本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種維醫異常黏液質型陽痿病證的哺乳動物血清和陰莖平滑肌組織差異蛋白及其篩選方法與應用。
背景技術：
：維吾爾醫(維醫)學是祖國傳統醫學中重要組成部分，維醫學體液論認為，人體由膽液質、血液質、黏液質和黑膽質4種體液質組成，上述4種體液質的動態平衡是機體健康的生理基礎，而某一種體液質的量或/和質的變化，引起體液質平衡失調，產生一種異常體液質證(證候)，與多種疾病的發生存在因果關系。體液病理學(體液論)是維醫理論根基，其認為4種體液中，黏液質體液屬性濕寒，常易因生活、飲食與環境因素、工作壓力、缺乏運動等原因導致體內體液平衡遭到破壞，黏液質體液發生改變，產生異常黏液質，致代謝水平降低，產物蓄積體內，進而導致病理性改變，引發相關疾病。臨床研究證實，異常黏液質證(AbnormalPhlegm)在陽痿(陰莖勃起功能障礙)、早泄、少弱精癥、卵巢早衰、不孕不育等生殖疾病、肥胖癥、高脂血癥等代謝性疾病和心血管疾病發生過程中，處于主導地位，可能也是腫瘤、糖尿病、高血壓等復雜性疾病發生早期的主要證型。勃起功能障礙(ErectileDysfunction，ED)，又稱陽痿，是指男子陰莖不能勃起及不能維持勃起而完成滿意的性生活，屬維醫優勢病種。陰莖勃起是由多種生物活性因子(包括神經遞質，激素，酶，離子通道等)綜合調節的神經-血管性生物活動。在維醫藥臨床與基礎研究方向，因實驗動物學起步較晚，無相關病證結合動物模型，導致異常黏液質型陽痿病證及其對證方藥作用機理研究一直滯后，并嚴重制約了維醫男科在此領域的研究與發展，更無關于異常黏液質型陽痿病證的相關標志蛋白及其蛋白標志物體系的研究報道。為了從現代生殖生物學角度進一步認識維醫異常黏液質型陽痿，我們基于維醫體液論和造模理念，成功建立了異常黏液質證候動物模型，并采用APO陰莖勃起實驗與交配實驗結合的方法，從中篩選出ED模型，對其生物學表征、性功能與交配行為、性腺軸與NO-CGMP信號轉導通路等生殖生物學方面的改變進行了研究，但異常黏液質型陽痿病證并非是單一生殖器官即陰莖平滑肌組織的的疾病，而是全身性疾病，因此需要我們用整體觀念，從全身的視野，來分析、研究和探索該病證的發生發展規律與可能的治療方法。維醫辨證分型的起點和核心是維醫“體液論”，其出發點是人體內在體液動態變化的外在表現，而維醫藥學所推崇的辨證施治也是依據個體的整體水平上發生的體液表型差異，這與系統生物學整體研究思路不謀而合。血清融入了機體多器官、組織和細胞的蛋白質動態信息，也是與陰莖勃起功能密切相關的分泌蛋白必經之路，可以反映機體的病理生理改變相關的總體調控網絡的時空性，而藥物對任何靶器官、組織或細胞的作用最終也反映在血清蛋白質組變化之中。陰莖是陰莖勃起的效應器官，海綿體平滑肌則為效應組織，其任何一種病理勝利改變也與該組織蛋白質水平動態變化密不可分，其中蘊藏著陽痿發生相關的潛在蛋白標記，也是該疾病藥物治療的重要靶點之一。故，本研究基于異常黏液質證候與病證結合動物模型基礎上，開展了血清和陰莖平滑肌組織的蛋白質組學研究，建立了異常黏液質型陽痿病證相關血清和陰莖平滑肌組織蛋白體系，為進一步開展異常黏液質型陽痿病證的機制研究、藥物篩選、轉化與防治研究奠定了基礎。技術實現要素：有鑒于此，本發明的第一目的在于提供維醫異常黏液質型陽痿病證的哺乳動物血清差異蛋白體系，包括以下蛋白：優選地，本發明的所述維醫異常黏液質型陽痿病證的哺乳動物血清差異蛋白體系來自模式動物；所述模式動物為大鼠。本發明的第二目的在于提供維醫異常黏液質型陽痿病證的哺乳動物陰莖平滑肌組織差異蛋白體系，包括以下蛋白：優選地，本發明所述維醫異常黏液質型陽痿病證的哺乳動物陰莖平滑肌組織差異蛋白體系來自模式動物；所述模式動物為大鼠。本發明再一目的在于提供了上述維醫異常黏液質型陽痿病證的哺乳動物血清差異蛋白體系和陰莖平滑肌組織差異蛋白體系的篩選方法，包括以下步驟：1)建立正常對照組(N組)、異常黏液質證候組(ZM組)、異常黏液質型病證組(BM組)；2)采集所述步驟1)得到的哺乳動物全血，分離后得到哺乳動物的血清，取所述步驟1)得到哺乳動物的陰莖平滑肌組織；3)從所述步驟2)得到的所述血清和所述陰莖平滑肌組織中提取蛋白質；4)將所述步驟3)中得到的所述蛋白質標記后純化，得到純化后肽段；5)將所述步驟4)得到的所述純化后的肽段經質譜檢測后得到指紋圖譜，篩選后所述指紋圖譜使用蛋白質組學分析軟件進行檢索，根據得到的搜索結果和篩選后的譜圖進行定量分析，將得到的分析數據在所述哺乳動物蛋白質數據庫中使用蛋白質質