本發明涉及應用核磁共振的代謝組學技術鑒別ic50劑量維生素c對raw264.7和k562細胞差異性標志物的方法，屬于¹hnmr的代謝組學分析技術。

背景技術：

代謝組學：

代謝組學是鑒定和定量小分子代謝物的分析技術，通過現代超高效液相色譜/高分辨質譜聯用等技術分析體液中的代謝物組成譜，利用多變量統計分析技術把所有代謝物的信息整合到一起，在系統和整體層面上比較和分析生物的差異性代謝物的技術。

目前常用的檢測儀器有高效液相色譜(hplc)、氣相色譜(gc)、質譜(ms)、核磁共振(nmr)、紅外光譜(ir)等，其中核磁共振技術靈敏度較高，重復性好，樣品處理簡便，成本較低，可體外、體內檢測，可對代謝物變化進行定性和定量分析。

維生素c代謝物鑒定現狀：

維生素c(vitaminc)，又名l-抗壞血酸，一種強氧化劑，是許多重要酶的輔因子。根據who(worldhealthorganization)數據表明正常成年人對維生素c的推薦攝入量(recommendednutrientintakes,rnis)為10mg/day，可耐受最高攝入量(tolerableupperintakelevel,ul)為2000mg/day，目前尚未有利用核磁共振代謝組學方法同時研究體外高劑量維生素c對于正常細胞和癌細胞的影響。已知高劑量維生素c對癌癥的細胞毒性比對正常細胞的細胞毒性大，但作用機理未知。目前有文獻利用毛細管-飛行時間質譜技術(ce-tofms)探究了ic50劑量維生素c對糖酵解、三羧酸循環(tca)和磷酸戊糖途徑(ppp)中相關代謝物的影響，但代謝物變化的生物學意義尚不清楚；且維生素c誘導的細胞中代謝物變化情況未知，生物學意義也未知。

因此，有必要研究維生素c在小鼠巨噬細胞raw264.7和慢性髓性白血病胸腔積液淋巴細胞k562的ic50濃度時，對不同細胞差異性代謝產物以及代謝通路的影響，這有助于進一步了解維生素c的亞毒性，對高劑量維生素c的作用提供一基礎性研究。

技術實現要素：

針對現有技術中的不足，本發明的第一個目的是提供一種ic50劑量維生素c對raw264.7或k562細胞亞毒性的分析方法，包括以下步驟：

(1)確定維生素c對raw264.7或k562細胞的ic50劑量；

(2)細胞萃取液的制備：

維生素c組細胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細胞在相應的維生素cic50劑量下進行培養，培養24h后加入冷甲醇使細胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進行超聲破碎提取，收集水相；

空白組細胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細胞進行培養，培養24h后加入冷甲醇使細胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進行超聲破碎提取，收集水相；

(3)核磁共振預處理：

將維生素c組和空白組的水相蒸干后采用含有(3－三甲基硅烷基)－2,2,3,3－四氘代丙酸鈉(tsp)的d2o溶解，離心，凍干；將凍干之后的樣品用d2o配制的磷酸鹽緩沖液溶解，離心，得到上清液；

(4)¹h核磁共振檢測：將核磁共振預處理后的維生素c組和空白組的上清液進行核磁共振檢測，獲得細胞核磁共振譜圖，從而得到raw264.7或k562細胞樣品中代謝物的信號值；

(5)差異性代謝物的篩選：將細胞核磁共振譜圖的積分面積進行歸一化處理，得到積分面積數據，使用偏最小二乘判別(pls-da)和正交-偏最小二乘判別(opls-da)分析數據，并采用排列實驗進行驗證篩選差異性變量，選取偏最小二乘判別(pls-da)中第一主成分的變量權重重要性排序值>0.1的代謝物作為差異性代謝物，并得到差異性代謝物的變化趨勢；

