本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，具體是一種青霉素檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

抗生素作為一種主要的代表性獸藥，在食品安全及世界貿(mào)易迅速發(fā)展的今天，受到了廣泛的關(guān)注，目前對(duì)其檢測(cè)仍然主要集中在動(dòng)物源性食品中，主要的檢測(cè)方法有高效液相色譜法，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，毛細(xì)管電泳法，酶聯(lián)免疫法。抗生素菌渣是抗生素生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中的廢棄物，底物主要由大豆、花生餅、玉米蛋白、淀粉等組成，外觀呈豆腐渣樣，氣味因培養(yǎng)的菌類不同而異；內(nèi)部含粗蛋白、脂肪、糖份等營(yíng)養(yǎng)成分以及水和少量的抗生素殘留成份，當(dāng)環(huán)境溫度在15～20℃時(shí)24小時(shí)、25～0℃時(shí)3小時(shí)會(huì)變臭液化，遇水、雨、雪、霧或蒸汽時(shí)會(huì)加速液化變質(zhì)。一般每100m3的發(fā)酵液可形成約30～40m3的濕菌渣，據(jù)有關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，我國(guó)年排放量約為100萬(wàn)噸以上。由于藥渣黏度大，不能排入下水道，只能占用土地堆放。如果這些藥渣不能被無(wú)害化處置利用，不僅會(huì)浪費(fèi)大量資源，而且會(huì)污染生態(tài)環(huán)境。過(guò)去一直對(duì)菌渣采用干燥加工處理后作為飼料或飼料添加劑使用。但是，目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥渣中的微量抗生素容易在被飼喂的畜禽體內(nèi)殘留，長(zhǎng)期食用這種含有藥物殘留的動(dòng)物源性食品，會(huì)對(duì)人類肝臟造成損傷。章明奎等人對(duì)抗生素誘導(dǎo)土壤可培養(yǎng)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性進(jìn)行了研究。抗生素在菌絲體殘留量的檢測(cè)在國(guó)外研究尚早，主要的檢測(cè)方法是高效液相色譜法，1994年，L.H.Christensen等人所建立的青霉素發(fā)酵過(guò)程中中間產(chǎn)物的高效液相色譜法作為一種經(jīng)典的檢測(cè)方法被廣泛使用，C18柱子被用來(lái)進(jìn)行分離，乙腈與磷酸鹽緩沖液的混合溶液作為流動(dòng)相，之后也有一些文獻(xiàn)報(bào)道了青霉素G及其降解產(chǎn)物的高效液相色譜法。但這些方法的靈敏度均較低，不能滿足現(xiàn)代殘留檢測(cè)分析的要求。目前在國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)中鮮少提到菌渣中抗生素的殘留檢測(cè)方法，且方法較不完善，并沒(méi)有明確的方法檢出限及回收率實(shí)驗(yàn)，不具有明顯的可靠性，因此尚需要進(jìn)一步研究，其中，劉慧娟等人在青霉素酶在青霉素菌渣無(wú)害化處理中的應(yīng)用中采用高效液相色譜法進(jìn)行了研究，此外，微生物法在菌渣中抗生素殘留的檢測(cè)也有應(yīng)用，但本方法不具有一定的專一性，所測(cè)抗生素可能含有其降解產(chǎn)物。因此，準(zhǔn)確可靠的殘留檢測(cè)方法還有待探討。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種青霉素檢測(cè)方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種青霉素檢測(cè)方法，包括如下步驟：（1）配制細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用分散液：取甘油、陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑，溶于注射用水或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水中，調(diào)pH至6～8，去內(nèi)毒素，得分散液，其中，甘油濃度為0.1～2%（v/v），陰離子表面活性劑濃度為0.05～0.5%（w/v），非離子表面活性劑濃度為0.1～1%（v/v）；（2）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：青霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶解于溶劑中，并利用溶劑稀釋配制成濃度在0.1μg·m ML^-1～2000μg·m ML^-1之間不同梯度濃度的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后采用0.45μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，利用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)、以青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)將高效液相色譜法檢測(cè)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后進(jìn)行擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=kX+b，方程中Y表示色譜峰面積，X表示青霉素的濃度，k和b為常數(shù)；所述的溶劑由乙腈和水按乙腈與水的體積比為1:1混合而成；（3）提?。