本發(fā)明涉及免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌r干擾素的化學(xué)發(fā)光試劑盒及其制備方法、檢測(cè)方法、評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)：

結(jié)核病在全世界仍為危害人類健康和生命的主要傳染病之一。目前全世界結(jié)核病患者約有2000萬(wàn)人，每年新增結(jié)核病患者800萬(wàn)人左右，每年因結(jié)核病死亡人數(shù)約300萬(wàn)人。我國(guó)僅次于印度，位居世界第二。通過(guò)近幾年的流行病學(xué)抽樣調(diào)查初步結(jié)果表明，我國(guó)約5億人口感染結(jié)核分枝桿菌，現(xiàn)有結(jié)核病人約500萬(wàn)人，每年約10萬(wàn)人死亡于結(jié)核病，在我國(guó)傳染病中位居第一。面對(duì)如此嚴(yán)峻的形勢(shì)，結(jié)核病的預(yù)防和控制已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外政府和學(xué)者的高度重視。因此結(jié)核病的早期診斷和治療對(duì)結(jié)核病控制尤為重要。

機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答主要體現(xiàn)為細(xì)胞免疫。因此對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)只有通過(guò)對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行，近年來(lái)，一種用于診斷結(jié)核分枝桿菌的新方法進(jìn)入人們視線，其利用特異性刺激蛋白對(duì)已感染結(jié)核桿菌的細(xì)胞進(jìn)行刺激培養(yǎng)，機(jī)體細(xì)胞會(huì)分泌大量的r干擾素，利用免疫手段對(duì)分泌的特異性的r干擾素進(jìn)行檢測(cè)，間接的體現(xiàn)機(jī)體細(xì)胞的結(jié)核分枝桿菌的受感染情況，該檢測(cè)原理被稱為r干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)技術(shù)。

在該檢測(cè)原理基礎(chǔ)上衍生出了多種檢測(cè)方法學(xué)，目前市場(chǎng)上所擁有的包括酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)法、酶聯(lián)免疫(ELISA)法。ELISPOT檢測(cè)的檢測(cè)靈敏度較高，但因該檢測(cè)方法在抽取病人血樣后需要做淋巴細(xì)胞分離計(jì)數(shù)后再進(jìn)行后期的刺激培養(yǎng)過(guò)夜及免疫檢測(cè)程序，操作復(fù)雜，專業(yè)門檻較高，大大限制了檢測(cè)通量，另外因其涉及的配套設(shè)備和試劑較多，也大大增加了檢測(cè)成本及操作過(guò)程中的錯(cuò)誤率發(fā)生。ELISA檢測(cè)因使用全血培養(yǎng)，節(jié)省了較多操作時(shí)間，在檢測(cè)通量上也彌補(bǔ)了ELISPOT的缺陷，但因?yàn)闄z測(cè)方法學(xué)的限制，其檢測(cè)靈敏度較低，對(duì)于低免疫力或淋巴細(xì)胞數(shù)量偏低的人群，其檢測(cè)結(jié)果的不確定性較高，無(wú)法做到精確的診斷，且因其檢測(cè)低靈敏度的原因，所需檢測(cè)血樣量也較高，需要不低于每個(gè)培養(yǎng)管1ml的血量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述不足的缺陷，本發(fā)明提供了一種定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌r干擾素的化學(xué)發(fā)光試劑盒及其制備方法、檢測(cè)方法、評(píng)價(jià)方法，可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)通量高，檢測(cè)成本低，檢測(cè)樣本量少且不需要太多復(fù)雜的輔助設(shè)備。

本發(fā)明提供了一種定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒，包括血樣刺激系統(tǒng)和免疫檢測(cè)系統(tǒng)，所述血樣刺激系統(tǒng)包括培養(yǎng)管、血樣刺激用對(duì)照品、結(jié)核特異性刺激蛋白；所述免疫檢測(cè)系統(tǒng)包括包被有r干擾素克隆抗體的化學(xué)發(fā)光板、生物素標(biāo)記的r干擾素克隆抗體、鏈霉親和素標(biāo)記的酶底物和酶促發(fā)光底物。

上述的試劑盒，其中，所述血樣刺激用對(duì)照品包括血樣刺激用陰性對(duì)照品和血樣刺激用陽(yáng)性對(duì)照品；所述包被有r干擾素克隆抗體的化學(xué)發(fā)光板包括包被有r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體的化學(xué)發(fā)光板；所述生物素標(biāo)記的r干擾素克隆抗體包括生物素標(biāo)記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體；所述鏈霉親和素標(biāo)記的酶底物包括辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶。