譜檢索軟件檢索，獲得所述N組、ZM組和BM組哺乳動物血清和陰莖平滑肌組織差異蛋白質；6)將所述步驟5)中所述BM組與ZM組的血清蛋白質相比較，得到BM/ZM的血清差異蛋白質；將BM組與N組的血清蛋白質相比較，得到BM/N的血清差異蛋白質；統計所述BM/ZM和BM/N的差異蛋白的共同蛋白的種類和數量，得到異常黏液質型陽痿病證組的血清差異蛋白質；所述BM組和與ZM組的陰莖平滑肌蛋白質相比較，得到BM/ZM的陰莖平滑肌組織差異蛋白質；將BM組與N組的陰莖平滑肌組織蛋白質相比較，得到BM/N組陰莖平滑肌組織差異蛋白質；統計所述BM/ZM和BM/N的差異蛋白的共同蛋白的種類和數量，得到異常黏液質型陽痿病證組的陰莖平滑肌組織差異蛋白質；優選地，本發明的篩選方法中，所述哺乳動物為大鼠。優選地，本發明的篩選方法中，所述步驟1)中正常對照組大鼠在常規環境中飼養，喂食的環境溫度為18～22℃，所述喂食環境的相對濕度為40～60％，造模組的喂食的環境溫度為8～12℃，所述喂食環境的相對濕度70～80％％；所述步驟1)中正常對照組為普通飼料，造模組喂食飼料為濕寒性飼料。優選地，本發明的篩選方法中，所述步驟3)中所述標記方法為iTRAQ標記試劑盒標記。優選地，本發明的篩選方法中，所述步驟4)中蛋白質組學分析軟件為ProteomeDiscoverer；所述蛋白質質譜檢索軟件為mascot軟件。本發明還提供了上述維醫異常黏液質型陽痿病證的哺乳動物血清差異蛋白體系和陰莖平滑肌組織差異蛋白體系在制備預防或治療哺乳動物異常黏液質型陽痿藥物中的應用。由上可知，本發明的優點在于：1、現代醫學中沒有證候的概念，常用疾病與正常對照組之間尋找差異蛋白，而在維醫臨床診治中，則需辨證論治，并對不同證型的陽痿患者使用不同的方藥進行治療，即病證與方藥對應。本專利發明人，基于對證候和病證的認識與豐富的維吾爾醫學知識，運用辯證與辨病相結合的方式，通過類比方法，在BM與ZM組的差異蛋白與BM與N組的差異蛋白之間尋找共同蛋白，篩查出了異常黏液質型陽痿病證的血清和陰莖平滑肌組織候選蛋白標志物，并通過驗證，建立了異常黏液質型陽痿病證的哺乳動物血清和陰莖平滑肌組織蛋白標志物體系，而該體系則更準確的反映了維醫對病證的詮釋，體現了證候的本質。并建立宏觀與微觀認識配合、分析與綜合研究統一的指標體系，提升陽痿的辨證論治水平與藥物研發水平具有重要意義2、本發明提供了35種維醫異常黏液質型陽痿病證的哺乳動物血清差異蛋白和48種陰莖平滑肌組織差異蛋白；通過實施例表明其在模式動物如大鼠中血清和陰莖平滑肌組織中差異蛋白的上調或者下調表達，表明這些差異蛋白對大鼠的陰莖勃起功能產生了一定的影響，最終確定為異常黏液質型陽痿病證的生物標記物，可以針對上述生物標記物進行藥物基礎研究，為進一步開展異常黏液質型陽痿(勃起功能障礙)病證機制研究、藥物篩選、轉化與防治研究奠定了基礎，提供了依據。附圖說明圖1為正常對照組、異常黏液質證侯組和病證組大鼠模型的造模流程圖；圖2為維醫異常黏液質型陽痿病證的哺乳動物血清和陰莖平滑肌組織蛋白質組學及其差異蛋白體系的篩選流程圖；圖3為大鼠血清差異蛋白質和大鼠陰莖平滑肌組織差異蛋白質的完整性檢測的SDS-PAGE電泳圖譜。圖4為35種候選差異蛋白中任意選取7種蛋白的ELISA檢測。具體實施方式在本發明實施例中，試驗動物為：具有正常性能力的性成熟期SD雄性大鼠30只(體重200g左右)，雌性大鼠15只(體重180g左右)，由新疆醫科大學實驗動物中心提供；在本發明實施例中，藥品與試劑：濕寒性飼料由新疆醫科大學實驗動物中心按前期研究中使用的要求配制；菠菜實與芫荽實等藥材購自于新疆維吾爾自治區維吾爾醫醫院草藥房；戊巴比妥鈉；生理鹽水；阿撲嗎啡(90μg/kg)；雌二醇；黃體酮；主要檢測試劑：ELISA試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒等。在本發明實施例中，術語為以下含義：術語APO:阿撲嗎啡(Apomorphine)；術語iTRAQ：同位素標記相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation)術語HPLC:：高效液相色譜法(HighPerformanceLiquidChromatography)術語SDS：十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate,sodiumsalt)生物學表征觀測：定性指標觀測：所述定性指標觀測為皮膚毛發在日光下觀察，情緒反應以一籠內各大鼠相互反應為主觀