菏紫葘⑶嗝顾鼐尤胩崛∫褐?，混合均勻后超聲提取25min～35min，然后進(jìn)行離心分離，離心分離得到的上清液即為青霉素粗提液，向青霉素粗提液中加入無(wú)水硫酸鈉和正己烷，再次進(jìn)行離心分離，離心分離后分三層，取中間層，即為青霉素提取液；所述的青霉素菌渣的質(zhì)量與提取液的體積比為1g:(3mL～5mL)；所述的提取液由乙腈和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的甲酸水溶液按乙腈與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的甲酸水溶液的體積比為3:1混合而成；所述的無(wú)水硫酸鈉與青霉素菌渣的質(zhì)量比為(0.8～1.2):1；所述的正己烷的體積與青霉素菌渣的質(zhì)量比為(0.8mL～1.2mL):1g；（4）活化處理：首先采用5.0mL甲醇過(guò)WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用5.0mL蒸餾水過(guò)WatersOasis-C18固相萃取小柱，即完成WatersOasis-C18固相萃取小柱活化處理；（5）洗脫：在過(guò)柱流速為1.0mL·min^-1～3.0mL·min^-1和真空條件下將步驟二得到的青霉素提取液過(guò)步驟三得到的活化處理后WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的甲醇水溶液淋洗，再采用洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫得到的液體在水浴溫度為24℃～26℃下N2吹干，然后加入復(fù)溶溶劑溶解N2吹干得到的固體，然后采用0.45μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，得到待檢測(cè)液；所述的洗脫液的體積與步驟二中所述的青霉素菌渣的質(zhì)量比為(0.6mL～1.0mL):1g；所述的洗脫液由乙腈和甲醇按乙腈與甲醇的體積比為3:1混合而成；所述的復(fù)溶溶劑的體積與步驟二中所述的青霉素菌渣的質(zhì)量比為0.2mL:1g；所述的復(fù)溶溶劑由乙腈和水按乙腈與水的體積比為1:1混合而成。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述陰離子表面活性劑HLB值為2～13。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述陰離子表面活性劑的HLB值為14～18。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明靈敏度高，可滿足我國(guó)對(duì)于青霉素在動(dòng)物性組織中的最高殘留限量的檢測(cè)要求，可為青霉素菌渣資源化利用為飼料提供一定的技術(shù)依據(jù)。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。

本發(fā)明實(shí)施例中，一種青霉素檢測(cè)方法，包括如下步驟：（1）配制細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用分散液：取甘油、陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑，溶于注射用水或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水中，調(diào)pH至6～8，去內(nèi)毒素，得分散液，其中，甘油濃度為0.1～2%（v/v），陰離子表面活性劑濃度為0.05～0.5%（w/v），非離子表面活性劑濃度為0.1～1%（v/v）；（2）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：青霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶解于溶劑中，并利用溶劑稀釋配制成濃度在0.1μg·m ML^-1～2000μg·m ML^-1之間不同梯度濃度的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后采用0.45μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，利用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)、以青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)將高效液相色譜法檢測(cè)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后進(jìn)行擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=kX+b，方程中Y表示色譜峰面積，X表示青霉素的濃度，k和b為常數(shù)；所述的溶劑由乙腈和水按乙腈與水的體積比為1:1混合而成；（3）提?。菏紫葘⑶嗝顾鼐尤胩崛∫褐?