本發(fā)明屬于顯微光譜成像技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種反射式共焦cars顯微光譜測試方法及裝置，可用于快速檢測各類樣品的微區(qū)反斯托克斯散射(cars)光譜，可實現(xiàn)高空間分辨的幾何成像與探測，可獲得高空間分辨的“圖譜合一”圖像。

技術(shù)背景

光學(xué)顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和材料科學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，而隨著現(xiàn)代科學(xué)的快速發(fā)展，對顯微成像的要求也從結(jié)構(gòu)成像轉(zhuǎn)向功能成像。1990年，共焦拉曼光譜顯微技術(shù)的成功應(yīng)用，極大的提高了探索微小物體具體組織成分及形貌的可能。它將共焦顯微技術(shù)和拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合，具備共焦顯微術(shù)的高分辨層析成像特征，又兼有無傷檢測和光譜分析能力，已成為一種重要的材料結(jié)構(gòu)測量與分析的技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于物理、化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、石油化工、食品、藥物、刑偵等領(lǐng)域。

傳統(tǒng)的自發(fā)拉曼散射成像技術(shù)由于拉曼散射本身特性導(dǎo)致其發(fā)射信號極弱，即便用高強度的激光激發(fā)，要得到一副對比度好的光譜圖像，依然需要很長的作用時間。這種長時間作用限制了拉曼顯微技術(shù)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。基于相干拉曼效應(yīng)的相干反斯托克斯拉曼散射(cars)過程能夠很大程度上增強拉曼信號，從而實現(xiàn)快速檢測。相干拉曼效應(yīng)是通過受激激發(fā)的光將分子鎖定在振動能級上，這種方法產(chǎn)生的振動信號的強度與激發(fā)光的強度成非線性關(guān)系，可以產(chǎn)生很強的信號，也稱為相干非線性拉曼光譜。它具有很強的能量轉(zhuǎn)換效率，曝光時間短，對樣品的損害也比較小，同時它的散射具有一定的方向性，容易與雜散光分離。

相干反斯托克斯拉曼散射(cars)的產(chǎn)生是一個三階非線性光學(xué)過程，它需要泵浦光、斯托克斯光和探測光。一般而言，為了減少光源的數(shù)量，簡化過程，常用泵浦光代替探測光，它們之間的關(guān)系如圖2所示，當泵浦光(wp)和斯托克斯光(ws)的頻率之差與拉曼活性分子的振動頻率相匹配時，將激發(fā)出cars光was，其中was＝2wp-ws。cars光的產(chǎn)生過程包含特定的拉曼活性分子的振動模式和導(dǎo)致分子從基態(tài)至激發(fā)態(tài)振動躍遷的入射光場的相互作用過程，它的能級示意圖如圖3所示。圖3(a)表示拉曼共振和非共振單光子增強對cars過程的貢獻，圖3(b)表示拉曼共振和非共振雙光子增強對cars過程的貢獻；當wp和ws之間的頻差與拉曼活性分子的振動頻率相匹配時，激發(fā)出的信號得到共振增強，同時非共振部分也會由于電子躍遷響應(yīng)得到增強，因此要得到較好的cars信號，需要盡可能的抑制非共振背景信號，常見的方法是偏振cars(p-cars)方法。

p-cars的原理如圖4所示，光源1發(fā)出的頻率為ws的斯托克斯光，起偏后經(jīng)過四分之一波片和半波片后與光源2發(fā)出的頻率為wp的泵浦光(探針光)匯合，經(jīng)二向分光鏡后由反射鏡發(fā)射至水浸顯微物鏡，聚焦在樣品上，激發(fā)出載有光譜特性的cars光后，透射進入信號采集系統(tǒng)；信號由一個油浸的顯微物鏡采集，經(jīng)過一個偏振片過濾非共振背景，然后通過一個濾光片濾除其他譜段的干擾后，被一個雪崩光電二極管所采集，即獲得特定頻譜的光譜信號。

p-cars能夠很大程度的抑制非共振信號和激發(fā)光的干擾，但是由于其采用的是兩個單波長激光器，只能獲得特定頻譜的光譜信息，因此它的廣泛使用受到了極大的限制。

