₂O₂、產生能量和傳遞電子等重要作用。血紅蛋白含量異常會導致多種疾病，因此，血液中血紅蛋白的含量測定對臨床診斷和生理研究而言意義重大。

近年來，石墨烯量子點 (石墨烯量子點) 作為一種新型熒光探針，引起多個研究領域的廣泛關注。石墨烯量子點具有良好的水溶性、生物相容性好、熒光穩定性強、量子產率高等優點，這些優越的性質使石墨烯量子點熒光探針廣泛應用于生化分析檢測、成像分析、環境監測、藥物載體等領域具有巨大的應用潛力。

目前檢測血紅蛋白的方法有電化學法，吸收光譜測定法，熒光分析法以及高效液相色譜法等，但現有方法存在操作步驟復雜、操作誤差較大、分析時間長等缺點。與上述方法相比，基于石墨烯量子點檢測血紅蛋白的方法：具有較好的選擇性、高靈敏度、成本低廉、操作簡單、快速監測等的優點，具有廣泛的應用前景。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種基于石墨烯量子點檢測血紅蛋白的方法。

本發明首先通過水熱法制備石墨烯量子點并將其與血紅蛋白作用，發現血紅蛋白對石墨烯量子點的熒光淬滅作用，進而提供一種基于石墨烯量子點檢測血紅蛋白的新方法。

為達上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種基于石墨烯量子點熒光檢測血紅蛋白的方法，其特征在于所述的檢測方法具有以下的過程和步驟：

a.將石墨烯量子點分散在磷酸鹽緩沖液中得到石墨烯量子點溶液；

b.將血紅蛋白溶解在磷酸鹽緩沖液中得到血紅蛋白溶液；

c.將步驟a和步驟b所配制的溶液充分混合后加入磷酸鹽緩沖液稀釋，配制一組標準溶液；其中石墨烯量子點的濃度為20mg/L，血紅蛋白的濃度梯度為0～0.5μmol/L；

d.檢測步驟c所配的標準溶液的熒光光譜，記錄熒光強度；建立基于血紅蛋白對石墨烯量子點的熒光淬滅作用的熒光淬滅程度ΔF對血紅蛋白濃度的檢測工作曲線；

e.將待檢測樣品與步驟a所配制的石墨烯量子點溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液稀釋成待測溶液，檢測其熒光光譜，根據熒光淬滅程度ΔF，由步驟d中得到的工作曲線，計算出待測樣品中血紅蛋白的含量。

上述血紅蛋白的檢測方法，磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01mol/L，其pH值為7.4。

上述的檢測其熒光光譜時需在恒溫25°C條件下進行熒光測定，所用的激發波長為368nm，發射波長為470nm，電壓設置為500V，記錄380-650nm熒光光譜數據及470nm處熒光信號。

上述的檢測其熒光光譜時需在恒溫25°C條件下進行熒光測定，所用的激發波長為368nm，發射波長為470nm，電壓設置為500V，記錄380-650nm熒光光譜數據及470nm處熒光信號。

所述方法中，石墨烯量子點可以采用現有技術中已知的方法合成，具體合成方法可參見專利：( 磺酸基石墨烯量子點生物熒光探針及其應用 201510394852.8 )。

基于血紅蛋白對石墨烯量子點熒光淬滅的特性，將石墨烯量子點應用于血紅蛋白的檢測，建立一種基于石墨烯量子點檢測紅血蛋白的新方法，所述方法能夠快速且靈敏高效的檢測血紅蛋白，而且靈敏度高，操作簡單，成本低廉。

本發明方法的優點和特點如下所述：

(1)本發明的檢測方法通過利用血紅蛋白對石墨烯量子點的熒光淬滅現象進行檢測的方

法，操作簡便快捷、高效準確。

(2)本發明的檢測方法，利用熒光檢測具有信息量大、響應速度快、靈敏度高、光學抗干擾能力強等優點，并且可實現在實際樣品中血紅蛋白的快速靈敏檢測，具有很好地選擇性。

(3)本發明的檢測方法采用的石墨烯量子點與其他量子點相比，具有水溶性好、環保無毒、熒光穩定性好、量子產率高、成本低廉等優點。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中的石墨烯量子點熒光檢測不同濃度的血紅蛋白時的熒光變化值與其濃度的曲線關系圖；其中，石墨烯量子點的濃度為20 mg/L，血紅蛋白的濃度區間為0-10 μmol/L；F₀為空白樣品的熒光強度，F_i為不同濃度的血紅蛋白下石墨烯量子點的熒光強度；F_i/F₀為相對熒光強度，F₀ - F為熒光淬滅值。

圖2為本發明實施例2中的石墨烯量子點熒光檢測不同濃度的血紅蛋白所得到的熒光光譜圖；其中石墨烯量子點的濃度固定為20 mg/L，血紅蛋白的濃度依次為0，0.1，0.5，1，3，5，7，9 μmol/L；FL intensity（a.u.）為相對應血紅蛋白下石墨烯量子點的熒光強度，掃描波長為350-650 nm。

圖3為本發明實施例2中的石墨烯量子點熒光檢測不同濃度的血紅蛋白時的熒光淬滅值與血紅蛋白濃度的線性關系圖；其中石墨烯量子點的濃度為20 mg/L，血紅蛋白的濃度依次為0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 μmol/L；△F為熒光淬滅值 (△F= F₀-F)，F₀為空白標樣（血紅蛋白濃度為0μmol/L）的熒光強度，F_i為含不同濃度血紅蛋白下標樣的熒光強度。