，混合均勻后超聲提取25min～35min，然后進(jìn)行離心分離，離心分離得到的上清液即為青霉素粗提液，向青霉素粗提液中加入無(wú)水硫酸鈉和正己烷，再次進(jìn)行離心分離，離心分離后分三層，取中間層，即為青霉素提取液；所述的青霉素菌渣的質(zhì)量與提取液的體積比為1g:(3mL～5mL)；所述的提取液由乙腈和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的甲酸水溶液按乙腈與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的甲酸水溶液的體積比為3:1混合而成；所述的無(wú)水硫酸鈉與青霉素菌渣的質(zhì)量比為(0.8～1.2):1；所述的正己烷的體積與青霉素菌渣的質(zhì)量比為(0.8mL～1.2mL):1g；（4）活化處理：首先采用5.0mL甲醇過(guò)WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用5.0mL蒸餾水過(guò)WatersOasis-C18固相萃取小柱，即完成WatersOasis-C18固相萃取小柱活化處理；（5）洗脫：在過(guò)柱流速為1.0mL·min^-1～3.0mL·min^-1和真空條件下將步驟二得到的青霉素提取液過(guò)步驟三得到的活化處理后WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的甲醇水溶液淋洗，再采用洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫得到的液體在水浴溫度為24℃～26℃下N2吹干，然后加入復(fù)溶溶劑溶解N2吹干得到的固體，然后采用0.45μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，得到待檢測(cè)液；所述的洗脫液的體積與步驟二中所述的青霉素菌渣的質(zhì)量比為(0.6mL～1.0mL):1g；所述的洗脫液由乙腈和甲醇按乙腈與甲醇的體積比為3:1混合而成；所述的復(fù)溶溶劑的體積與步驟二中所述的青霉素菌渣的質(zhì)量比為0.2mL:1g；所述的復(fù)溶溶劑由乙腈和水按乙腈與水的體積比為1:1混合而成。所述陰離子表面活性劑HLB值為2～13。所述陰離子表面活性劑的HLB值為14～18。

實(shí)施例1：

本發(fā)明青霉素檢測(cè)方法，包括如下步驟：（1）配制細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用分散液：取甘油、陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑，溶于注射用水或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水中，調(diào)pH至6，去內(nèi)毒素，得分散液，其中，甘油濃度為0.1%（v/v），陰離子表面活性劑濃度為0.05%（w/v），非離子表面活性劑濃度為0.1%（v/v）；（2）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：青霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶解于溶劑中，并利用溶劑稀釋配制成濃度在0.1μg·mL^-1～2000μg·mL^-1之間不同梯度濃度的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后采用0.45μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，利用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)、以青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)將高效液相色譜法檢測(cè)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后進(jìn)行擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=kX+b，方程中Y表示色譜峰面積，X表示青霉素的濃度，k和b為常數(shù)；所述的溶劑由乙腈和水按乙腈與水的體積比為1:1混合而成；（3）提?。菏紫葘⑶嗝顾鼐尤胩崛∫褐?，混合均勻后超聲提取25min～35min，然后進(jìn)行離心分離，離心分離得到的上清液即為青霉素粗提液，向青霉素粗提液中加入無(wú)水硫酸鈉和正己烷，再次進(jìn)行離心分離，離心分離后分三層，取中間層，即為青霉素提取液；所述的青霉素菌渣的質(zhì)量與提取液的體積比為1g:(3mL～5mL)；所述的提取液由乙腈和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的甲酸水溶液按乙腈與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的甲酸水溶液的體積比為3:1混合而成；所述的無(wú)水硫酸鈉與青霉素菌渣的質(zhì)量比為(0.8～1.2):1；所述的正己烷的體積與青霉素菌渣的質(zhì)量比為(0.8mL～1.2mL):1g；（4）活化處理：首先采用5.0mL甲醇過(guò)WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用5.0mL蒸餾水過(guò)WatersOasis-C18固相萃取小柱，即完成WatersOasis-C18固相萃取小柱活化處理；（5）洗脫：在過(guò)柱流速為1.0mL·min^-1～3.0mL·min^-1和真空條件下將步驟二得到的青霉素提取液過(guò)步驟三得到的活化處理后WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的甲醇水溶液淋洗，再采用洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫得到的液體在水浴溫度為24℃～26℃下N2吹干，然后加入復(fù)溶溶劑溶解N2吹干得到的固體，然后采用0.45μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，得到待檢測(cè)液；所述的洗脫液的體積與步驟二中所述的青霉素菌渣的質(zhì)量比為(0.6mL～1.0mL):1g；所述的洗脫液由乙腈和甲醇按乙腈與甲醇的體積比為3:1混合而成；所述的復(fù)溶溶劑的體積與步驟二中所述的青霉素菌渣的質(zhì)量比為0.2mL:1g；所述的復(fù)溶溶劑由乙腈和水按乙腈與水的體積比為1:1混合而成。所述陰離子表面活性劑HLB值為2。所述陰離子表面活性劑的HLB值為14。

