本發明涉及糖尿病腎病檢測標志物。

背景技術：

糖尿病腎病是糖尿病常見的并發癥，是糖尿病全身性微血管病變表現之一，臨床特征為蛋白尿，漸進性腎功能損害，高血壓，水腫，晚期出現嚴重腎功能衰竭，是糖尿病患者的主要死亡原因之一，目前常規檢測方法難以早期發現糖尿病腎病。

技術實現要素：

本發明提供了糖尿病腎病檢測標志物，將其用于檢測糖尿病腎病，具有良好的特異性、靈敏度和準確率。

血液由于采樣方便且能較好反映機體病理生理過程而成為疾病標志物的最好來源之一。但要尋找到特異性和準確性高，能用于臨床檢測的蛋白標志物，有一定難度。糖尿病腎病屬于多因素相關疾病，很難尋找到單一的蛋白標志物。因此，本發明提供上述差異蛋白用于糖尿病腎病檢測，采取該組合標志物的方式能提高檢測的特異性和準確性，同時具有一定的客觀性，優于單一疾病標志物。本發明上述12種血清差異蛋白組合可作為糖尿病腎病檢測標志物，具有一定的客觀性、特異性和準確性。需說明的是，本發明糖尿病腎病檢測標志物的來源除血清外，糖尿病腎病檢測標志物還可以來自尿樣。

本發明提供糖尿病腎病檢測標志物，所述糖尿病腎病檢測標志物由12種蛋白組成：角蛋白19，結合珠蛋白，載脂蛋白e，c反應蛋白，血小板因子4前體，性激素結合球蛋白前體，免疫球蛋白重鏈viiiregionhil，補體成分c4，角蛋白6l，c反應蛋白前體剪接異構體1，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原。

本發明還提供一種分離血清或尿液中糖尿病腎病檢測標志物的方法，所述糖尿病腎病檢測標志物為權利要求1中所述的12種蛋白，采用蛋白質雙向電泳方法分離血清或尿液中的糖尿病腎病檢測標志物；雙向電泳優化條件為：

1）第一向等電聚焦

24cm上樣量120微克

水化50v12小時（20℃）主動水化

s1250v線性0.5小時除鹽

s21000v線性2小時除鹽

s310000v線性6小時升壓

s410000v快速80000vhr聚膠

s5500v快速3小時保持；

在本條件下，每個樣品重復3次，第一向等電聚焦結果良好，蛋白點分開良好。

2）第二向垂直電泳

采用恒壓來跑膠，開始進樣時選擇低電壓60v，待樣品分膠液溴酚藍濃縮成一條線之后，加大電壓至200v，直到溴酚藍指示劑跑到底部位置，停止跑膠。

本發明還提供一種糖尿病腎病檢測試劑盒，所述試劑盒包括健康人的血清，在血清中，糖尿病腎病檢測標志物的表達量在正常范圍內；所述糖尿病腎病檢測標志物由12種蛋白組成：角蛋白19，結合珠蛋白，載脂蛋白e，c反應蛋白，血小板因子4前體，性激素結合球蛋白前體，免疫球蛋白重鏈viiiregionhil，補體成分c4，角蛋白6l，c反應蛋白前體剪接異構體1，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原。

本發明還提供12種蛋白在作為糖尿病腎病檢測標志物中的應用；所述12種蛋白為：角蛋白19，結合珠蛋白，載脂蛋白e，c反應蛋白，血小板因子4前體，性激素結合球蛋白前體，免疫球蛋白重鏈viiiregionhil，補體成分c4，角蛋白6l，c反應蛋白前體剪接異構體1，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原。

本發明還提供一種檢測糖尿病腎病的蛋白芯片，所述蛋白芯片中的蛋白為：角蛋白19，結合珠蛋白，載脂蛋白e，c反應蛋白，血小板因子4前體，性激素結合球蛋白前體，免疫球蛋白重鏈viiiregionhil，補體成分c4，角蛋白6l，c反應蛋白前體剪接異構體1，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原。