察30分鐘，行為狀態以此期間內的活動為主、安靜環境下觀察30分鐘，興奮程度以夾尾實驗時的反應為主，舌象舌苔在日光下觀察、記錄并拍照，飲食水狀態以各組同一時間喂飼觀察飲食水狀態，小便以各組大鼠當日正排尿時顏色為主，大便狀態以當日正排大便時大便形態為主；定量指標為避免生理節奏的影響，每天固定于20:00-22:00收集各項資料，其中體重：每天按規定時間稱重并記錄，以每籠總體重除以該籠大鼠只數，得出平均體重，并按下述公式得出模型組各籠體重比值并記錄，體重比值＝模型組平均體重-模型組初始體重/正常組平均體重-正常組初始體重；飲食量：每天20:00添加飼料300g，次日20:00稱食物余量，根據下述公式得出100g體重相對應的飲食量并記錄；飲水量：每天20:00給水500ml，次日20:00量剩余水量，計算得出100g體重相對應的飲水量并記錄；尿量：造模第一天記錄好給的干墊料重量，第二天按規定時間稱含有尿液及大便的濕墊料的重量并記錄，然后在恒溫鼓風干燥箱100℃下2小時烘干后再次稱重，計算各組尿量；大便量：計算100g體重相對應的大便量并記錄。APO勃起試驗或APO實驗方法為參考Heaton等的方法，將試驗大鼠置于觀察箱中10～15min適應環境，保持安靜，調暗燈光，在大鼠頸項皮膚注射阿撲嗎啡(APO)90μg/kg(0.5mg/kg維生素C于中溶解阿樸嗎啡后，與5mL/kg生理鹽水混勻)，注射后立刻觀察，計時器計時，觀測并記錄1800s(0.5h)內大鼠的勃起潛伏期和勃起次數。陰莖勃起的標準：勃起時大鼠呈蹲踞位，陰莖體末端伸出，低頭舔舐陰莖頭。勃起潛伏期為注射后至第一次勃起的時間。勃起次數為注射后1800s內大鼠出現陰莖勃起的次數。若1800s內未見勃起，則該大鼠勃起次數記為0,勃起潛伏期記為1800s。交配實驗方法：將雄鼠和雌鼠(已進行發情期制備)分別置于不同的觀察箱中適應環境，10～15分鐘后按雌雄比例1:2放入同一個觀察箱中，觀測1800s內雄性大鼠的爬背、插入和射精潛伏期以及爬背、插入和次數。若1800s內雄性大鼠未進行爬背，則該大鼠爬背潛伏期記為1800s，爬背次數記為0。插入與射精行為同理。在本發明實施例中，首先建造正常對照組(N)、異常黏液質證候組(ZM)和異常黏液質型病證組(BM)大鼠。在本發明實施例中，對所述N組、ZM組和BM組大鼠的獲取方法沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的建立異常黏液質證候動物模型的技術方案即可；在本發明實施例中，優選具體包括以下步驟：選擇性成熟期雌鼠，去勢手術后常規條件下飼養，將所述雌鼠在發情期與雄鼠進行交配實驗和APO實驗測試，得到有正常性功能的雄鼠。本發明對所述交配實驗和APO實驗的時間順序沒有特殊限制。所述交配實驗和APO實驗的對象為所述正常對照組和造模組大鼠。在本發明實施例中，所述交配的具體步驟優選為將已進行發情期的雄鼠和雌鼠分別置于不同的觀察箱中適應環境，10～15min后按雌雄比例1:2放入同一個觀察箱中，觀測1800s內雄性大鼠的爬背、插入和射精潛伏期以及爬背、插入和次數，若1800s內雄性大鼠未進行爬背，則該大鼠爬背潛伏期記為1800s，爬背次數記為0；插入與射精行為同理。本發明根據所述交配的結果將具有正常交配能力的雄鼠納入正常對照組和造模組，對無正常交配能力雄鼠進行淘汰。在本發明實施例中，所述APO實驗具體步驟優選為將實驗大鼠置于觀察箱中10～15min適應環境，保持安靜，調暗燈光，在大鼠頸項皮膚注射90μg/kg阿撲嗎啡APO，注射后立刻觀察，計時器計時，觀測并記錄1800s內大鼠的勃起潛伏期和勃起次數；所述勃起的標準為勃起時大鼠呈蹲踞位，陰莖體末端伸出，低頭舔舐陰莖頭；所述勃起潛伏期為注射后至第一次勃起的時間；所述勃起次數為注射后1800s內大鼠出現陰莖勃起的次數；若1800s內未見勃起，則該大鼠勃起次數記為0，勃起潛伏期記為1800s。本發明實施例中根據所述APO測試的結果將具有正常陰莖勃起功能的雄鼠納入正常對照組和造模組，對無正常陰莖勃起功能雄鼠進行淘汰。在本發明實施例中，所述90μg/kg阿撲嗎啡溶液優選包括90μg阿樸嗎啡溶解于0.5mg/kg維生素C和生理鹽水中，調整體積為5ml/kg。在本發明實施例中，所述正常對照組在常規環境中飼養，喂食的環境溫度為18～22℃，所述喂食環境的相對濕度為40～60％；造模組的喂食的環境溫度為8～12℃，所述喂食環境的相對濕度70～80％；正常對照組為普通飼料，造模組喂食飼料為濕寒性飼料。在本發明實施例中，所述生物學表征觀測是指定性和定量觀測和記錄。