(6)代謝通路分析：將確定的差異性代謝物導入京都基因與基因組百科全書數據庫中，歸屬出相關的代謝通路；通過代謝組學數據分析軟件metaboanalyst對差異性代謝物進行代謝通路富集分析，得到由差異性代謝物歸屬出的代謝影響分析通路以及代謝序列富集分析通路，代謝影響分析通路的通路影響值>0.1的代謝通路以及代謝序列富集分析通路的通路影響值<0.1的代謝通路均被識別為基于維生素c組受到顯著影響的通路；最后從所述受到顯著影響的通路中篩選出具有代表性的代謝途徑。

基于以上ic50劑量維生素c對raw264.7或k562細胞亞毒性的分析，本發明的第二個目的是提供以下任一應用：

(1)促進半乳糖代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細胞亞毒性的試劑中的應用；

(2)抑制谷胱甘肽代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細胞亞毒性的試劑中的應用；

(3)抑制丙酮酸代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細胞亞毒性的試劑中的應用；

(4)抑制果糖和甘露糖代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細胞亞毒性的試劑中的應用；

(5)抑制糖異生途徑試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細胞亞毒性的試劑中的應用；

(6)促進甘油酯代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的癌細胞亞毒性的試劑中的應用；

(7)促進磷酸肌醇代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細胞亞毒性的試劑中的應用；

(8)抑制甜菜堿代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細胞亞毒性的試劑中的應用。

本發明的第三個目的是提供一種ic50劑量維生素c對raw264.7或k562細胞的差異性代謝物的篩選方法，包括以下步驟：

(1)確定維生素c對raw264.7或k562細胞的ic50劑量；

(2)細胞萃取液的制備：

維生素c組細胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細胞在相應的維生素cic50劑量下進行培養，培養24h后加入冷甲醇使細胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進行超聲破碎提取，收集水相；

空白組細胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細胞進行培養，培養24h后加入冷甲醇使細胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進行超聲破碎提取，收集水相；

(3)核磁共振預處理：

將維生素c組和空白組的水相蒸發后采用含有(3－三甲基硅烷基)－2,2,3,3－四氘代丙酸鈉(tsp)的d2o溶解，離心，凍干；將凍干之后的樣品用d2o配制的磷酸鹽緩沖液溶解，離心，得到上清液；

(4)¹h核磁共振檢測：將核磁共振預處理后的維生素c組和空白組的上清液進行核磁共振檢測，獲得細胞核磁共振譜圖，從而得到raw264.7或k562細胞樣品中代謝物的信號值；

(5)差異性代謝物的篩選：

將細胞核磁共振譜圖的積分面積進行歸一化處理，得到積分面積數據，使用偏最小二乘判別(pls-da)和正交-偏最小二乘判別(opls-da)分析數據，并采用排列實驗進行驗證篩選差異性變量，選取偏最小二乘判別(pls-da)中第一主成分的變量權重重要性排序值>0.1的代謝物作為差異性代謝物。

本發明的第四個目的是提供一種ic50劑量維生素c對raw264.7或k562細胞的差異性代謝物，包括：

raw264.7細胞的差異性代謝物為d-葡糖酸-1,5-內酯、l-乳酸、甲酸鹽、甘油、乙醇酸鹽、dl-α-甘油磷酸酯、乙酸、山梨糖醇、赤蘚糖醇、肌醇、l-絲氨酸、木糖醇、葡糖酸、甘氨酸、l-半胱氨酸、氧化三甲胺、d-果糖、戊二酸、半胱胺、核糖醇、甲醇、α—酮戊二酸、n,n-二甲基甲酰胺、3-羥基-3-甲基戊二酸和腐胺；

k562細胞的差異性代謝物為三甲胺、肌醇、赤蘚糖醇、核糖醇、甘油和n,n-二甲基甘氨酸。

與現有技術相比，本發明的技術方案具有如下有益效果：

(1)用¹hnmr的代謝組學技術能夠對體外細胞raw264.7和k562細胞中的差異性代謝物信息進行一個整體的獲得。

¹hnmr可以檢測到所有含氫原子的代謝產物的信號，提供所有含氫原子的代謝物的圖譜信息。代謝物是疾病、藥物、食物等與體內相互作用的最終體現，代謝組學方法能夠將維生素c組和空白對照組的差異性代謝物進行鑒定和定量，為探討維生素c與體內的相互作用提供借鑒信息。

