本發明屬于分子生物學領域，具體地說是一種循環腫瘤細胞表面標志分子磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的檢測方法。

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背景技術：
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循環腫瘤細胞(circulating tumor cell；CTC)是從腫瘤原發灶脫落進入外周血的腫瘤細胞，會隨著血液流動選擇合適的微環境，種植于遠處器官，形成轉移灶。目前，外周血CTC檢測技術只能實現對外周血中CTC的定性且相對定量的檢測，并不能追蹤到血液中的CTC來源于哪一個器官，CTC是從原發灶上脫落下來的腫瘤細胞，其表面含有在原發灶上特異性表達的標志分子。如磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)是一種聚合在細胞膜表面的肝素類硫酸蛋白多糖，可通過糖基磷脂酰肌醇錨定在細胞表面，對腫瘤細胞的增殖，遷移具有調控作用。有研究表明，GPC3在原發性肝細胞肝癌HCC中具有高表達，而在癌旁組織、肝硬化、肝炎組織、成人正常肝組織低表達或不表達。因此，若能提供一種檢測循環腫瘤細胞表面GPC3的方法，將具有非常重要的意義。

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技術實現要素：
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本發明的目的就是要解決上述的不足而提供一種循環腫瘤細胞表面標志分子磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的檢測方法，該檢測方法簡便、快速、經濟，靈敏度高，特異性好，能夠解決現有技術檢測GPC3需要標本量大反應不徹底的不足。

為實現上述目的設計一種循環腫瘤細胞表面標志分子磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的檢測方法，包括以下步驟：

1)全血處理：a.向全血中加入紅細胞裂解液，室溫放置15min，期間均勻搖晃；b.于200RCF離心5分鐘，吸除上清，保留細胞；c.向離心管中加入1％FPBS，混勻后于200RCF離心5分鐘，去上清；

2)細胞全富集：a.加入FPBS混勻后轉入處理好的培養皿中，將培養皿置于37℃搖床中培養45min；b.培養后將培養皿置于4℃冰箱中，靜置1min；

3)細胞固定：a.吸除FPBS，向培養皿中加入4％甲醛后置于4℃靜置1min；b.吸除甲醛，再加入1mL甲醇，置于-20℃20min；c.再吸除甲醇，每次用2mL PBS清洗三次；

4)封閉及抗體孵育：a.向培養皿中加入5％m/V含0.02％Tween-20的脫脂奶粉，脫脂奶粉用PBS配置，4℃避光孵育1h；b.吸除脫脂奶粉后，沿壁加入PBST清洗4次，每次5min；c.向封閉液中加入anti-CK和GPC3一抗，混合均勻后沿壁加入培養皿中，4℃避光孵育過夜；d.吸除混合液，向封閉液中加入GPC3二抗，混勻后沿壁加入培養皿中，4℃避光孵育1h；e.吸除抗體，用PBST清洗三次，加入DAPI，常溫避光孵育30min；

5)掃描：吸除抗體，用PBST清洗三次，再加入PBS掃描。

進一步地，所述FPBS由FBS、PBS配置而成，其體積比為FBS:PBS＝1:99。

進一步地，步驟4)中，PBST中含0.02％Tween-20的PBS。

進一步地，步驟5)中，采用高通量多色成像分析，選擇CY5、FITC和DAPI的濾光片，觀察通道表面熒光顏色，顯藍色的則DAPI+，不顯藍色則DAPI-，顯綠色則GPC3+，不顯綠色則GPC3-，顯紅色則CK+，不顯紅色則CK-，根據熒光顯色，將DAPI+且CK+的點認為是CTC，若該CTC上存在GPC3+，那么該CTC來源于肝臟。

本發明同現有技術相比，首次將CTC檢測和GPC3標志物檢測結合起來，通過對血液進行紅細胞裂解，利用納米技術使剩余有核細胞(主要是CTC和淋巴細胞)全部平鋪富集在納米基底上固定，然后用細胞核熒光染料DAPI標記出所有細胞，之后通過腫瘤免疫熒光標志物細胞角蛋白抗體anti-CK進行陽性篩選，由于CTC表面具有GPC3的特異性表達，用GPC3一抗孵育所有細胞，再用標記有FITC熒光基團的二抗孵育，最后通過高通量技術掃描，最終實現對循環腫瘤細胞表面標志分子磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的檢測，該檢測方法簡便、快速、經濟，靈敏度高，特異性好，解決了現有技術檢測GPC3需要標本量大反應不徹底的不足。

[具體實施方式]

下面結合具體實施例對本發明作以下進一步說明：

本發明提供了一種循環腫瘤細胞表面標志分子磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的檢測方法，具體包括以下步驟：

1)全血處理：

a.向2mL全血中加入200μL 1×紅細胞裂解液，室溫放置15min，期間均勻搖晃。

b.200RCF離心5分鐘，吸除上清，保留細胞。

c.向離心管中加入2mL 1％FPBS(V(FBS):V(PBS)＝1:99)，混勻后于200RCF離心5分鐘，去上清。

2)細胞全富集：

a.加入1mL FPBS混勻后轉入處理好的培養皿中，將培養皿置于37℃搖床中培養45min。

b.培養后將培養皿置于4℃冰箱中，靜置1min。

3)細胞固定：

a.吸除FPBS，向培養皿中加入4％甲醛后置于4℃靜置1min。

b.吸除甲醛，加入1mL甲醇，置于-20℃20min。

c.吸除甲醇，每次用2mL PBS清洗三次。(注：每次加入液體時，沿培養皿壁加入，避免將細胞沖起。

4)封閉及抗體孵育：

a.向培養皿中加入1mL 5％(m/V)含0.02％Tween-20的脫脂奶粉(用PBS配置)，4℃避光孵育1h。

b.吸除脫脂奶粉后，沿壁加入2mL PBST(含0.02％Tween-20的PBS)清洗4次，每次5min。

c.向500μL封閉液中加入1μL anti-CK和2μLGPC3一抗(proteintech；25175-1-AP)，混合均勻后沿壁加入培養皿中，4℃避光孵育過夜。

d.吸除混合液，向500μL封閉液中加入5μL GPC3二抗(三箭生物；GR200G-02C)，混勻后沿壁加入培養皿中，4℃避光孵育1h。

e.吸除抗體，用PBST清洗三次，加入1mL細胞核染料DAPI(4,6-聯瞇-2-苯基吲哚)，常溫避光孵育30min。

5)掃描：吸除抗體，用2mL PBST清洗三次，加入1mL PBS掃描。

上述步驟5)中，采用高通量多色成像分析，選擇CY5、FITC和DAPI的濾光片，觀察通道表面熒光顏色，顯藍色的則DAPI+，不顯藍色則DAPI-，顯綠色則GPC3+，不顯綠色則GPC3-，顯紅色則CK+，不顯紅色則CK-，根據熒光顯色，將DAPI+且CK+的“點”認為是CTC，如果該CTC上存在GPC3+，那么該CTC來源于肝臟，否則，則不是，該檢測方法簡便、快速、經濟，靈敏度高，特異性好。

本發明并不受上述實施方式的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。