上述的試劑盒，其中，所述血樣刺激用陰性對(duì)照品中包括AIM-V培養(yǎng)液。

上述的試劑盒，其中，所述結(jié)核特異性刺激蛋白包括AIM-V培養(yǎng)液和結(jié)核分枝桿菌特異性刺激蛋白ESAT6和CFP10的獨(dú)立蛋白混合或ESAT6和CFP10融合蛋白。

上述的試劑盒，其中，所述血樣刺激用陽(yáng)性對(duì)照品中包括AIM-V培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液、植物血凝素或CD3細(xì)胞因子。

上述的試劑盒，其中，所述生物素標(biāo)記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體的緩沖液為磷酸鹽緩沖液和蛋白保護(hù)劑。

上述的試劑盒，其中，所述鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶的緩沖液為磷酸鹽緩沖液和蛋白保護(hù)劑。

同時(shí)在另一種實(shí)施例中，本發(fā)明還提供了一種定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

r干擾素單克隆抗體或多克隆抗體包被化學(xué)發(fā)光板的制備；

生物素標(biāo)記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體及工作夜的制備；

鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶及工作液的制備；

校準(zhǔn)品的制備；

洗滌液的制備。

本發(fā)明的另一面，本發(fā)明還提供了一種定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

血樣培養(yǎng)；

r干擾素檢測(cè)。

本發(fā)明的再一面，本發(fā)明還提供了一種定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒的評(píng)價(jià)方法，包括以下步驟：

根據(jù)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

根據(jù)上述的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算最低檢出限和精密性值；

根據(jù)上述最低檢出限和精密性值來(lái)判定檢測(cè)樣本的陰陽(yáng)性。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：采用酶促化學(xué)發(fā)光法，將r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體包被于化學(xué)發(fā)光板中，利用酶促催化發(fā)光底物，并利用生物素放大系統(tǒng)，提高了試劑盒的靈敏度和準(zhǔn)確性；同時(shí)對(duì)于樣本使用量為3.0ml以下；實(shí)驗(yàn)證明，化學(xué)發(fā)光法配合生物素放大系統(tǒng)是一種檢測(cè)r干擾素的有效方法，且進(jìn)一步證明了對(duì)3.0ml以下的血樣量的檢測(cè)結(jié)果也有效的符合于臨床評(píng)判。

具體優(yōu)點(diǎn)包括：

1、化學(xué)發(fā)光法配合生物素放大系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)于T淋巴細(xì)胞偏少的樣本的檢測(cè)結(jié)果與市面上ELISA試劑盒做了比對(duì)，本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)靈敏度明顯高于ELISA試劑盒，能夠?qū)LISA檢測(cè)結(jié)果不確定的樣本，做出很好的結(jié)果判斷；

2、本發(fā)明試劑盒在血樣處理上，沒(méi)有T淋巴細(xì)胞分離過(guò)程，為全血直接培養(yǎng)，在此操作上與市面上的ELISPOT試劑盒比較，減少了操作程序，避免了更多的操作失誤，也節(jié)省了更多的操作時(shí)間，降低了操作所需試劑耗材的成本損耗；且因本發(fā)明試劑盒無(wú)需做太多血樣處理，操作簡(jiǎn)便，對(duì)于所需設(shè)備也無(wú)很高要求，可實(shí)現(xiàn)大通量檢測(cè)，免疫診斷部分可實(shí)現(xiàn)半自動(dòng)化或全自動(dòng)化批量操作。

3、目前市場(chǎng)上的ELISA試劑盒所需樣本量為3ml以上；ELISPOT試劑盒所需樣本量為5ml以上，對(duì)于低免疫人群的樣本量需求更高，甚至達(dá)到8-10ml，本發(fā)明試劑盒對(duì)于血樣樣本量的最高要求僅為3.0ml，大大減少了病人的血樣抽取量。

附圖說(shuō)明

通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明及其特征、外形和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯。在全部附圖中相同的標(biāo)記指示相同的部分。并未刻意按照比例繪制附圖，重點(diǎn)在于示出本發(fā)明的主旨。

圖1為本發(fā)明提供的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

在下文的描述中，給出了大量具體的細(xì)節(jié)以便提供對(duì)本發(fā)明更為徹底的理解。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明可以無(wú)需一個(gè)或多個(gè)這些細(xì)節(jié)而得以實(shí)施。在其他的例子中，為了避免與本發(fā)明發(fā)生混淆，對(duì)于本領(lǐng)域公知的一些技術(shù)特征未進(jìn)行描述。

