本發明涉及一種檢測痕量Fe(II)的毛細管電泳方法，具體涉及一種在高濃度三價鐵離子Fe(III)背景下測定痕量二價鐵離子Fe(II)量的毛細管電泳新方法，屬于分析測試技術領域。

背景技術：

二次鋰離子電池因比能量高、使用壽命長、工作電壓高等一系列優點而得到廣泛應用,是現代高性能電池的代表，尤其在當今世界石油資源日漸緊張，環境污染日趨嚴重情況下，動力鋰離子二次電池越來越受關注。橄欖石型的磷酸鐵鋰(LiFePO₄)由于具有價格便宜、環境友好、循環性及倍率性能高成為最有潛力的鋰離子電池正極材料。

磷酸鐵是制備鋰離子電池材料磷酸鐵鋰的重要原料，其純度對產品磷酸鐵鋰的結晶度和純度有很大的影響，并最終影響到電池材料的電化學性能。特別是磷酸鐵中痕量二價鐵離子Fe(II)，在后續磷酸鐵鋰制備過程中有可能成為磁性物，從而對該批次電池材料的使用留下安全隱患。

磷酸鐵中痕量Fe(II)的監測分析因為高背景Fe(III)的存在一直是磷酸鐵鋰電池生產中的一個難題，也未有相應的標準方法。專利201310096378.1中，用席夫堿化合物2-吡啶甲醛-對苯二腙作為三價鐵Fe(III)的絡合劑，且二價鐵不會參與絡合，專利利用此選擇性絡合從而可以選擇性地以熒光光度計定量測試三價鐵含量，但優選測定三價鐵離子濃度在5×10^-7～5×10^-5mol/L，該標準遠低于實際商品化LiFePO₄中三價鐵離子的含量；專利201110168689.1中，利用三價鐵可以與磺基水楊酸絡合，使用分光光度計測試。但是該方法不適用于在大量二價鐵環境中選擇性測試三價鐵；專利201210339919.4中，使用鄰二氮菲作為絡合劑進行磷酸鐵鋰中三價鐵離子Fe(III)的測試，但該方法存在方法復雜，結果精確度不高的缺點。而其他常用方法如電感耦合等離子體原子發射光譜法(ICP-AES)對元素價態無法區分，化學滴定則不能實現微量檢測。

因此，目前痕量Fe(II)的監測分析方法主要存在以下問題：一是目前二價鐵離子Fe(II)測試方法中，Fe(II)的檢測限較高，其結果不夠準確；二是在高三價鐵離子Fe(III)的背景下，目前測試方法中多采用價態轉移的方法，測試得到總鐵含量。而沒有其他技術手段將不同價態的區分開來，在實際應用中有較多限制。

技術實現要素：

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種檢測痕量Fe(II)的毛細管電泳方法，利用鄰二氮菲與Fe(II)離子的高特異性絡合作用，結合毛細管電泳強大的分離功能和在線富集技術，建立了一種快速、簡便且高效的測定Fe(II)的毛細管電泳新方法，并成功應用于磷酸鐵樣品中(大量Fe(III)背景下)痕量Fe(II)含量的測定，毛細管區帶電泳(CZE)和場放大進樣(FESI)的檢測限分別為0.4μM和2.5nM，這是目前技術水平所不能達到的，從而本發明能夠在需要更高精度，特別是電池級原料不同痕量元素(包括不同價態的同種元素)的檢測中應用。