定性指標觀測：所述定性指標觀測為皮膚毛發在日光下觀察，情緒反應以一籠內各大鼠相互反應為主觀察30分鐘，行為狀態以此期間內的活動為主、安靜環境下觀察30分鐘，興奮程度以夾尾實驗時的反應為主，舌象舌苔在日光下觀察、記錄并拍照，飲食水狀態以各組同一時間喂飼觀察飲食水狀態，小便以各組大鼠當日正排尿時顏色為主，大便狀態以當日正排大便時大便形態為主；定量指標為避免生理節奏的影響，每天固定于20:00-22:00收集各項資料，其中體重：每天按規定時間稱重并記錄，以每籠總體重除以該籠大鼠只數，得出平均體重，并按下述公式得出模型組各籠體重比值并記錄，體重比值＝模型組平均體重-模型組初始體重/正常組平均體重-正常組初始體重；飲食量：每天20:00添加飼料300g，次日20:00稱食物余量，根據下述公式得出100g體重相對應的飲食量并記錄；飲水量：每天20:00給水500ml，次日20:00量剩余水量，計算得出100g體重相對應的飲水量并記錄；尿量：造模第一天記錄好給的干墊料重量，第二天按規定時間稱含有尿液及大便的濕墊料的重量并記錄，然后在恒溫鼓風干燥箱100℃下2小時烘干后再次稱重，計算各組尿量；大便量：計算100g體重相對應的大便量并記錄。得到有正常性功能(正常交配能力和陰莖勃起功能)的雄鼠后，本發明將得到的有正常性能的雄鼠分為正常對照組和造模組，所述正常對照組在常規環境下飼養，所述造模組以濕寒性飼料喂養，在濕寒環境中飼養，觀察并記錄正常組和造模組的生物學表征觀。包括定性指標和定量指標。定性指標觀測所有組大鼠的皮膚毛發、情緒反應、興奮程度、睡眠狀態、飲水狀態、尿量性質、大便狀態和舌象舌苔。定量指標為記錄所有組大鼠的體重、飲食量、飲水量、尿量和大便量。在造模過程中發現大鼠皮膚毛發稍暗淡，無光澤；倦怠，蜷臥少動；對刺激敏感，喜扎堆，倦怠嗜睡；無爭水現象；尿量清，色淡，量多；大便時軟時溏；舌苔暗，舌苔白膩。且隨著造模時間的延長，造模組體重增長緩慢，飲食量增加，飲水量減少，大小便量顯著增多，上述生物學表征符合維醫臨床證侯特點，從而獲得了異常黏液質證侯大鼠模型，且該模型具有良好的科學性、可靠性和穩定性。通過APO和交配實驗從證候模型組中篩選出異常黏液質型陽痿病證結合模型(陰莖勃起功能障礙和無交配能力)，從而獲得異常黏液質型陽痿病證動物模型。本發明對所述證候成模率達100％，病證模型成模率達到50％以上，病證模型的周期優選為22～25周。在本發明實施例中，所述N組的大鼠數量優選為10只。在本發明實施例中，所述常規環境下飼養的方法同上步驟中的常規環境飼養方法。本發明中，所述N組的喂養量優選為每日300g的普通飼料。所述普通飼料為包括500ml水和80g墊料。本發明對所述墊料沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的墊料即可。本發明中，所述的實驗組的大鼠的數量優選為20只。本發明中，所述的濕寒性飼料為菠菜實和芫荽實與常規飼料的混合物。在本發明實施例中，所述濕寒性飼料優選為：每1kg常規飼料中包括100～200g芫荽實和100～200g菠菜實，更優選每1kg常規飼料中包括150g芫荽實和150g菠菜實。本發明對常規飼料沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的用于飼養大鼠的飼料均可。本發明對所述菜實與芫荽實的來源也沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的菜實與芫荽實即可。在本發明實施例中，所述菜實與芫荽實的來源購自于新疆維吾爾自治區維吾爾醫院草藥房。本發明中，所述的濕寒性飼料的喂養量優選為每日300g。本發明中，所述濕寒環境的溫度優選為8～12℃，所述濕寒環境的濕度優選為70～80％。本發明對提供所述濕寒環境的設施沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的提供濕寒環境的設施即可。本發明中實例中，提供濕寒環境的設施為人工氣候箱。本發明中，所述濕寒性飼料喂養的時間優選為于北京時間09:00至21:00放入，其它時間放置于對照大鼠相同的飼養環境中飼養。本發明中，所述APO實驗和交配實驗的方法和驗證結果同上述APO實驗和交配實驗的方法和驗證結果。本發明對所述采血前優選對大鼠進行麻醉。本發明對所述麻醉的方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的麻醉方法即可。本發明實施例中，所述的麻醉方法為腹腔注射。