為了徹底理解本發(fā)明，將在下列的描述中提出詳細(xì)的步驟以及詳細(xì)的結(jié)構(gòu)，以便闡釋本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明的較佳實(shí)施例詳細(xì)描述如下，然而除了這些詳細(xì)描述外，本發(fā)明還可以具有其他實(shí)施方式。

本發(fā)明提供了一種定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒，包括血樣刺激系統(tǒng)和免疫檢測(cè)系統(tǒng)，所述血樣刺激系統(tǒng)包括培養(yǎng)管、血樣刺激用對(duì)照品、結(jié)核特異性刺激蛋白；所述免疫檢測(cè)系統(tǒng)包括包被有r干擾素克隆抗體的化學(xué)發(fā)光板、生物素標(biāo)記的r干擾素克隆抗體、鏈霉親和素標(biāo)記的酶底物和酶促發(fā)光底物。其中培養(yǎng)管中血樣需求量在1.0ml及以下，也即每個(gè)檢測(cè)樣本量所需樣本量在3ml以下，目前市場(chǎng)上的ELISA試劑盒所需樣本量為3ml以上；ELISPOT試劑盒所需樣本量為5ml以上，對(duì)于低免疫人群的樣本量需求更高，甚至達(dá)到8-10ml，本發(fā)明試劑盒對(duì)于血樣樣本量的最高要求僅為3.0ml，大大減少了病人的血樣抽取量。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實(shí)施例中，血樣刺激用對(duì)照品包括血樣刺激用陰性對(duì)照品和血樣刺激用陽(yáng)性對(duì)照品；包被有r干擾素克隆抗體的化學(xué)發(fā)光板包括包被有r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體的化學(xué)發(fā)光板，進(jìn)一步，包被于化學(xué)發(fā)光板中的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體的濃度在于1～3ug/ml；生物素標(biāo)記的r干擾素克隆抗體包括生物素標(biāo)記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體；鏈霉親和素標(biāo)記的酶底物包括辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶。其中鏈霉親和素標(biāo)記的酶底物并不限于辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶，進(jìn)一步，辣根過(guò)氧化物酶為辣根過(guò)氧化氫酶。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實(shí)施例中，血樣刺激用陰性對(duì)照品中包括AIM-V培養(yǎng)液。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實(shí)施例中，結(jié)核特異性刺激蛋白包括AIM-V培養(yǎng)液和結(jié)核分枝桿菌特異性刺激蛋白ESAT6和CFP10的獨(dú)立蛋白混合或ESAT6和CFP10融合蛋白。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實(shí)施例中，血樣刺激用陽(yáng)性對(duì)照品中包括AIM-V培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液、植物血凝素或CD3細(xì)胞因子。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實(shí)施例中，生物素標(biāo)記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體的緩沖液為磷酸鹽緩沖液和蛋白保護(hù)劑。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實(shí)施例中，鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶的緩沖液為磷酸鹽緩沖液和蛋白保護(hù)劑，其中保護(hù)蛋白劑可以為酪蛋白、牛血清白蛋白、明膠、動(dòng)物血清或人血清。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實(shí)施例中，酶促發(fā)光底物為辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶的酶促發(fā)光底物。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實(shí)施例中，試劑盒中還包含r干擾素校準(zhǔn)品。本發(fā)明的另一面，一種定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

步驟S1：r干擾素單克隆抗體或多克隆抗體包被化學(xué)發(fā)光板的制備，具體包括，利用磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液將r干擾素單克隆抗體或多克隆抗體稀釋至1～3ug/ml，按照100ul/孔加入化學(xué)發(fā)光板中，并于4℃放置16～20小時(shí)后，取出化學(xué)發(fā)光板，甩干殘液，利用如牛血清白蛋白、酪蛋白、明膠、動(dòng)物或人血清等進(jìn)行封閉處理，按照120ul～200ul/孔加樣，37℃放置2小時(shí)或4℃放置16～20小時(shí)，甩干殘液，干燥保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

