本發(fā)明涉及色譜微柱，尤其是涉及用于生物樣品快速分離的超短色譜微柱及其制備方法。

背景技術(shù)：

微型化是當(dāng)今科技發(fā)展的一大趨勢(shì)，這一趨勢(shì)同樣出現(xiàn)在高效液相色譜的演化與發(fā)展的過程中。來源于生命體系(局部病變組織、單細(xì)胞等)的樣品提取過程繁瑣且可獲得的量及其微小，常規(guī)的分析柱以及微徑柱較高的體積流量會(huì)對(duì)微量樣品造成嚴(yán)重的稀釋效應(yīng)，降低分析檢測(cè)的靈敏度。為降低液相色譜流動(dòng)相對(duì)微量樣品的稀釋效應(yīng)需要進(jìn)一步縮小色譜柱徑至微米級(jí)，毛細(xì)管液相色譜柱應(yīng)運(yùn)而生。毛細(xì)管液相色譜柱多采用內(nèi)徑為20～100μm的彈性石英毛細(xì)管填充制備，因其特征的體積流量在幾百納升每分鐘也被稱為納流液相色譜柱。對(duì)于液相色譜而言，體積流量隨著色譜柱徑的降低而降低，毛細(xì)管液相色譜柱除了具有較高的柱效之外，其極低的體積流量能顯著降低液相色譜流動(dòng)相的消耗，可以稱之為一種綠色環(huán)保的分析方法；其極低的體積流量能降低對(duì)樣品的稀釋程度，提高分析檢測(cè)的靈敏度，與微納尺度的樣品具有良好的匹配性；其極低的體積流量還能降低質(zhì)譜離子源的負(fù)擔(dān)，與質(zhì)譜檢測(cè)器有較好的兼容性。現(xiàn)如今在蛋白質(zhì)組研究中，納流液相色譜與當(dāng)代質(zhì)譜的聯(lián)用平臺(tái)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組研究中最具代表性的分析鑒定技術(shù)。

對(duì)于大規(guī)模樣品分析而言，作為質(zhì)譜前端的樣品處理平臺(tái)，色譜分離技術(shù)正在往著快速、高通量、操作簡(jiǎn)便等方向發(fā)展，因此，發(fā)展較短柱長(zhǎng)的色譜柱和對(duì)應(yīng)的色譜方法對(duì)于快速處理大規(guī)模樣品而言有著重要意義。同時(shí)，對(duì)于許多生物樣本來說，自身的稀有性導(dǎo)致了樣本量往往偏少，在流經(jīng)色譜柱床時(shí)，色譜固定相的多孔特性以及表面化學(xué)或多或少會(huì)對(duì)樣品分子有一定程度的非特異性永久吸附，使得在流經(jīng)色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器后傳感器響應(yīng)值偏低，影響最終分析結(jié)果的靈敏度。由于這種吸附是固定相本身特性決定的，減少填料體積，縮短柱長(zhǎng)成為了一種可靠的解決方案。在傳統(tǒng)的毛細(xì)管液相色譜柱制備過程中，柱塞的制作往往需要通過燒結(jié)部分填料來完成，很難精確控制柱床長(zhǎng)度，從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)較短柱床色譜柱的制作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供用于生物樣品快速分離的超短色譜微柱及其制備方法。

所述用于生物樣品快速分離的超短色譜微柱包含一根中空石英毛細(xì)管，毛細(xì)管內(nèi)填充有柱床長(zhǎng)度小于1mm的固定相填料顆粒，微柱兩端分別設(shè)有兩個(gè)多孔二氧化硅微球作為柱塞。

所述生物樣品快速分離的超短色譜微柱的制備方法包括以下步驟：

1)截取中空石英毛細(xì)管，將一顆多孔二氧化硅微球壓入中空石英毛細(xì)管一端作為出口柱塞；

2)稱取填充的色譜固定相放入一個(gè)移液槍頭中，移液槍頭尖端部分與中空石英毛細(xì)管連接并用膠條密封，將連有中空石英毛細(xì)管的移液槍頭放入離心機(jī)中，通過離心力驅(qū)動(dòng)使得固定相顆粒在空管中堆砌成柱床；

3)在填充完成中空石英毛細(xì)管一端壓入多孔二氧化硅微球作為入口柱塞，然后在顯微鏡下用陶瓷刀片沿入口柱塞位置將多余空管截去，從而完成生物樣品快速分離的超短色譜微柱的制備。

在步驟1)中，所述中空石英毛細(xì)管可采用中空石英彈性毛細(xì)管；所述中空石英毛細(xì)管的內(nèi)徑可為25～100μm。

在步驟2)中，所述色譜固定相可為但不限于反相c18填料、陰離子交換填料、陽(yáng)離子交換填料、親水作用填料(hilic)等中的一種。

所述完成生物樣品快速分離的超短色譜微柱的制備過程中填料在干燥狀態(tài)下直接填充，無(wú)需經(jīng)過溶劑浸潤(rùn)；所述整根色譜柱長(zhǎng)為3～5mm。

本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)柱床長(zhǎng)度小于1mm，使用時(shí)無(wú)需外接高壓泵，可直接用注射器進(jìn)行洗脫，所生成的色譜餾分可直接點(diǎn)板用于基質(zhì)輔助激光解吸電離(maldi)質(zhì)譜鑒定，適用于微量珍稀生物樣本的快速分離和預(yù)處理。

本發(fā)明可以在將柱床長(zhǎng)度精確控制在1mm以下，有效解決微量生物樣品分離中的吸附問題，同時(shí)本發(fā)明提供了一種無(wú)須外接高壓泵的色譜洗脫方法，該方法操作簡(jiǎn)單，使用方便，可以直接與基質(zhì)輔助激光解吸電離(maldi)質(zhì)譜耦合，用于生物樣品分子結(jié)構(gòu)的深度解析。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述生物樣品快速分離的超短色譜微柱的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明所述生物樣品快速分離的超短色譜微柱的填充過程示意圖。