(2)前處理方法操作簡單。

本發明最終確定采用甲醇氯仿水提取法，甲醇、氯仿、超純水的比例為4:4:2.8～2.9，超聲破碎收集水相。旋轉蒸發儀蒸干后溶于d2o，凍干機凍干重溶于d2o及磷酸緩沖液即可待測，方法簡單，重復性好。

(3)數據預處理可靠快捷，可利用網站信息對差異性代謝物進行鑒定和定量。

數據預處理包括傅里葉變換、加指數窗函數(提高信噪比)、相位和基線校正、定標及去除溶劑峰和其他雜峰、譜峰對齊、分段積分和面積歸一化等，通過數據預處理使數據更加規整，減少水峰的干擾，使后續更加準確。利用豐富的網站信息可對代謝物進行鑒定和定量，結果相對更加準確。

(4)體外條件下探究ic50濃度的維生素c對細胞的代謝物產生的影響，并對差異性代謝物進行信號通路富集分析，為基礎性研究提供理論基礎。

(5)體外可以達到人體內不能達到的維生素c濃度，對于探究高劑量維生素c利弊提供借鑒意義。

(6)ic50劑量維生素c對raw264.7或k562細胞的差異性代謝物為兩種細胞的代謝通路分析提供基礎。

附圖說明

構成本發明的一部分的說明書附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。

圖1是維生素c對raw264.7細胞存活率的影響及線性回歸方程，注：**p＜0.01vc組vs空白組。

圖2是維生素c對k562細胞存活率的影響及線性回歸方程，注：**p＜0.01vc組vs空白組。

圖3是raw264.7細胞vc組和空白組的pca得分圖。

圖4是raw264.7細胞vc組和空白組的pls-da得分圖。

圖5是raw264.7細胞vc組和空白組pls-da分析的置換排列驗證圖。

圖6是raw264.7細胞vc組和空白組opls-da得分圖。

圖7是raw264.7細胞vc組和空白組¹hnmr譜圖。

圖8(a)是raw264.7細胞中由差異性代謝產物歸屬出的代謝通路，1.氰基氨基酸代謝；2.乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝；3.甲烷代謝；4.丙酮酸代謝；5.三羧酸循環；6.賴氨酸降解；7.丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝；8.酪氨酸代謝；9.丁酸代謝；10.牛磺酸和亞牛磺酸代謝；11.硫代謝；12.維生素b6代謝；13.苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成；14.硒氨基酸代謝；15.氮代謝；16.脂肪酸代謝；17.d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代謝；18.氨酰trna的生物合成；19.硫胺代謝；20.脂肪酸在線粒體中的延長；21.糖酵解或糖異生；22.賴氨酸生物合成；23.泛醌和其他萜醌類生物合成；24.葉酸生物合成；25.苯丙氨酸代謝；26.組氨酸代謝；27.戊糖和葡萄糖醛酸鹽互變；28.半胱氨酸和甲硫氨酸代謝。

圖8(b)是raw264.7細胞代謝產物組富集概述圖，由上至下分別為：蛋氨酸代謝、半乳糖代謝、氨循環、牛磺酸和亞牛磺酸代謝、谷胱甘肽代謝、甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝、果糖和甘露糖代謝、丙酮酸代謝、丙氨酸代謝、糖異生、半胱氨酸代謝、蘋果酸-天冬氨酸代謝、泛酸和輔酶a的生物合成、葡萄糖-丙氨酸循環、甘油脂代謝、淀粉和蔗糖代謝、鞘脂代謝、戊糖磷酸途徑、谷氨酸代謝、肌醇代謝、蛋白質生物合成、尿素循環、卟啉代謝、檸檬酸循環和膽汁酸生物合成。

圖9是k562細胞vc組和對照組的pca得分圖。

圖10是k562細胞vc組和對照組的pls-da得分圖。

圖11是k562細胞vc組和空白組pls-da分析的置換排列驗證圖。

圖12是k562細胞vc組和對照組的opls-da得分圖

圖13是k562細胞vc組和對照組¹hnmr譜圖。

圖14(a)是k562細胞中由差異性代謝產物歸屬出的代謝通路，1.甘油脂代謝；2.肌醇磷酸代謝；3.甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝；4.半乳糖代謝；5.核黃素代謝；6.甲烷代謝；7.維生素c代謝；8.戊糖和葡萄糖醛酸鹽互變。