步驟S2：生物素標(biāo)記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體及工作夜的制備，具體包括步驟S2a：生物素標(biāo)記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體制備，具體為利用0.1M PBS pH7.2配制10mM NHS-DPEG4-Biotin工作溶液。將r干擾素單克隆抗體或多克隆抗體加入適量的10mM NHS-DPEG4-Biotin工作溶液中，于室溫反應(yīng)1小時(shí)，利用葡聚糖凝膠分離純化，去除游離生物素，加入0.1％BSA，放置4℃?zhèn)溆茫徊襟ES2b：生物素標(biāo)記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體工作液的制備，具體包括：稀釋液的制備：0.01M PB緩沖液(pH7.4)，1％酪蛋白或1％BSA，0.1％proclin300；工作液的制備：用稀釋液稀釋生物素標(biāo)記好的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體后得到生物素標(biāo)記的r干擾素單克隆抗體或r干擾素多克隆抗體工作液，其稀釋比例在1:500～1:5000，優(yōu)選比例比例為1:1000。

步驟S3：鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶及工作液的制備，具體包括步驟S3a：鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶的制備，其中包括采用戊二醇法，將辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶配置成50IU/ml，取適量，加入含1.25％戊二醛的pH6.8的PBS溶液中，混勻至室溫下反應(yīng)過(guò)夜。收集反應(yīng)液，利用PBS(pH7.2)透析4次，取適量SA溶于1mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.5)中，與透析后的反應(yīng)液混勻，于4℃反應(yīng)，并加入適量0.2mol/L賴氨酸溶液。混勻，室溫反應(yīng)2小時(shí)，利用0.05mol/L PBS(pH7.2)透析4次。離心取上清液，至4℃?zhèn)溆谩２襟ES3b：鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶工作液的制備，其中包括，稀釋液的制備：0.1M TB緩沖液(pH7.4)，1％酪蛋白或1％BSA，0.1％proclin300；工作液的制備：用稀釋液稀釋鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶后得到鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶工作液或鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶工作液，其稀釋比例在1:500～1:5000，優(yōu)選稀釋比例為1:1000。

步驟S4：校準(zhǔn)品的制備，具體包括：r干擾素校準(zhǔn)品抗原為基因重組的濃度≥95％的人r干擾素蛋白或國(guó)際(WHO/NIBSC)和國(guó)家中檢院提供的人r干擾素標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)，本發(fā)明試劑盒中涉及的r干擾素校準(zhǔn)品的稀釋液為AIM-V或含1％BSA的PB緩沖液，內(nèi)含0.1％proclin300。稀釋濃度梯度為：0IU/ml、0.25IU/ml、1.0IU/ml、4.0IU/ml、16.0IU/ml、64.0IU/ml，用于制作檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，制作的標(biāo)注曲線如圖1所示的其中一種實(shí)施例。

步驟S5：洗滌液的制備，具體包括：洗滌液為0.01M PBST溶液，配制1L的洗滌液：二水磷酸二氫鈉9.75g、十二水磷酸氫二鈉51g、氯化鈉155g、Tween20 10ml，內(nèi)含0.1％proclin300，使用時(shí)利用超純水20倍稀釋。

本發(fā)明的還提供了一種定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒的檢測(cè)方法，具體包括以下步驟：

步驟a：血樣培養(yǎng)，具體包括，肝素抗凝血樣管抽取血樣3.0ml量；在血樣離體6-8小時(shí)內(nèi)，按照1.0ml/管血樣分別加入陰性對(duì)照培養(yǎng)管、特異性刺激培養(yǎng)管、陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)管；血樣管上下顛倒8-10次或5秒時(shí)間，使血樣與培養(yǎng)管中的物質(zhì)充分混勻，此階段若產(chǎn)生氣泡對(duì)后續(xù)檢測(cè)無(wú)影響；將血樣培養(yǎng)管豎直放置37℃培養(yǎng)箱中，孵育20～24小時(shí)。

步驟b：r干擾素檢測(cè)階段，具體包括20倍稀釋濃縮洗滌液至工作濃度；按照稀釋梯度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品濃度稀釋，并加入化學(xué)發(fā)光板中，50ul/孔，做好標(biāo)示；取出培養(yǎng)管，抽取上清液作為檢測(cè)樣本；也可離心機(jī)離心獲取上清液；按照50ul/孔加入對(duì)應(yīng)板孔，做好標(biāo)示；取生物素標(biāo)記的r干擾素抗體工作液，按照50ul/孔加入對(duì)應(yīng)板孔；37℃孵育2h，取出，每孔200ul洗滌液，洗滌4次，拍干；取鏈霉親和素標(biāo)記的過(guò)氧化物酶工作液或鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶工作液，按照50ul/孔加入對(duì)應(yīng)反應(yīng)孔；50ul/孔，放置37℃反應(yīng)30min取出發(fā)光板，每孔200ul洗滌液，洗滌4次，拍干；每孔加入50ul酶發(fā)光底物，讀取發(fā)光值；分別取校準(zhǔn)品梯度的濃度值和發(fā)光值的對(duì)數(shù)值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得曲線方程；將待測(cè)樣本的發(fā)光值取對(duì)數(shù)值代入，計(jì)算出待測(cè)樣本濃度值的對(duì)數(shù)值，取指數(shù)，即為待測(cè)樣本的濃度值。