本發明的目的是通過下述技術方案實現的：

一種檢測痕量Fe(II)的毛細管電泳方法，包括如下步驟：

1)采用純濃鹽酸將磷酸鐵樣品溶解，至溶液變澄清后，再用純凈水稀釋至所需濃度，制備得到待測液A(即待測樣品稀釋液)；

2)配制二價鐵離子Fe(II)含量為0.0～2.0μg/mL的標準溶液；

3)利用毛細管區帶電泳(CZE)方法或場放大進樣(FESI)方法測試待測液A的吸光度；

4)利用以下公式計算磷酸鐵樣品中的二價鐵離子Fe(II)含量：

其中，Fe(II)％表示待測液A中二價鐵離子Fe(II)的百分含量；

A表示所述待測液A對應的吸光度；

A₁表示二價鐵離子Fe(II)含量為C₁的標準溶液對應的吸光度，A₂表示二價鐵離子Fe(II)含量為C₂的標準溶液對應的吸光度。

進一步地，步驟1)中所述純濃鹽酸的摩爾濃度為10-12mol/L。

進一步地，利用毛細管區帶電泳方法測試待測液A的吸光度包括：將步驟1)制備的待測液A與添加劑CTAB和鄰二氮菲加入到緩沖液中，測試待測液A的吸光度。

進一步地，所述添加劑CTAB在緩沖液中的終濃度為0.02～2mM，所述鄰二氮菲在緩沖液中的終濃度為0.1～100mM。

進一步地，選擇pH為5.0，摩爾濃度為100mM的醋酸鈉溶液作為緩沖液。

進一步地，利用場放大進樣方法測試待測液A的吸光度包括：在進樣之前引入一段0.5psi×5s的水柱以提高進樣效率，測試待測液A的吸光度。

進一步地，場放大進樣方法的進樣條件為在2kV的條件下進樣1.5min。

進一步地，場放大進樣方法中，整個測試過程中毛細管恒溫在25℃，檢測波長設置為266nm，所有的測定均重復至少三次。

由于采用本發明的技術方案，本發明較現有技術具有以下優點：

1、本發明所采用的鄰二氮菲與Fe(III)和Fe(II)絡合的穩定常數相差近7個數量級(lgβ₃(Fe³⁺)＝14.1，lgβ₃(Fe²⁺)＝21.3)，十分有利于鄰二氮菲在大量Fe(III)的背景中絡合痕量Fe(II)。

2、結合毛細管電泳的強大分離功能和在線樣品富集技術，可在最大1000倍當量的Fe(III)背景中測定出痕量Fe(II)，檢測靈敏度可達2.5nM。

3、本發明測量磷酸鐵中二價鐵離子Fe(II)的含量穩定性好，精密度高，具有重要的工業應用價值。由于毛細管電泳具有高效、快速、靈敏及高度自動化等特點，且所需樣品量和溶劑消耗少、對環境污染小，通過結合在線樣品富集技術，被廣泛用于低濃度離子的檢測，例如生物細胞中微量金屬離子的檢測、空氣中金屬離子檢測、礦物中金屬的含量測定以及藥品中有效成分的測定等。

附圖說明

圖1.CZE模式下不同的電泳緩沖液pH值對[Fe(phen)3]²⁺出峰的影響。樣品溶液：50μM FeSO₄+5mM Fe₂(SO₄)₃+1mM phen。實驗條件：電泳緩沖液，100mM醋酸鈉緩沖液+0.2mM CTAB混合溶液；壓力進樣，0.5psi×5s；分離電壓，-30kV。

圖2.CZE模式下采用不同濃度的醋酸鈉緩沖液的電泳圖。實驗條件：電泳緩沖液，pH為5.0的醋酸鈉緩沖液+0.2mM CTAB。樣品溶液及其他實驗條件同圖1。

圖3(a).CZE模式下電泳緩沖液中添加CTAB的電泳圖；圖3(b).CZE模式下電泳緩沖液中未添加CTAB的電泳圖。實驗條件：電泳緩沖液，100mM醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)+0.2mM CTAB。樣品溶液及其他實驗條件同圖1。

圖4.CZE模式下電泳緩沖液中添加了不同濃度CTAB的電泳圖。實驗條件：電泳緩沖液，100mM醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)。樣品溶液及其他實驗條件同圖1。

圖5.FESI過程中采用不同進樣電壓的電泳圖。樣品溶液：10nM FeSO₄+10μM Fe₂(SO₄)₃+10μM phen。實驗條件：電泳緩沖液，100mM醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)+0.2mM CTAB；進樣時間，1.5min；分離電壓，-30kV。

圖6.FESI過程中采用不同進樣時間的電泳圖。實驗條件：進樣電壓，+2kV。樣品溶液及其他實驗條件同圖5。

具體實施方式

下面通過實施例進一步詳細描述本發明的方法，但這并非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的范圍之內。