本發明對所述麻醉過程中使用的麻醉劑優選為戊巴比妥鈉。所述的戊巴比妥鈉的來源購自和田維吾爾藥業有限責任公司。在本發明實施例中，所述采集外周血的具體方法優選為將麻醉后的大鼠快速從腹主動脈取血。在本發明實施例中，所述分離血清的方法優選為將新鮮大鼠全血立即置4℃環境，30～40min后以3000～3500rpm的速度離心5～10min，將得到的上清液在4℃條件下，以3000～3500rpm的速度再次離心，得到血清，將最終離心得到的血清放置于-80℃超低溫冰箱備用。所述的4℃環境優選為4℃冰箱。得到陰莖平滑肌組織的方法具體是：從根部取陰莖平滑肌組織，洗去血漬，并除去殘余皮膚、筋膜，取上段陰莖平滑肌組織，放置于凍存管中放置于-80℃超低溫冰箱備用。得到血清和陰莖平滑肌組織后，本發明實施例對血清和組織中提取蛋白質，檢測，得到已知濃度血清和陰莖平滑肌組織蛋白質。本發明實施例中，在提取蛋白前優選按照組別分別進行混樣，得到三組血清樣品和三組陰莖平滑肌組織樣品。本發明實施例對所述提取蛋白質的方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的提取蛋白質的方法即可。本發明實施例中，所述提取蛋白質的方法為TCA-丙酮沉淀法。本發明實施例中，所述檢測優選包括對蛋白質含量的檢測和對蛋白質完整性的檢測。本發明實施例中，所述對蛋白質含量的檢測方法優選為Bradford法，所述對蛋白質完整性的檢測方法優選為SDS-PAGE法。得到已知濃度的蛋白質后，本發明實施例對所述蛋白質用iTRAQ標記試劑盒標記，得到標記的蛋白質，經純化，得到純化后肽段。在本發明實施例中，在所述標記前優選將得到的已知濃度的蛋白質進行消化。本發明實施例對所述消化的方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的蛋白質消化方法即可。在本發明實施例所述消化采用胰蛋白酶消化法。本發明實施例對所述iTRAQ標記試劑盒的來源沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的iTRAQ標記試劑盒的市售商品即可。本發明實施例使用的試劑盒為Reagent-8PlexMultiplexKit(AppliedBiosystem)8標iTRAQ試劑，其中包括8種等量的同位素試劑(報告基團質量113-121，不包括120)，能對蛋白質酶解后肽段進行標記，從而結合串聯質譜等方法，可以對肽段進行精確鑒定和定量。在本發明實施例中，所述純化優選采用HPLC進行肽段的純化。所述進行純化的儀器采用型號為(發明人提供)安捷倫常規液相。本發明實施例中使用SCX強陽離子交換柱分離，在pH＝3磷酸緩沖液中，使用20％-30％的梯度洗脫液(10mMKH2PO4,2MKCl,25％ACN，pH＝3)，洗脫條件和梯度參考儀器和耗材具體操作說明即可，洗脫消化后的肽段。洗脫后的跳段使用C18反相色譜脫鹽處理。得到純化肽段后，本發明實施例對所述純化的肽段經質譜檢測后得到質譜總圖，將所述指紋圖譜在PD軟件中篩選，在本發明實施例中，所述質譜檢測的儀器采用型號為ThermofisherQ-Exactive的質譜儀。在本發明實施例中，所述PD軟件的版本為ProteomeDiscoverer1.3，購自美國thermo公司。本發明實施例中，質譜篩選的參數如下：母離子質量范圍350Da-6000Da二級質譜圖中最小峰數10信噪比S/N域值1.5PD提取后的譜圖，用mascot搜索，得到搜索結果，使用PD軟件根據mascot搜索結果和第一步篩選后的譜圖進行定量分析。定性檢索參數如下：注：Fixedmodification是固定修飾；Carbamidomethyl(C)是還原烷基化處理后，半胱氨酸產生的脲甲基化。Variablemodification是可變修飾；Oxidation(M)是蛋氨酸的氧化；Gln→Pyro-Glu(N-termQ)是指肽段N端存在谷氨酰胺時，可能會產生自身環化，變成谷氨酸；iTRAQ8plex(K)，iTRAQ8plex(Y)，iTRAQ8plex(N-term)是iTRAQ試劑在不同位置的結合。peptidetol是一級質譜的精度。MS/MStol是二級質譜的精度。Maxmissedcleavages是酶解時最大允許漏切的數目。Enzyme是實驗所使用的酶種類。Database是檢索使用的數據庫。Timefilescompressed為數據庫建立時間。Numberofsequences為數據庫中序列數。