本發明提供的一組血清差異蛋白可用于糖尿病腎病檢測，用于糖尿病腎病檢測時，較單一疾病標記物，提高了檢測的特異性和準確性，同時具有一定的客觀性。本發明采用蛋白質雙向電泳方法，對電泳條件進行了優化，獲得了清晰的蛋白電泳結果；通過對糖尿病腎病患者血清與健康對照血清的電泳結果進行比較分析，獲得了二者血清差異蛋白12個，與對照相比，表達上調蛋白10個，表達下調蛋白2個。還可以在本發明的基礎上進一步采用酶聯免疫技術對這些蛋白進行逐個檢測或采用蛋白芯片技術對這些蛋白進行同時檢測，確定檢測到的血清差異蛋白的濃度變化。與現有的檢測方法相比，本發明的檢測標志物特異性、靈敏度和準確性高，可作為糖尿病腎病診斷的依據。本發明的待檢樣本可以使用血清和尿液，采集更加方便；檢測時用量為200ug-400ug，遠小于應用其他方法的采血量。

附圖說明

附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中：

圖1為健康對照血清的雙向電泳結果；

圖2-5為糖尿病腎病患者血清的雙向電泳結果；

圖6為實驗血清和健康對照血清的12種差異蛋白示意圖。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。

本申請人通過對糖尿病腎病患者和健康人群的血清和尿液進行比較分析，發現：與健康人群的血清和尿液相比，在糖尿病腎病患者血清和尿液中存在12個血清差異蛋白：角蛋白19，結合珠蛋白，載脂蛋白e，c反應蛋白，血小板因子4前體，性激素結合球蛋白前體，免疫球蛋白重鏈viiiregionhil，補體成分c4，角蛋白6l，c反應蛋白前體剪接異構體1，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原，其中10個表達蛋白上調，2個表達蛋白下調。本申請人將該組差異蛋白用于糖尿病腎病的早期檢測中，發現具有良好的特異性、靈敏度和準確性。

實施例1

本發明的糖尿病腎病檢測標志物為：

角蛋白19，結合珠蛋白，載脂蛋白e，c反應蛋白，血小板因子4前體，性激素結合球蛋白前體，免疫球蛋白重鏈viiiregionhil，補體成分c4，角蛋白6l，c反應蛋白前體剪接異構體1，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原。

實施例2

本申請首先采用蛋白質雙向電泳方法分離血清或尿液中的12種蛋白（即角蛋白19，結合珠蛋白，載脂蛋白e，c反應蛋白，血小板因子4前體，性激素結合球蛋白前體，免疫球蛋白重鏈viiiregionhil，補體成分c4，角蛋白6l，c反應蛋白前體剪接異構體1，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原），然后對雙向電泳凝膠差異點進行扣點，做質譜分析，確定蛋白名稱以及其大小，并對健康對照組和糖尿病腎病患者血清或尿液中蛋白質的含量進行比較分析。具體操作如下：

一、檢測物是血清

1、準備健康對照血清：健康對照血清采集自健康人群，血清中的上述12種蛋白的表達量在規范的正常范圍內。

健康對照血清在采集后分裝，并且直接冷凍在-80℃的環境中，在使用的時候取出解凍使用。

2、采集糖尿病腎病患者的血清作為實驗血清。采血量最低為5ml。

使用時，應用affinity2bluegel和proteina分別去除實驗血清和健康對照血清中的白蛋白和igg，將未做處理的血清以及去除白蛋白和igg的血清各400μg與水化液混合。

水化液配方為：

尿素8m4.805g

chaps4%0.4g

dtt65mm0.098g（現加）

兩性電解質0.2%（w/v）50ul（40%）（現加）

溴酚藍0.001%10ul（1%溴酚藍）

milliq水定容至10ml。

分裝為1ml，-20℃保存。

3、通過蛋白質雙向電泳方法，對實驗血清和健康對照血清中的蛋白進行分離。本申請人對蛋白質雙向電泳時的條件進行了優化：主要是對第一向等電聚焦程序和第二向中的恒壓跑膠條件進行了優化，使之能夠很好的分離上述12種蛋白，電泳結果清晰。具體電泳方法如下：

a.第一向等電聚焦

1)從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（i）（不含dtt（二硫蘇糖醇，分子式為c4h10o2s2，分子量為154.25），不含bio-lyte（兩性電解質））一小管（1ml/管），置室溫溶解。