實施例

1、主要試劑及溶液制備

硫酸鐵和醋酸鈉購自西隴化學試劑有限公司(廣州，中國)，七水硫酸亞鐵購自北京化工廠(北京，中國)，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)購自百靈威科技有限公司(北京，中國)，鄰二氮菲購自國藥集團化學試劑有限公司(北京，中國)。緩沖液以及樣品溶液均由娃哈哈純凈水(杭州，中國)配制。鄰二氮菲和CTAB每周分別配制10mM、20mM的母液，待稀釋使用，Fe(II)(10mM，七水硫酸亞鐵的水溶液)和Fe(III)(10mM，硫酸鐵的水溶液)溶液每天配制，實驗中所用到的其他試劑均為分析純，且在使用時不需要進一步純化。

2、實驗器材

本發明使用的毛細管為無涂層熔融石英毛細管(Polymicro Technologies，美國)，內徑50μm，外徑365μm，長60cm(有效長度56cm)。新毛細管在使用前，依次用1.0M的鹽酸沖洗5min，純水沖洗5min，1.0M的氫氧化鈉沖洗10min，純水沖洗5min，緩沖溶液沖洗30min。隨后，毛細管將在緩沖液環境中加電平衡15min。為了保證方法的重現性，每次進樣前使用緩沖溶液沖洗2min。

所有實驗均在配備二極管陣列紫外檢測器(DAD)的P/ACE MDQ毛細管電泳儀上(Beckman coulter公司，美國)進行，使用32Karat軟件(8.0版)采集數據和控制儀器。

3、實驗流程

不同濃度的Fe(II)、Fe(III)和鄰二氮菲的混合液由母液經純凈水稀釋得到。在場放大進樣(FESI)過程中，樣品以電動進樣方式引入毛細管，對于進樣時間和進樣電壓均進行了優化，進樣之前向毛細管中引入一段0.5psi×5s的水柱。整個實驗過程中毛細管恒溫在25℃，檢測波長設置為266nm，所有的測定均重復至少三次。

4、毛細管區帶電泳(CZE)分離條件優化

本實施例在CZE模式下對分離條件進行了優化，包括緩沖體系的選擇、緩沖液的pH和濃度以及添加劑的優化等。

在嘗試了不同的緩沖液體系如磷酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPs)緩沖液和醋酸緩沖液之后，最終選擇了醋酸緩沖液作為背景電解質。

緩沖液的pH對鄰二氮菲與Fe(II)離子的絡合存在一定的影響，也影響到所形成的絡合物的穩定性。本實驗嘗試了5種pH條件下Fe(II)離子的檢測，結果見圖1。從圖中可以看出，隨著pH值的降低，絡合物峰的拖尾越發嚴重，甚至出現雜峰。而基本沒有拖尾現象的pH 5.0與pH 5.5條件相比，峰面積更大，因此，最終選擇的緩沖液的pH為5.0。

另外，緩沖液的濃度也會對遷移率和分離效率產生影響。實驗選擇了50、100、150mM三個不同濃度的醋酸鈉緩沖液，結果如圖2所示。圖2表明，隨著緩沖液濃度的升高，分析時間不斷增加，而且基線也越來越差。而當濃度為50mM時，絡合物的峰與前面鄰二氮菲的峰離得太近，不利于后續要進行的富集實驗，因此，最終選擇100mM的醋酸鈉緩沖液。

在最初的實驗中，發明人發現目標物的峰型總是存在峰拖尾現象，為此嘗試了許多解決方案，例如將鄰二氮菲加入背景電解質或樣品中，改變分離電壓，加入添加劑等。最終發現，向背景電解質中添加CTAB，不僅對峰型有很大的改善，而且峰面積也得到了很大的提高。CTAB是一種陽離子型表面活性劑，可以動態吸附在帶負電的毛細管內壁上，改變內壁所帶電荷，從而改變電滲流的方向。

圖3為緩沖液中添加(圖3(a))或不添加CTAB(圖3(b))所得的電泳圖，因電滲流的方向改變，因此兩者的出峰順序相反?？梢钥闯觯砑覥TAB的電泳圖中，絡合物峰的峰型很好，峰面積也增大，這可能是由于CTAB對Fe(II)離子與鄰二氮菲的絡合具有一定的促進作用。

之后，對CTAB的濃度也進行了優化，圖4給出了四個不同濃度CTAB下的電泳圖，可以看出，除了0.2mM，在其他濃度下峰都有輕微拖尾現象，因此，最終選擇0.2mM CTAB作為緩沖液添加劑。