定量檢索參數如下：注:ProteinratioType：用來定量的肽段取值方法，median指的是取中位置的方法。Minimumpeptides：用來定量的最少的uniquepeptide數Normalisationmethod：矯正方法，median指的是選取一組樣品中全部可定量蛋白的中位值來做矯正。P-value蛋白可信度評估，小于0.05代表蛋白可信度大于95％。根據所述搜索結果和篩選后的譜圖定量分析，得到的分析數據在大鼠數據庫Uniprot-2014-rat(血清)和Uniprot-2015-rat(組織)中檢索，血清總蛋白為318種，組織總蛋白為844種，FDR<1％，具體見下表。注：Allspectra為全部的譜圖數；Matchedspectra為匹配上的譜圖數；Peptide為肽段種類數；ProteinGroup為匹配上的蛋白總數；FDR為假陽性率，本實施例使用的是假陽性率小于1％來過濾結果。按照軟件操作規程，使用相同參數及方法，鑒定篩選獲得大鼠血清蛋白質318種和陰莖平滑肌組織蛋白844種。得到的三組(N、ZM和BM)血清和組織蛋白質后，本發明實施例對所述三組蛋白質進行維醫異常黏液質型陽痿病證的哺乳動物血清差異蛋白和陰莖平滑肌組織差異蛋白的篩選。本發明實施例對所述異常黏液質型病證組血清和陰莖平滑肌組織差異蛋白蛋白的差異蛋白的篩選方法具體是：所述BM組與ZM組的血清蛋白質相比較，得到BM/ZM的血清差異蛋白質；將BM組的與N組的血清蛋白質相比較，得到BM/N的血清差異蛋白質；統計所述BM/ZM和BM/N的差異蛋白的共同蛋白的種類和數量，得到異常黏液質型陽痿病證組的血清差異蛋白質；所述BM組和與ZM組的陰莖平滑肌蛋白質相比較，得到BM/ZM組陰莖平滑肌差異蛋白質；將BM組的蛋白質與N組的陰莖平滑肌蛋白質相比較，得到BM/N的陰莖平滑肌組織差異蛋白質；統計所述BM/ZM組和BM/N組的差異蛋白的共同蛋白的種類和數量，得到異常黏液質型陽痿病證組的陰莖平滑肌組織差異蛋白質；以下通過具體實施例進一步說明本發明的技術方案。實施例11、造模與分組選用性成熟期雌鼠15只，去勢手術后正常條件下飼養，交配實驗備用。將雄性大鼠經與發情期雌鼠進行交配試驗并結合APO勃起實驗證實其具有正常性功能(無正常性功能者淘汰)，取30只進入實驗，從中再隨機抽取10只大鼠設為正常對照組，飼養于常規環境下，溫度18～22℃，溫度喂養，環境相對濕度40～60％，余20只為造模組，以濕寒性飼料喂養，按維吾爾醫學對環境的看法采用人工氣候箱進行造模，設置溫度：8～12℃，濕度為70～80％，12/12小時晝夜交替飼養，其它時間放置于正常組大鼠相同的飼養環境中飼養。當造模組鼠出現皮膚毛發稍暗淡，無光澤；倦怠，蜷臥少動；對刺激敏感，喜扎堆，倦怠嗜睡；無爭水現象；尿量清，色淡，量多；大便時軟時溏；舌苔暗，舌苔白膩。且隨著造模時間的延長，與對照組相比，造模組體重增長緩慢，飲食量增加，飲水量減少，大小便量顯著增多，上述生物學表征符合維醫臨床證侯特點，從而獲得了異常黏液質證侯大鼠模型，且該模型具有良好的科學性、可靠性和穩定性。通過APO和交配實驗從證候模型組中篩選出無陰莖勃起功能和交配能力雄性大鼠，獲得異常黏液質型陽痿病證動物模型。本發明對所述模率達到50％,以上病證模型的周期優選為22～25周。從造模第一周開始每周記錄大鼠的生物學表征，根據生物學表征確定異常黏液質證候模型成模情況，本發明對所述證候模率達到100％的周期優選為8-10周。并在此基礎上，每月進行一次APO實驗及交配實驗，APO實驗通過統計勃起的次數和勃起潛伏期，判斷陰莖勃起功能，交配實驗通過統計爬被潛伏期/次數、插入潛伏期/次數和射精潛伏期/次數這幾項指標判斷大鼠的交配能力，當出現陰莖勃起功能障礙和交配能力障礙，即陽痿病證成模率達到50％以后，從異常黏液質證候模型組中通過APO實驗及交配實驗篩選陽痿病證大鼠，并納入BM組，余為ZM組。2、外周血采集、組織樣品取材與保存：戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，快速從腹主動脈取血，將新鮮大鼠全血立即置4℃冰箱，30分鐘后以3000rpm的速度離心5min，吸取上清液，再置高速低溫離心機，在4℃條件下，以3000rpm的速度離心再吸取上清液后，分裝置-80℃低溫冰箱保存備用。從根部取陰莖平滑肌組織，洗去血漬，并除去殘余皮膚、筋膜，取上段陰莖平滑肌組織，放置于凍存管中放置于-80℃超低溫冰箱備用。3、蛋白質組樣品的制備蛋白質提取方法采用TCA-冰丙酮提取。