傳統(tǒng)cars顯微術(shù)沒有強調(diào)系統(tǒng)的定焦能力，導(dǎo)致實際光譜探測位置往往處于離焦位置。即便光線在離焦位置也能激發(fā)出樣品的拉曼光譜并被針孔后的光譜儀探測，但是強度并不能合理表征該點正確的光譜信號強度。在cars顯微系統(tǒng)中，只有當系統(tǒng)精確定焦，才能獲得最佳空間分辨力和最好的光譜探測能力。

上述原因限制了cars顯微系統(tǒng)探測微區(qū)光譜的能力，制約了其在更精細微區(qū)光譜測試與分析場合中的應(yīng)用。基于上述情況，本發(fā)明提出將系統(tǒng)收集到的樣品表面散射的強于樣品拉曼散射光10³～10⁶倍的瑞利光進行高精度探測，使其與光譜探測單元有機融合，進行空間位置信息和光譜信息的同步探測，以實現(xiàn)高空間分辨的、高光譜分辨的共焦cars顯微圖譜成像和探測。

本發(fā)明專利的核心思想是選用超連續(xù)譜脈沖激光器和單波長脈沖激光器作為激發(fā)光源，擴大激發(fā)光譜范圍，提高光譜激發(fā)強度；將共焦顯微結(jié)構(gòu)與cars光譜結(jié)構(gòu)結(jié)合，利用共焦響應(yīng)曲線的“最大值點”與被測樣品頂點位置(顯微物鏡焦點位置)精確對應(yīng)這一特性，精確定焦，實現(xiàn)高空間分辨；精確定焦后，進行光譜探測，獲得最佳光譜分辨能力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種具有高空間分辨力的反射式共焦cars顯微光譜測試方法及其裝置。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。一種反射式共焦cars顯微光譜測試方法，包括以下步驟：

a)在激光發(fā)射單元(1)中，由超連續(xù)譜激光器(3)發(fā)出超連續(xù)譜激光，經(jīng)過帶通濾光片(4)后通過二向色鏡(5)與單波長激光器(2)發(fā)出的單波長激光混合，形成混合光束(頻率一致，時間一致，空間重合)；混合光束經(jīng)過半反半透棱鏡(6)由位于z向平移臺(7)上的顯微物鏡(8)會聚在被測樣品(9)上，激發(fā)出瑞利光和載有被測樣品(9)光譜特性的cars光；cars光和瑞利光經(jīng)分光棱鏡反射進入二向色鏡(11)后分成兩束，其中包含cars光的光束進入光譜探測單元(12)，另一束包含瑞利光的光束進入共焦探測單元(18)；在光譜探測單元(12)中，包含cars光的光束先經(jīng)過帶通濾光片(13)，濾除光束中的非cars干擾光，然后通過第一會聚鏡(14)會聚進入光譜儀(17)，獲得cars光譜信息i(λ)；在共焦探測單元(18)中，包含瑞利光的光束經(jīng)過第三會聚鏡(19)后通過位于焦點位置的第二針孔(20)濾除雜散光后被第一光電探測器(21)探測，獲得共焦強度信號i(x,y,z)；

b)z向平移臺(7)移動，共焦信號強度隨之改變，得到共焦響應(yīng)曲線，利用共焦響應(yīng)曲線“最大值點”與測量顯微物鏡(8)焦點位置精確對應(yīng)的特性，通過“最大值點”來精確捕獲激發(fā)光斑焦點位置后，再測量獲得光譜信息i(x,y,λ)，從而實現(xiàn)高空間分辨的幾何探測和光譜探測。

c)當對接收cars光的光譜探測單元(12)獲得的光譜信號進行處理時，系統(tǒng)能夠進行光譜探測(x,y,λ)；當對接收瑞利光的共焦探測單元(18)獲得的共焦信號進行處理時，系統(tǒng)能夠獲得三維幾何形貌(x,y,z)；當對共焦信號和cars信號同時處理時，系統(tǒng)能夠進行高空間分辨的微區(qū)圖譜層析成像(x,y,z,λ)，即實現(xiàn)對被測樣品“圖譜合一”的激光共焦cars顯微光譜高空間分辨成像與探測。