圖3為苯系物快速分離色譜圖。

圖4為本發(fā)明所述生物樣品快速分離的超短色譜微柱逐滴洗脫點(diǎn)板示意圖。

圖5為蛋白質(zhì)ribonucleasea的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。

圖6為蛋白質(zhì)lysozyme的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。

圖7為蛋白質(zhì)myoglobin的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。

圖8為蛋白質(zhì)cytochromec的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。

圖9為蛋白質(zhì)albuminbovine的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的幾種可選實(shí)施例。

參見圖1～9，所述用于生物樣品快速分離的超短色譜微柱包含一根中空石英毛細(xì)管2，毛細(xì)管內(nèi)填充有柱床長(zhǎng)度小于1mm的固定相填料顆粒，微柱兩端分別設(shè)有兩個(gè)多孔二氧化硅微球1作為柱塞。

實(shí)施例1：1mm柱床的超短色譜微柱制備

截取中空石英毛細(xì)管2的內(nèi)徑100μm，外徑365μm的中空石英毛細(xì)管5cm(河北永年銳灃色譜器件有限公司)，將中空石英毛細(xì)管2一端置于盛有直徑110μm的多孔二氧化硅微球1(英國(guó)x-tec公司)的離心管中，將單顆多孔二氧化硅微球1壓入毛細(xì)管一端作為出口柱塞。

取20μl移液槍頭7，將上述毛細(xì)管開口端插入槍頭尖端，連接處及移液槍頭7開口處用密封膠條纏繞密封(如圖2所示)。稱取1mg粒徑為5μm的c18反相硅膠鍵合填料(waters公司)作為色譜固定相3，將所取填料加入到移液槍頭7中。將連接有毛細(xì)管的移液槍頭7置于離心機(jī)內(nèi)，設(shè)置離心轉(zhuǎn)速9000rpm，離心時(shí)間15min。離心完成后取下毛細(xì)管，按上述同樣方法在另外一段壓入一顆多孔二氧化硅微球1作為入口柱塞。然后使用外徑為90μm的石英毛細(xì)管(河北永年銳灃色譜器件有限公司)在顯微鏡下將多孔二氧化硅微球1推至柱床末端。將所得毛細(xì)管柱置于顯微鏡下，用陶瓷刀片沿入口柱塞位置切去多余空管，從而完成整根超短色譜微柱的制作。

實(shí)施例2：快速色譜分離效能評(píng)價(jià)

將實(shí)施例1中所得超短色譜微柱連接在納流液相色譜儀中，出口端連接一段內(nèi)徑20μm的毛細(xì)管作為連接管將液流導(dǎo)入紫外檢測(cè)器中，在214nm紫外光條件下測(cè)試該色譜柱對(duì)于苯的同系物(硫脲、苯、甲苯、乙苯、丙苯)的分離能力。流動(dòng)相配比為can/h2o＝60/40，體積流速為200nl/min，分離時(shí)間60s，所得色譜圖如圖3所示，最后一個(gè)組分丙苯的分離柱效為33600塔板/m。

實(shí)施例3：超短色譜微柱用于基質(zhì)輔助激光解吸電離(maldi)質(zhì)譜的點(diǎn)板

如圖4所示，取五種蛋白質(zhì)混合溶液作為待測(cè)樣品(cytochromec、lysozyme、ribonucleasea、myoglobin、albuminbovine)，使用1ml注射器4吸取平衡溶液(can/h2o＝5/95)待用，將實(shí)施例1中所制備的超短色譜微柱入口端柱頭沾取少量樣品后，通過ptfe套管連接在1ml注射器上，然后緩慢推動(dòng)注射器活塞，使得柱管內(nèi)部充分浸潤(rùn)。另取一根1ml注射器4，吸滿洗脫溶液(can/h2o＝60/40)，將柱管從第一根注射器上取下后與此注射器4連接，然后緩慢推動(dòng)注射器活塞，使得洗脫餾分滴液6下落，并使得餾分液滴點(diǎn)落在maldi靶板5上，然后逐點(diǎn)加入輔助基質(zhì)dhb，從而完成靶板5制備。將靶板5送入質(zhì)譜中，質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)在4700proteomicsanalyzer(美國(guó)ab公司)上完成，激光為nd-yag激光，波長(zhǎng)355nm，激光脈沖頻率200hz，加速電壓20kv，正離子模式，反射式tof檢測(cè)，質(zhì)譜數(shù)據(jù)提交mascot搜庫(kù)檢索，所得質(zhì)譜圖如圖5所示。

本發(fā)明使用單顆粒多孔硅球作為柱塞，可以實(shí)現(xiàn)柱床長(zhǎng)度低于1mm。色譜填料量大幅度降低，削減了填料表面對(duì)樣品分子的非特異性吸附，使得樣品回收率大幅度提高，適用于微量及痕量珍稀生物樣品的色譜分離及預(yù)處理。同時(shí)，由于超短柱床帶來超低背壓，該色譜微柱運(yùn)行時(shí)無(wú)需外接高壓驅(qū)動(dòng)泵，只需連接注射器或手動(dòng)泵即可完成流動(dòng)相的輸運(yùn)和色譜洗脫。該色譜微柱使用時(shí)可與光學(xué)檢測(cè)器相連或使用手動(dòng)泵，采用邊洗脫邊點(diǎn)板的形式與基質(zhì)輔助激光解吸電離(maldi)質(zhì)譜相連進(jìn)行檢測(cè)鑒定，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，大幅度節(jié)省了儀器成本。