圖4為本發明實施例3中的石墨烯量子點熒光檢測混合樣品中血紅蛋白的篩選效果圖。圖中，分別為20.9 mg/L L-精氨酸、22.0 mg/L L-賴氨酸、39.5 mg/L葡萄糖、45.3 mg/L蔗糖、44.0 mg/L維生素C、37.7 mg/L淀粉及5 mg/L的血素；F₀為空白樣品（血紅蛋白濃度為0μmol/L）的熒光強度，F為不同濃度成分下石墨烯量子點的熒光強度，F/F₀為相對熒光強度。

具體實施方式

現將本發明的具體實施例敘述于后。

實施例1：血紅蛋白對石墨烯量子點的熒光淬滅程度與其濃度存在相關性，具體過程如下所示：

1. 配制石墨烯量子點溶液：將合成好的石墨烯量子點分散在磷酸鹽緩沖液（濃度為0.01mol/L，pH值為7.4）中，得到石墨烯量子點溶液（濃度為20mg/L）；

2. 配制血紅蛋白溶液：將血紅蛋白充分溶解在磷酸鹽緩沖液（濃度為0.01mol/L，pH值為7.4）中，得到血紅蛋白溶液（濃度為0 -10μmol/L）；

3. 配制標準溶液：取一定量步驟1和步驟2所配溶液，充分混合加入磷酸鹽緩沖液（濃度為0.01mol/L，pH值為7.4）后，配制一組包括空白標樣在內的不同已知血紅蛋白濃度的標準溶液；其中石墨烯量子點終濃度為20mg/L，血紅蛋白最終濃度梯度為0.05-0.5μmol/L；

4. 測定熒光光譜：通過熒光光譜儀在發波長為368nm的條件下檢測步驟3)所配制的標準溶液的熒光光譜，記錄380-650 nm處的熒光光譜，得到的熒光光譜圖；(具體結果參見圖1)，如圖1所示，石墨烯量子點的熒光強度隨血紅蛋白溶液的濃度增加而減弱，說明血紅蛋白可以明顯淬滅石墨烯量子點的熒光強度。記錄470nm處熒光強度；記空白標樣的熒光強度為F₀，含有血紅蛋白的標樣的熒光強度為F_i，熒光淬滅值ΔF定義為空白標樣的熒光強度F₀減去含有血紅蛋白的標樣的熒光強度F_i，即熒光淬滅值ΔF=F₀-F_i，相對熒光強度F_i/F₀定義為含有血紅蛋白的標樣的熒光強度F_i除以空白標樣的熒光強度F₀；將所述的ΔF與血紅蛋白的濃度C（C單位為μmol/L繪制出濃度與熒光變化值的曲線關系圖；（具體結果參見圖2）

如圖2所示，在血紅蛋白終濃度為0 -10μmol/L的范圍內，熒光淬滅值△F和相對熒光強度程度F_i/F₀與血紅蛋白的濃度均呈現一定的相關性。說明可以通過此量子點與血紅蛋白的熒光淬滅特性，實現快速、簡便、定量檢測溶液中血紅蛋白的含量。

實施例2：建立石墨烯量子點檢測血紅蛋白的工作曲線，具體過程如下所示：

依據實施例1所得結果，我們選取濃度范圍為0 -0.5μmol/L的血紅蛋白進行了進一步的實驗。配制石墨烯量子點溶液（濃度固定為20mg/L），血紅蛋白的濃度依次為0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5μmol/L，將兩者充分混合配制成7份標準溶液，并通過熒光光譜儀在發波長為368nm的條件下檢測所述標準溶液的熒光光譜，取470 nm波長處的熒光強度值F，計算出相應的熒光淬滅值△F= F₀-F，△F與血紅蛋白的濃度C存在良好的線性關系，繪制出C-△F曲線，并作為石墨烯量子點檢測血紅蛋白的工作曲線。(具體結果參見圖3)。如圖3所示，熒光淬滅值△F與血紅蛋白的濃度C之間具有良好的線性關系，線性回歸方程為：△F=25.885+170.8C，（C單位為μmol/L），相關系數為R²=0.995。對血紅蛋白的檢測限可達到1.6 nmol/L。實驗表明，此石墨量子點檢測血紅蛋白具有方便快捷、檢測限低的優點，可以用于血紅蛋白的檢測。

實施例3：采用本發明測定模擬實際樣品中血紅蛋白的含量，具體過程如下所示：

在相同實驗條件下，依據市場中常見的血紅蛋白補鐵保健品成分，模擬一個含血紅蛋白的混合體系，并分別對20.9 mg/L L-精氨酸、22.0 mg/L L-賴氨酸、39.5 mg/L 葡萄糖、45.3 mg/L 蔗糖、44.0 mg/L 維生素C、37.7 mg/L 淀粉及5 mg/L血紅蛋白進行獨立的熒光淬滅實驗，得到相對熒光強度圖譜。 (具體結果參見圖4)。實驗結果表明，上述成分中僅有血紅蛋白使得石墨烯量子點明顯淬滅；同時在混合體系下，體系的整體淬滅程度與單獨的血紅蛋白淬滅程度相當 (96.9 %)，這說明此石墨烯量子點探針檢測血紅蛋白具有靈敏性高的特點，可以用于實時檢測混合溶液 (市場產品) 中的血紅蛋白含量，并且在食品檢測分析等領域具有較好的應用潛力。