特別的，在本發(fā)明方法中，激發(fā)光束由兩束頻率相同，時間一致的脈沖激光組成，其中一束是單波長脈沖激光，另一束是超連續(xù)譜脈沖激光。

特別的，在本發(fā)明方法中，通過匹配不同譜帶的濾光片，選擇不同譜段的斯托克斯光，由此實現(xiàn)不同譜段的光譜探測。

特別的，在本發(fā)明方法中，二向色鏡(8)與分光棱鏡(6)反射光束軸線的夾角可變，由此提高系統(tǒng)的靈活性。

特別的，在本發(fā)明方法中，在激光發(fā)射單元(1)和半反半透鏡(6)之間添加光瞳濾波器(24)，有助于提高系統(tǒng)的空間分辨力。

特別的，在本發(fā)明方法中，激光發(fā)射單元還可以用單波長激光器加光子晶體光纖進行光譜展寬實現(xiàn)，此外，將光譜探測單元(12)中的光譜儀(17)替換成光電點探測器(31)，旋轉(zhuǎn)偏振片(30)可以實現(xiàn)光譜掃描輸出，進而激發(fā)cars光譜并由光電點探測器(31)探測得到cars光譜信號；

本發(fā)明提供了一種反射式共焦cars顯微光譜測試裝置，包括激光發(fā)射單元(1)、光譜激發(fā)單元、二向色單元(11)、光譜探測單元(12)、共焦探測單元(18)、計算機(32)；其中，光譜激發(fā)單元位于激光發(fā)射單元(1)出射方向、二向色單元(11)位于光譜激發(fā)單元出射方向、光譜探測單元(12)位于二向色單元(11)透射方向、共焦探測單元(18)位于二向色單元(11)反射方向。激光發(fā)射單元(1)由單波長脈沖激光器(2)、超連續(xù)譜脈沖激光器(3)、帶通濾光片(4)和二向色鏡(5)組成；光譜激發(fā)單元由半反半透棱鏡(6)、z向平移臺(7)、顯微物鏡(8)、待測樣品(9)和x-y平移臺(10)組成；二向色單元(11)即二向色鏡(11)；光譜探測單元(12)由帶通濾光片(13)、第一會聚鏡(14)、第一針孔(15)、第二會聚鏡(16)和光譜儀(17)組成；共焦探測單元(18)由第三會聚鏡(19)、第二針孔(20)、第一光電探測器(21)組成，其中，第二針孔(20)位于第三會聚鏡(19)的焦點位置。

本發(fā)明裝置中，激發(fā)cars光譜的方式包括：當單波長激光器(2)發(fā)出的光作為斯托克斯光和探測光，連續(xù)譜激光器(3)發(fā)出的連續(xù)譜激光作為泵浦光；當連續(xù)譜激光器(3)發(fā)出的連續(xù)譜激光作為斯托克斯光，單波長激光器(2)發(fā)出的光作為泵浦光和探測光；

本發(fā)明裝置中，光譜探測單元(12)中光譜儀(17)前添加一個針孔(15)過濾雜散光。

本發(fā)明裝置中，濾光片(4)與濾光片(13)的濾光譜帶關(guān)于單波長激光器(2)的中心波長對稱，兩濾光片可更換。

有益效果

本發(fā)明方法，對比已有技術(shù)具有以下創(chuàng)新點：

1、本發(fā)明融合了共焦顯微技術(shù)和cars光譜探測技術(shù)，通過共焦響應(yīng)曲線最大值點與高精度顯微物鏡的焦點精確對應(yīng)這一特性，精確定焦樣品，在獲得幾何位置的同時獲得最佳cars信號，在大幅提高現(xiàn)有cars光譜顯微鏡的微區(qū)光譜探測能力的同時也大大簡化了系統(tǒng)的光路結(jié)構(gòu)，這是區(qū)別于現(xiàn)有cars光譜探測技術(shù)的創(chuàng)新點之一；