實(shí)施例2：

青霉素檢測(cè)方法，包括如下步驟：（1）配制細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用分散液：取甘油、陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑，溶于注射用水或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水中，調(diào)pH至8，去內(nèi)毒素，得分散液，其中，甘油濃度為2%（v/v），陰離子表面活性劑濃度為0.5%（w/v），非離子表面活性劑濃度為1%（v/v）；（2）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：青霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶解于溶劑中，并利用溶劑稀釋配制成濃度在0.1μg·m min^-1～2000μg·m min^-1之間不同梯度濃度的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后采用0.45μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，利用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)、以青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)將高效液相色譜法檢測(cè)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后進(jìn)行擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=kX+b，方程中Y表示色譜峰面積，X表示青霉素的濃度，k和b為常數(shù)；所述的溶劑由乙腈和水按乙腈與水的體積比為1:1混合而成；（3）提取：首先將青霉素菌渣加入提取液中，混合均勻后超聲提取25min～35min，然后進(jìn)行離心分離，離心分離得到的上清液即為青霉素粗提液，向青霉素粗提液中加入無(wú)水硫酸鈉和正己烷，再次進(jìn)行離心分離，離心分離后分三層，取中間層，即為青霉素提取液；所述的青霉素菌渣的質(zhì)量與提取液的體積比為1g:(3mL～5mL)；所述的提取液由乙腈和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的甲酸水溶液按乙腈與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的甲酸水溶液的體積比為3:1混合而成；所述的無(wú)水硫酸鈉與青霉素菌渣的質(zhì)量比為(0.8～1.2):1；所述的正己烷的體積與青霉素菌渣的質(zhì)量比為(0.8mL～1.2mL):1g；（4）活化處理：首先采用5.0mL甲醇過(guò)WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用5.0mL蒸餾水過(guò)WatersOasis-C18固相萃取小柱，即完成WatersOasis-C18固相萃取小柱活化處理；（5）洗脫：在過(guò)柱流速為1.0mL·min^-1～3.0mL·min^-1和真空條件下將步驟二得到的青霉素提取液過(guò)步驟三得到的活化處理后WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的甲醇水溶液淋洗，再采用洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫得到的液體在水浴溫度為26℃下N2吹干，然后加入復(fù)溶溶劑溶解N2吹干得到的固體，然后采用0.45μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，得到待檢測(cè)液；所述的洗脫液的體積與步驟二中所述的青霉素菌渣的質(zhì)量比為(0.6mL～1.0mL):1g；所述的洗脫液由乙腈和甲醇按乙腈與甲醇的體積比為3:1混合而成；所述的復(fù)溶溶劑的體積與步驟二中所述的青霉素菌渣的質(zhì)量比為0.2mL:1g；所述的復(fù)溶溶劑由乙腈和水按乙腈與水的體積比為1:1混合而成。所述陰離子表面活性劑HLB值為13。所述陰離子表面活性劑的HLB值為18。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無(wú)論從哪一點(diǎn)來(lái)看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說(shuō)明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說(shuō)明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。