4、iTRAQ標記及HPLC(1)iTRAQ標記：取各組大鼠血清和陰莖平滑肌組織，按組別混樣后，提取各組蛋白質，通過SDS檢測蛋白的完整性及使用Bradford法對蛋白進行定量。蛋白質經Trypsin消化后用ITRAQ標記試劑盒(Reagent-8PlexMultiplexKit(AppliedBiosystem))進行標記，后經HPLC(安捷倫常規液相)進行肽段的純化；三組大鼠的血清蛋白質的濃度如表1所示，組織蛋白質的濃度如表2所示。從附圖3中SDS-PAGE凝膠電泳圖片來看，提取的三組蛋白質完整性較好，可以用于下游實驗。表1Bradford法對大鼠血清蛋白進行定量結果樣品名稱NBMZM濃度(μg/μL)0.260.390.42表2Bradford法對大鼠陰莖平滑肌組織蛋白進行定量結果樣品名稱NBMZM濃度(μg/μL)1.751.291.46定量后，將各組蛋白質消化后，用ITRAQ標記試劑盒。液相純化后的肽段經質譜(ThermofisherQ-Exactive質譜儀)檢測后獲得指紋圖譜，將質譜圖輸入到PD(ProteomeDiscoverer1.3，thermo)軟件后，軟件先對質譜譜圖進行篩選鑒定，種類，名稱，PD提取后的譜圖用mascot進行搜索，搜索結束后，PD軟件根據mascot搜索結果和第一步篩選后的譜圖進行定量分析，最后檢索大鼠數據庫，獲得最終鑒定到大鼠血清和陰莖平滑肌組織蛋白質分別為318種和844種，具體參數如下。本發明實施例中，質譜篩選的參數如下：母離子質量范圍350Da-6000Da二級質譜圖中最小峰數10信噪比S/N域值1.5PD提取后的譜圖，用mascot搜索，得到搜索結果，使用PD軟件根據mascot搜索結果和第一步篩選后的譜圖進行定量分析。定性檢索參數如下：注：Fixedmodification是固定修飾；Carbamidomethyl(C)是還原烷基化處理后，半胱氨酸產生的脲甲基化。Variablemodification是可變修飾；Oxidation(M)是蛋氨酸的氧化；Gln→Pyro-Glu(N-termQ)是指肽段N端存在谷氨酰胺時，可能會產生自身環化，變成谷氨酸；iTRAQ8plex(K)，iTRAQ8plex(Y)，iTRAQ8plex(N-term)是iTRAQ試劑在不同位置的結合。peptidetol是一級質譜的精度。MS/MStol是二級質譜的精度。Maxmissedcleavages是酶解時最大允許漏切的數目。Enzyme是實驗所使用的酶種類。Database是檢索使用的數據庫。Timefilescompressed為數據庫建立時間。Numberofsequences為數據庫中序列數。定量檢索參數如下：參數名稱實驗選項ProteinratioTypemedianMinimumpeptides1NormalisationmethodmedianP-value<0.05注:ProteinratioType：用來定量的肽段取值方法，median指的是取中位置的方法。Minimumpeptides：用來定量的最少的uniquepeptide數Normalisationmethod：矯正方法，median指的是選取一組樣品中全部可定量蛋白的中位值來做矯正。P-value蛋白可信度評估，小于0.05代表蛋白可信度大于95％。根據所述搜索結果和篩選后的譜圖定量分析，得到的分析數據在大鼠數據庫(Uniprot-2014-rat(血清)和Uniprot-2015-rat(組織))中檢索，獲得血清總蛋白為318種，組織總蛋白844種，FDR<1％，具體見下表。注：Allspectra為全部的譜圖數；Matchedspectra為匹配上的譜圖數；Peptide為肽段種類數；ProteinGroup為匹配上的蛋白總數；FDR為假陽性率，本實施例使用的是假陽性率小于1％來過濾結果。按照軟件操作規程，使用相同參數及方法，鑒定篩選獲得大鼠血清蛋白質318種，組織蛋白844種。5、維醫異常黏液質型陽痿病證大鼠模型血清及組織候選差異蛋白的篩選方法(1)維醫異常黏液質型陽痿病證大鼠模型血清差異蛋白的篩選方法將BM組與ZM組的血清蛋白質相比較，使用上述軟件(取差異大于等于1.2倍，p值小于等于0.05)，比較得到BM/ZM的血清差異蛋白質；將BM組與N組的血清蛋白質相比較，，使用上述軟件(取差異大于等于1.2倍，p值小于等于0.05)，得到BM/N的血清差異蛋白質；統計所述BM/ZM和BM/N的差異蛋白的共同蛋白的種類和數量，得到異常黏液質型病證組的血清差異蛋白質共計35種，如下表3，其中上調表達蛋白31種，下調表達蛋白4種：表3異常粘液質型陽痿病證大鼠模病證組血清差異蛋白(2)維醫異常黏液質型陽痿病證大鼠模型陰莖平滑肌組織差異蛋白的篩選方法使用上述軟件(取差異大于等于1.2倍，p值小于等于0.05)，將BM組與ZM組的陰莖平滑肌組織蛋白質相比較，得到BM/ZM的陰莖平滑肌組織差異蛋白質；將BM組與N組的陰莖平滑肌組織差異蛋白質相比較，得到BM/N的陰莖平滑肌組織差異蛋白質；統計所述BM/ZM和BM/N的差異蛋白的共同蛋白的種類和數量，得到異常黏液質型病證組的陰莖平滑肌組織差異蛋白質共計48種，其中上調表達蛋白35種，下調表達蛋白13種。