2、本發(fā)明利用二向色分光裝置對系統(tǒng)收集到的瑞利光和載有樣品信息的cars光進行分光，然后瑞利光進入共焦探測單元，cars光進入光譜探測單元，實現(xiàn)光能的合理利用，并提高系統(tǒng)的光譜探測靈敏度，而且二向色分光裝置可以根據(jù)需求調(diào)整角度，有利于cars光譜探測的實現(xiàn)。這是區(qū)別于現(xiàn)有cars光譜探測技術(shù)的創(chuàng)新點之二；

3、本發(fā)明將共焦顯微系統(tǒng)和cars光譜成像系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)上和功能上結(jié)合，可實現(xiàn)樣品微區(qū)幾何參數(shù)的層析成像，又可實現(xiàn)樣品微區(qū)的光譜探測，還可以結(jié)合系統(tǒng)獲得的幾何位置信息和光譜信息實現(xiàn)圖譜層析成像，這是區(qū)別于現(xiàn)有cars光譜探測技術(shù)的創(chuàng)新點之三；。

本發(fā)明方法，對比已有技術(shù)具有以下顯著優(yōu)點：

1、結(jié)合共焦技術(shù)實現(xiàn)精確定焦，大幅提高cars光譜探測的空間分辨力；

2、本發(fā)明具有幾何測量、光譜測試及圖譜層析成像三種功能，與時俱進，更大程度滿足cars光譜測試的要求。

3、本發(fā)明采用寬譜帶激光與單波長激光組合的方式，實現(xiàn)了寬譜帶cars光譜測量。

附圖說明

圖1為摘要附圖，即本發(fā)明基本實施圖；

圖2為相干反斯托克斯(cars)光激發(fā)原理圖；

圖3為cars光與泵浦光、斯托克斯光的關(guān)系圖

圖4為傳統(tǒng)偏振探測顯微光路圖；

圖5為共焦cars測試方法示意圖；

圖6為二向鏡方向可變的共焦cars測試方法示意圖；

圖7為加光瞳濾波器的共焦cars測試方法示意圖；

圖8為改進光譜探測的共焦cars顯微測試方法示意圖；

圖9為單激光器光源的共焦cars顯微測試方法示意圖；

圖10為時域掃描的共焦cars顯微測試方法示意圖；

圖11為反射式共焦cars顯微測試裝置示意圖，即實施例用圖；

其中，1-激光發(fā)射單元、2-單波長激光光源、3-超連續(xù)譜激光光源、4-帶通濾光片、5-二向色鏡、6-分光棱鏡、7-z向平移臺、8-顯微物鏡、9-被測樣品、10-x-y平移載物臺、11-二向色鏡、12、光譜探測單元、13-帶通濾光片、14-第一會聚鏡、15-第一針孔、16-第二會聚鏡、17-光譜儀、18-共焦探測單元、19-第三會聚鏡、20-第二針孔、21-第一光電探測器、22-光斑、23-共焦曲線、24-光瞳濾波器、25-偏振分光棱鏡、26-光子晶體光纖、27-第一反射鏡、28-光學(xué)延時線、29第二反射鏡、30-偏振片、31-光電點探測器、32-計算機；