水化上樣緩沖液（i）的配方為：

尿素8m4.805g

chaps4%0.4g

dtt65mm0.098g（現加）

兩性電解質0.2%（w/v）50ul（40%）（現加）

溴酚藍0.001%10ul（1%溴酚藍）

milliq水定容至10ml；

分裝為1ml，-20℃保存。

2)在小管中加入0.01gdtt，bio-lyte4-6、5-7各2.5ml，充分混勻。

3)從小管中取出400ul水化上樣緩沖液（i），加入200ul樣品（即處理后的實驗血清蛋白或健康對照血清蛋白），充分混勻。

4)從冰箱中取-20℃冷凍保存的ipg預制膠條（17cmph4-7），室溫中放置10分鐘。

5)沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質的分布。

6)當所有的蛋白質樣品都已經加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子輕輕的去除預制ipg膠條上的保護層。

7)分清膠條的正負極，輕輕地將ipg膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標有）對應于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因為這些溶液不會被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產生氣泡。如果已經產生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。

8)在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。

9)對好正、負極，蓋上蓋子。設置等電聚焦程序：

第一向等電聚焦：

24cm上樣量120微克

水化50v12小時（20℃）主動水化

s1250v線性0.5小時除鹽

s21000v線性2小時除鹽

s310000v線性6小時升壓

s410000v快速80000vhr聚膠

s5500v快速3小時保持。

在本條件下，每個樣品重復3次，第一向等電聚焦結果良好，蛋白點分開良好。

10)聚焦結束的膠條。立即進行平衡、第二向sds-page電泳，否則將膠條置于樣品水化盤中，-20℃冰箱保存。

b.第二向sds-page電泳

1)配制10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液，每塊凝膠40ml，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用milliq水、乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面平整。聚合30分鐘。一般凝膠與上方液體分層后，表明凝膠已基本聚合。

2)待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的milliq水、乙醇或水飽和正丁醇，用milliq水沖洗。

3)從-20℃冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10分鐘，使其溶解。

4)配制膠條平衡緩沖液i。

膠條平衡緩沖母液：

尿素6m36g

sds2%2g

this-hcl0.375mph8.825ml

甘油20%20ml

milliq水定容到100ml；

分裝成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存。

膠條平衡緩沖液i：

膠條平衡緩沖母液10ml

dtt0.2g

充分混勻，現配現用。

5)在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用milliq水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時出現的縱條紋。

6)將膠條轉移至溶漲盤中，每個槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液i。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。

7)配制膠條平衡緩沖液ii：

膠條平衡緩沖母液10ml

碘乙酰胺0.24g。

充分混勻，現用現配。

8)第一次平衡結束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液i。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液ii，繼續在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。

9)用濾紙吸去sds-page聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長玻璃板在下，短玻璃板朝上。

10)將瓊脂糖封膠液進行加熱溶解。

11)將10×電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，成1×電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。

10×電泳緩沖液：

tris堿30g

甘氨酸144g

sds10g

milliq水1l；

混勻后，室溫保存，用時稀釋。

12)第二次平衡結束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液ii。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。

13)將ipg膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。其余膠條同樣操作。

14)將放有膠條的sds-page凝膠轉移到灌膠架上，短玻璃板一面對著自己。在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液。

15)用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時，要注意是推動凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。

16)放置5分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。

17)在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉移至電泳槽中。

18)在電泳槽加入1×電泳緩沖液后，接通電源，采用恒壓來跑膠，開始進樣時為低電壓60v，待樣品分膠液溴酚藍濃縮成一條線之后，加大電壓200v，直到溴酚藍指示劑跑到底部位置，停止跑膠。整個跑膠時間大概是6個小時。待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。

19)電泳結束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號（戴手套，防止污染膠面）。

20)進行染色：采用的是碧云天銀染試劑盒。按照試劑盒的方法進行染色，操作時盡量避免手接觸到膠面，以免蛋白的污染。

4、質譜分析：

對雙向電泳凝膠差異點進行扣點，做質譜分析，確定蛋白名稱以及其大小，并對健康對照組和實驗血清中蛋白質的含量進行比較。

5、對電泳和質譜結果進行分析：

由電泳結果和質譜分析結果發現，實驗血清和健康對照血清中存在12個差異蛋白：角蛋白19，結合珠蛋白，載脂蛋白e，c反應蛋白，血小板因子4前體，性激素結合球蛋白前體，免疫球蛋白重鏈viiiregionhil，補體成分c4，角蛋白6l，c反應蛋白前體剪接異構體1，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原。上述12種差異蛋白的表達量發生了變化：相對于健康對照血清來說，實驗血清中：角蛋白19，結合珠蛋白，載脂蛋白e，c反應蛋白，血小板因子4前體，性激素結合球蛋白前體，免疫球蛋白重鏈viiiregionhil，補體成分c4，角蛋白6l，c反應蛋白前體剪接異構體1和cd5抗原這10種差異蛋白表達量上調，且結合珠蛋白和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶wnk4表達量下調。具體見表1和圖1-6。