如表4所示：表4異常粘液質型陽痿病證大鼠模型組織病證組候選差異蛋白6、異常粘液質型陽痿病證大鼠模型血清候選差異蛋白的ELISA檢測隨機選擇7種血清候選差異蛋白，對異常黏液質型陽痿病證大鼠模型與對照組進行ELISA檢測，以驗證本發明血清候選差異蛋白是否可以作為異常黏液質型陽痿病證的標志物：即隨機選擇檢測第11號蛋白P48199(c反應蛋白)；第13號蛋白P26644(β-2-糖蛋白1)；第15號蛋白P20059(血紅素結合蛋白)；第24號蛋白P04916(視黃醇結合蛋白4)；第26號蛋白P02767(甲狀腺素運載蛋白)；第27號蛋白P02764(α-1-酸性糖蛋白)和第33號蛋白O35460(血管生成素-1)分別使用雙抗夾心試劑盒(大鼠C反應蛋白(CRP)雙抗夾心試劑盒：伊萊瑞特生物科技有限公司；大鼠β2糖蛋白1(APOH)雙抗夾心試劑盒：武漢優爾生商貿有限公司；大鼠血紅素結合蛋白(HPx)雙抗夾心試劑盒：Abcam艾博抗(上海)貿易有限公司；大鼠視黃醇結合蛋白4(RBP4)雙抗夾心試劑盒：伊萊瑞特生物科技有限公司；大鼠甲狀腺素運載蛋白(TTR)雙抗夾心試劑盒：Abnova亞諾法生技股份有限公司；大鼠α1酸性糖蛋白(α1AG)雙抗夾心試劑盒：Abcam艾博抗(上海)貿易有限公司；大鼠血管生成素1(Ang-1)雙抗夾心試劑盒：Raybiotech瑞博奧(廣州)生物科技有限公司；按照試劑盒說明書對正常對照組和病證組大鼠血清進行ELSA檢測。測定結果如圖4A-G所示，由圖4可知，各個異常黏液質型陽痿病證大鼠模型血清候選蛋白中除血管生成素-1的含量顯著低于對照組外，其它蛋白質含量均顯著高于對照組，這與iTRAQ結果相符，說明本發明方法獲得蛋白標志物可以作為異常黏液質型陽痿病證的血清的生物標志物。與iTRAQ結果相符，說明可以作為異常黏液質型陽痿病證血清的生物標志物，具體結果見下表：各組大鼠血清中蛋白含量與N組相比*P<0.057.異常粘液質型陽痿病證大鼠模型陰莖平滑肌免疫組織化學檢測隨機選擇4種陰莖平滑肌組織候選差異蛋白，對異常黏液質型陽痿病證大鼠與對照組大鼠陰莖平滑肌組織進行免疫組織化學檢測，以驗證本發明組織中的候選差異蛋白是否可以作為異常黏液質陽痿病證的標志物：即隨機選擇檢測第12號蛋白Q9Z2L0(電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白1)；第30號蛋白P02625(小清蛋白α)；第36號蛋白P04904(谷胱甘肽S-轉移酶α-3)和第44號蛋白P47853(雙鏈蛋白聚糖)分別使用上述蛋白的抗體(所有抗體均購置于Abcam(上海)貿易有限公司)，按照抗體說明書對正常對照組和病證組大鼠陰莖平滑肌組織進行檢測。運用光學顯微鏡觀察并統計結果。照片放大倍數為物鏡倍數×目鏡倍數。染色結果計數方法如下：在放大倍數為400的情況下，每個樣本隨機選擇6-10個視野，各視野之間完全不重疊，計數陽性細胞，每組一般為10個不同樣本，隨后進行組間的比較。評分方法分為兩個方面，即陽性范圍和著色強度。其中陽性細胞所占視野中的百分比為陽性范圍5％-100％；陽性細胞染色的深淺為著色強度，分為4個等級，即0(幾乎不著色或者稍微有一點著色)、1(有著色，但比較淺)、2(有著色，比較深)、3(有著色，非常深)；最終結果為(陽性范圍×著色強度)/視野個數。測定結果如表5所示，由表5可知，各個異常黏液質型陽痿病證大鼠模型的陰莖平滑肌組織候選蛋白中電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白1和小清蛋白α的含量顯著高于正常對照組，谷胱甘肽S-轉移酶α-3和雙鏈蛋白聚糖的含量顯著低于正常對照組，這與iTRAQ結果相符，說明本發明方法獲得蛋白標志物可以作為異常黏液質型陽痿病證的陰莖平滑肌組織的生物標志物。表5各組大鼠陰莖組織中蛋白表達結果*與N比較<0.05以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3