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。

圖5是共焦cars測試方法示意圖，激光發(fā)射單元(1)發(fā)射出單波長脈沖激光和連續(xù)譜段脈沖激光的混合光束(兩脈沖激光空間重合，時間一致)，經(jīng)分光棱鏡(6)和顯微物鏡(8)直射在被測樣品(9)表面，激發(fā)出瑞利散射光和載有被測樣品(9)光譜信息的cars光；瑞利光和cars光被系統(tǒng)回收至光路中，經(jīng)物鏡(8)被分光棱鏡(6)反射至二色向鏡(11)進行分光，其中cars光透射進入光譜探測單元(12)進行光譜探測，瑞利光反射進入共焦探測單元(18)進行幾何探測。其中，二向色鏡(11)與分光棱鏡(6)反射光束軸線的夾角可變，相對應(yīng)的共焦探測單元(18)的位置可以調(diào)整，即圖6所示，這種結(jié)構(gòu)設(shè)計有利于本發(fā)明方法的實現(xiàn)。

在分光棱鏡(6)和顯微物鏡(8)之間添加光瞳濾波器(24)，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光束，即圖7所示，此結(jié)構(gòu)可以提高光譜探測的空間分辨力；

將顯微物鏡(8)固定在高精度z向平移臺(7)，被測樣品(9)放置在高精度x-y平移臺(10)，結(jié)合光譜探測單元(12)、共焦探測單元(18)可實現(xiàn)高空間分辨顯微光譜測量；在光譜探測單元(12)中，在光譜儀(17)前添加第一針孔(15)過濾雜散光可以實現(xiàn)高信噪比的光譜測量，整個光路組成構(gòu)成了高精度共焦cars顯微測量方法，即圖8。

圖9是單激光器共焦cars顯微測試方法示意圖，目的是將激光發(fā)射單元的雙激光器輸入改為單激光器輸入，降低成本；單波長脈沖激光器(2)發(fā)出單波長激光，經(jīng)偏振分光棱鏡(25)分光，透射部分進入光子晶體光纖(26)進行譜帶展寬并用帶通濾波片(4)進行特定要求波長截取，反射部分經(jīng)第一反射鏡(27)、光學(xué)延時線(28)和第二反射鏡(29)后與展寬后的連續(xù)譜激光在二向色鏡(5)處進行耦合，輸出空間一致、時間一致的混合光束，對被測樣品進行cars光譜激發(fā)。其中，光學(xué)延時線(28)的作用是保證兩束激光時序重合。

將圖9中光譜探測單元(12)中的光譜儀(17)替換成光電點探測器(31)，在偏振分光棱鏡(25)和光子晶體光纖(26)之間添加偏振片(30)，即構(gòu)成圖10；通過旋轉(zhuǎn)偏振片(30)，改變光束的偏振態(tài)，使光子晶體光纖(26)輸出的光束實現(xiàn)光譜掃描輸出，結(jié)合光學(xué)延時線(28)可以實現(xiàn)時域掃描cars光譜激發(fā)，進而實現(xiàn)寬譜帶的cars光譜測量。

實施例

在本實施例中，采用波長為1064nm的皮秒激光器作為泵浦光源和探測光源，采用重復(fù)頻率與之一致的超連續(xù)譜皮秒激光器添加1100～1300nmm帶通濾光片作為斯托克斯光源，在滿足空間重合，時間一致的條件下混合出射，通過高倍顯微物鏡緊聚焦在樣品上，此時滿足相位匹配條件，激發(fā)出波長范圍在900～1030nm的反斯托克斯散射光(cars)。

如圖11所示,反射式共焦cars顯微光譜測試裝置，其測試步驟如下：

首先，在激光發(fā)射單元(1)中，超連續(xù)譜激光器(3)發(fā)出的連續(xù)譜激光通過帶通濾光片(4)濾光后得到1100～1300nm的寬譜帶激光，然后與單波長(1064nm)激光器(2)發(fā)出單色激光在二向色鏡(5)處匯合，形成混合光束，其中，兩束激光重復(fù)頻率一致，到達分光片時間一致，光束匯合后能夠完全重合(泵浦光斑完全包絡(luò)于斯托克斯光斑里)；混合光束經(jīng)光瞳濾波器(24)調(diào)制后通過位于z向平移臺(7)上的顯微物鏡(8)緊聚焦在被測樣品(9)上，激發(fā)出瑞利光和載有被測樣品(9)光譜特性的cars光。