在CZE模式下完成條件優化后，做出了CZE的工作曲線，結果如表1所示。

5、場放大進樣(FESI)富集條件優化

由于毛細管光程的限制無法在常規進樣的條件下獲得較高的檢測靈敏度，本實施例采用了富集效率較高的FESI富集技術來對樣品溶液進行在線富集，以大幅度提高檢測靈敏度。對于FESI來說，進樣電壓與進樣時間是非常重要的兩個參數。盡管較長的進樣時間或較大的進樣電壓均會增加[Fe(phen)₃]²⁺的進樣量，從而提高檢測的靈敏度，但進樣量過大的同時因為擴散的緣故也會造成峰展寬。而且，在本實驗中，加入了陽離子表面活性劑CTAB，電滲流的方向與的[Fe(phen)₃]²⁺遷移方向相反，因此，在進樣過程中，為了確保[Fe(phen)₃]²⁺的遷移速率大于電滲流的速率，進樣電壓不能太大。進樣電壓和進樣時間的優化結果分別如圖5和圖6所示。

從圖5可以看出，在進樣電壓高于2kV時，峰面積反而變小，這是由于電滲流的速率高于[Fe(phen)₃]²⁺的遷移速率，導致進樣量變小。考慮到峰形、靈敏度等因素，最終確定的最佳進樣條件為在2kV的條件下進樣1.5min。

在FESI過程中，進樣之前引入一段水柱有助于提高進樣效率，同時，水柱的引入也有助于提高結果的重現性。因此，在進樣之前引入0.5psi×5s的水柱。

在經過優化后的富集條件是在2kV的條件下進樣1.5min，并在優化條件下做出了FESI的工作曲線，結果如表1所示。

表1兩種方法的線性回歸分析和檢測靈敏度

A——峰面積(mAU·s)；a,c——Fe(II)濃度(nM)，共存10μM Fe(III)；b,c——Fe(II)濃度(μM)，共存1mM Fe(III)。

表1中列出了兩種方法CZE和FESI的工作曲線關系式、檢出限、線性范圍等參數，可以看出富集方法的使用，使靈敏度提高了至少兩個數量級。

6、磷酸鐵樣品的測定

準確稱取約0.2g磷酸鐵樣品置于5mL離心管中，加入1.0mL優級純濃鹽酸(12M)，約5h后樣品完全溶解，溶液變澄清，再用純凈水稀釋至所需濃度待測。

取Fe(II)(10mM)，Fe(III)(10mM)和鄰二氮菲(10mM)母液配制成二價鐵離子Fe(II)含量為0.0μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL、和2.0μg/mL的標準溶液；在可見分光光度計上，在測量波長266nm下測量各標準溶液的吸光度并得出工作曲線。

由于CZE和FESI的檢測靈敏度差異較大，CZE所測的樣品為用純凈水稀釋到1μg/mL，FESI所測的樣品為用純凈水10ng/mL。

在用毛細管區帶電泳(CZE)方法進行檢測時，將待測樣品與CTAB和鄰二氮菲加入到pH為5.0，濃度為100mM的醋酸鈉緩沖液中，CTAB終濃度為0.2mM，鄰二氮菲的終濃度為1.0mM；壓力進樣，0.5psi×5s；分離電壓，-30kV，測量待測樣品的吸光度。

在用場放大進樣(FESI)方法進行檢測時，進樣之前向毛細管中引入一段0.5psi×5s的水柱，將待測樣品與CTAB和鄰二氮菲加入到pH為5.0，濃度為100mM的醋酸鈉緩沖液中，CTAB終濃度為0.2mM，鄰二氮菲的終濃度為1.0mM；以電動進樣方式在2kV的條件下進樣1.5min，測量待測樣品的吸光度。整個實驗過程中毛細管恒溫在25℃，檢測波長設置為266nm，所有的測定均重復至少三次。

利用公式計算磷酸鐵樣品中的二價鐵離子Fe(II)含量。

這兩種方法的定量分析結果和檢測回收率如表2所示。

表2兩種方法測定的磷酸鐵樣品結果

從表中可以看出，兩種不同的方法測出的磷酸鐵樣品中的Fe(II)含量差異不大，且分別獲得了87％-95％和93％-108％的高回收率，這證明了方法的可靠性，也顯示了這兩種方法均能夠在大量Fe(III)背景中可靠地測定出Fe(II)的含量。