圖1為健康對照血清的雙向電泳結果；

圖2-5為糖尿病腎病患者血清的雙向電泳結果；

圖6為實驗血清和健康對照血清的12種差異蛋白示意圖；其中，12表示：血小板因子4前體；16表示：性激素結合球蛋白前體；19表示：cd5抗原；22表示：角蛋白6l；26表示：c反應蛋白；37表示：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶wnk4；49表示：免疫球蛋白重鏈viiiregionhil；54表示：補體成分c4；73表示：載脂蛋白e；86表示：結合珠蛋白；99表示：c反應蛋白前體剪接異構體1；102表示：角蛋白19。

表1糖尿病腎病患者與健康對照的血清差異蛋白

二、檢測物是尿液

1、準備健康對照尿液：健康對照尿液采集自健康人群，尿液中的上述12種蛋白的表達量在規范的正常范圍內。

2、采集實驗尿液；

尿液標本采集需在2小時內用完，如果不能則冷藏在4℃冰箱保存，一共只能保存6小時；

尿蛋白的沉淀：分別取5ml的尿液，20%tca/丙酮沉淀法沉淀尿液蛋白，真空干燥后懸于200微升ief緩沖液（上海玉博生物科技有限公司，產品編號：amrescom243）中。

3、將上述處理過的尿液樣本以ph值為4-7的線性ipg干膠條進行蛋白質雙向電泳實驗，對雙向電泳凝膠差異點進行扣點，做質譜分析，對電泳和質譜結果進行分析。具體操作步驟與血清的操作步驟相同。

現有的糖尿病腎病僅是檢測一個或者幾個蛋白指標缺乏特異性，所以診斷不明確，尤其是早期糖尿病的誤診率比較高。本發明用于檢測糖尿病腎病的蛋白標志物有12種，特異性比原來檢測單一標志物增高，可達到89.8%；靈敏度也可達90%以上。

應用本發明的檢測方法對165位糖尿病腎病患者進行檢測，當角蛋白19，結合珠蛋白，載脂蛋白e，c反應蛋白，血小板因子4前體，性激素結合球蛋白前體，免疫球蛋白重鏈viiiregionhil，補體成分c4，角蛋白6l，c反應蛋白前體剪接異構體1和cd5抗原這10種差異蛋白表達量上調，且結合珠蛋白和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶wnk4表達量下調時，判斷患有糖尿病腎病，結果檢出147位，臨床符合率（準確率）達到89%以上。

將應用本發明的方法檢測到的患有糖尿病腎病的待檢血清用下述方法中的一種進行進一步的檢測，可以進一步提高檢測的特異性、靈敏度和準確性：

（1）用酶聯免疫試劑盒(上海藥巢生物工程有限公司)酶聯免疫技術對12個血清差異蛋白進行逐個檢測，能進一步確定檢測到的血清差異蛋白的濃度變化大小。

（2）將12種差異蛋白按照本領域的已知方法制備成蛋白芯片，采用蛋白芯片技術對12個血清差異蛋白進行同時檢測，確定檢測到的血清差異蛋白的濃度變化。

實施例3

本發明的糖尿病腎病檢測試劑盒：

1、采集2-3個健康人群的血清，血清中的上述12種蛋白的表達量在規范的正常范圍內。采集后冷凍在-80℃的環境中。作為標準陰性血清；

2、準備電泳時所用的溶液（若有改進的地方，此處寫明即可，與實施例2中對應）；

3、準備標準板：將圖1和圖6打印，作為標準板。檢測后，根據標準板或標準陰性血清的電泳結果進行判斷即可。

本發明的檢測試劑盒的檢測方法按照實施例2進行（省略對差異點進行質譜分析的步驟）。

檢測結果判斷依據：當角蛋白19，結合珠蛋白，載脂蛋白e，c反應蛋白，血小板因子4前體，性激素結合球蛋白前體，免疫球蛋白重鏈viiiregionhil，補體成分c4，角蛋白6l，c反應蛋白前體剪接異構體1和cd5抗原這10種差異蛋白表達量上調，且結合珠蛋白和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶wnk4表達量下調時，判斷患有糖尿病腎病。

最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。