此時，對樣品掃描可通過以下方式完成：由位于顯微物鏡上的pzt實現(xiàn)z向掃描，由位于樣品下的載物臺實現(xiàn)x-y方向位移掃描，或在激光出射后的光路中添加振鏡掃描結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)x-y方向掃描。

被測樣品反射回的光束包含斯托克斯光、泵浦光、瑞利光、cars光；其中，cars光和斯托克斯光進入光譜探測單元(12)，1064nm的泵浦光和瑞利光經(jīng)二向色鏡(11)反射進入共焦探測單元(18)。在光譜探測單元(12)中，由斯托克斯光和cars光混合的光先經(jīng)過900～1030nm的帶通濾光片(13)后只保留cars光，然后通過第一會聚鏡(14)會聚通過第一針孔(15)，過濾環(huán)境光干擾后再由第二會聚鏡(16)會聚進入光譜儀(17)，從而探測得到cars光譜i(x,y,λ)，其中x,y表示當前測量橫向位置，λ為被測樣品(9)受激發(fā)光所激發(fā)出cars光的波長。在共焦探測單元(18)中，瑞利光經(jīng)過第三會聚鏡(19)會聚后通過第二針孔(20)過濾環(huán)境干擾光后，被第一光電探測器(21)所探測，得到共焦信號i(x,y,z)，其中x,y,z表示當前測量點的三維位置；

在標準測量模式下，計算機(32)控制x-y平移臺(10)和z向平移臺(7)移動，實現(xiàn)三維掃描，通過共焦探測單元實現(xiàn)z向跟蹤測量，得到共焦響應(yīng)曲線(23)，根據(jù)共焦強度曲線最大值點與測量物鏡焦點位置精確對應(yīng)這一特性，確定測量點的z向高度，結(jié)合x-y平移臺位置，得到被測樣品三維信息i(x,y,z)。得到準確的z向位置后，計算機控制z向平移臺(7)使顯微物鏡(8)精確定焦，然后光譜探測單元(12)對被測樣品cars光譜信息進行測量，得到當前測量點的cars光譜i(x,y,λ)。

i(x,y,z)+i(x,y,λ)＝i(x,y,z,λ)

將三維幾何信息和光譜信息結(jié)合，即實現(xiàn)了高空間分辨的cars光譜探測。

以上，沿激光出射方向，依次放置激光發(fā)射單元(1)，分光棱鏡(6)，在分光棱鏡(6)透射方向放置光瞳濾波器(24)、z向平移臺(7)、顯微物鏡(8)、被測樣品(9)、x-y平移臺(10)，在分光棱鏡(6)反射方向放置二向色鏡(11)，在二向色鏡(11)透射方向放置光譜探測單元(12)，在二向色鏡(11)反射方向放置共焦探測單元(18)。激光發(fā)射單元(1)包括位于二向色鏡(5)透射方向的超連續(xù)譜激光器(3)、帶通濾光片(4)和二向色鏡(5)反射方向的單波長脈沖激光器(2)；光譜探測單元(12)中依次放置帶通濾光片(13)、第一會聚鏡(14)、第一針孔(15)、第二會聚鏡(16)、光譜儀(17)；共焦探測單元(18)中依次放置第三會聚鏡(19)、第二針孔(20)、第一光電探測器(21)；在整個系統(tǒng)中，單波長脈沖激光器(2)、超連續(xù)譜激光器(3)、x-y平移臺(10)、z向平移臺(7)、光譜儀(17)、第一光電探測器(21)均受計算機(32)控制，系統(tǒng)得到的三維位置信息和光譜信息也由計算機(32)進行融合處理。

以上結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作了說明，但這些說明不能被理解為限制了本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的保護范圍由隨附的權(quán)利要求書限定，任何在本發(fā)明權(quán)利要求基礎(chǔ)上進行的改動都是本發(fā)明的保護范圍。