本發(fā)明還提供了一種定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌r干擾素的試劑盒的評(píng)價(jià)方法，具體包括步驟(1)：根據(jù)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體為本發(fā)明試劑盒用校準(zhǔn)品濃度(0IU/ml剔除，該值作為反應(yīng)板本底考慮，不計(jì)入標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi))的ln值作為X值，對(duì)應(yīng)濃度檢測(cè)的發(fā)光值RLU分別取對(duì)數(shù)做Y值，以此做一元一次方程。如圖1所示，所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝0.8882x+7.2012，R2＝0.9994。

步驟(2)：根據(jù)上述的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算最低檢出限和精密性值，具體包括本發(fā)明試劑盒在檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的同時(shí)檢測(cè)最低檢出限參考品(0.1IU/ml)10次，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算最低檢出限參考品的平均濃度值(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。根據(jù)公式：檢出限＝X+2SD，計(jì)算樣品的最低檢出限，結(jié)果如表1，本發(fā)明試劑盒對(duì)血樣檢測(cè)IFN-r的最低檢出限為0.139IU/ml＜0.15IU/ml，如表1所示為IFN-r化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的最低檢出限。同上述最低檢出限的檢測(cè)結(jié)果，本發(fā)明試劑盒利用標(biāo)準(zhǔn)差(SD)/平均濃度值(x)所獲得的比值即為精密性值，即：標(biāo)準(zhǔn)差0.010IU/ml除以平均濃度值0.092IU/ml，乘以100％，為11.11％＜15％。

表1 IFN-r化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的最低檢出限

步驟(3)：根據(jù)上述最低檢出限和精密性值來(lái)判定檢測(cè)樣本的陰陽(yáng)性，具體包括，篩選20例新鮮血樣，10例明確結(jié)核感染陽(yáng)性患者，10例明確結(jié)核感染陰性樣本。利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行血樣培養(yǎng)及免疫反應(yīng)檢測(cè)。對(duì)血樣進(jìn)行編號(hào)：10例陰性樣本N1～N10；10例陽(yáng)性樣本P1～P10對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度值及發(fā)光值分別取對(duì)數(shù)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)將樣本檢測(cè)發(fā)光值取對(duì)數(shù)值，帶入方程式中Y值，計(jì)算出X值，并取X值的指數(shù)值，即為對(duì)應(yīng)樣本發(fā)光值的濃度值。對(duì)該些濃度值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，判定該檢測(cè)樣本的陰陽(yáng)性。其中陰陽(yáng)性結(jié)果判定依據(jù)如下所示：

1.當(dāng)陰性培養(yǎng)管濃度≤8IU/ml：

1.1.T-N＜0.35IU/ml，P-N≥0.5IU/ml，結(jié)果為陰性；

1.2.T-N≥0.35IU/ml且＜N/4，P-N≥0.5IU/ml，結(jié)果為陰性；

1.3.T-N≥0.35IU/ml且≥N/4，結(jié)果為陽(yáng)性；

1.4.T-N＜0.35IU/ml且P-N＜0.5IU/ml，結(jié)果為不確定；

1.5.T-N≥0.35IU/ml且＜N/4，P-N＜0.5IU/ml，結(jié)果為不確定；

2.當(dāng)陰性培養(yǎng)管濃度＞8IU/ml：

任何檢測(cè)值都判為不確定性。

使用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)的結(jié)果如表2所示：

表2 IFN-r化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)10例陰性血樣、10例陽(yáng)性血樣的結(jié)果

從表2可以看出，采用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)r干擾素與目前市面上所擁有的ELISPOT方法學(xué)檢測(cè)試劑盒以及ELISA檢測(cè)試劑盒相比較，具有操作簡(jiǎn)便、操作靈敏度高、特異性好、檢測(cè)成本低、樣本使用量少，對(duì)于設(shè)備的要求低等的優(yōu)點(diǎn)。

以上對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，其中未盡詳細(xì)描述的設(shè)備和結(jié)構(gòu)應(yīng)該理解為用本領(lǐng)域中的普通方式予以實(shí)施；任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。