圖14(b)是k562細胞代謝產物組富集概述圖，由上至下分別為：半乳糖代謝、甜菜堿代謝、甘油脂代謝、肌醇代謝、蛋氨酸代謝和甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝。

具體實施方式

應該指出，以下詳細說明都是示例性的，旨在對本發明提供進一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據本發明的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式也意圖包括復數形式，此外，還應當理解的是，當在本說明書中使用術語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。

本發明對術語的解釋：

亞毒性：是指具有毒性或有小毒而未列入國務院《醫療用毒性藥品管理法》規定的有毒中藥品種，臨床使用過量或應用不當會中毒或產生嚴重不良反應,應用或藥房管理上需加以注意。

ic50(halfmaximalinhibitoryconcentration)：是指被測量的拮抗劑的半抑制濃度

raw264.7：小鼠腹腔巨噬細胞細胞系，也是常用的炎癥細胞模型之一。

k562：人慢性髓性白血病胸腔積液淋巴細胞。

topspin3.2：一種核磁分析軟件。

simca-p軟件：多元分析軟件。

pca：主成分分析(principalcomponentsanalysis)，是一種無監督的模式統計方法。通過正交變換將一組可能存在相關性的變量轉換為一組線性不相關的變量，轉換后的這組變量叫主成分。

pls-da：偏最小二乘判別(partialleastsquaresprojectiontolatentstructure-discriminantanalysis)，是一種有監督的模式統計方法，利用偏最小二乘法對數據結構進行投影分析。

opls-da：正交-偏最小二乘判別分析(orthogonal-pls-da)，將正交信號校正方法(orthogonalsignalcorrection,osc)與pls-da進行結合從而對pls-da進行修正的分析方法。

京都基因和基因組百科全書(kegg)：是系統分析基因功能、聯系基因組信息和功能信息的數據庫。

metaboanalyst：是一種代謝組學數據分析網站，能夠由差異性代謝產物歸屬出代謝通路。

正如背景技術中所介紹的，現有技術中缺少一種ic50劑量維生素c對raw264.7和k562細胞的影響分析方法，針對以上技術問題，本發明的目標是采用半抑制濃度(ic50)維生素c處理raw264.7細胞和k562細胞兩種細胞系，利用核磁共振氫譜分析比較兩種細胞系在代謝水平的變化。針對此，本發明的第一個方面，提出一種ic50劑量維生素c對raw264.7或k562細胞亞毒性的分析方法，該方法包括以下步驟：

(1)確定維生素c對raw264.7或k562細胞的ic50劑量；

采用mtt法確定維生素c對raw264.7或k562細胞的ic50劑量，其中，raw264.7的ic50為920mm，k562的ic50為800mm。

(2)細胞萃取液的制備：

維生素c組細胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細胞在相應的維生素cic50劑量下進行培養，培養后加入冷甲醇使細胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進行超聲破碎提取，收集水相；

空白組細胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細胞進行培養，培養后加入冷甲醇使細胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進行超聲破碎提取，收集水相；

在制備細胞萃取液的過程中，針對raw264.7或k562細胞這兩種細胞的組織結構和成分，為了保證盡可能多的獲取維生素c組細胞和空白組細胞代謝物信息，提取試劑優先選用的是甲醇、氯仿和超純水的混合溶劑，對細胞樣品進行多次超聲破碎提取，提取后即可進行核磁共振預處理，前處理步驟簡單，易于操作。

為達到較好的提取代謝物的效果、更有利于提高后續差異性代謝物、代謝通路分析的準確性，本發明采用的提取劑為甲醇、氯仿和超純水的混合溶液，體積比例為4:4:2.8～2.9，在本發明的優選的技術方案中，甲醇、氯仿和超純水的體積比例為4:4:2.85。

(3)核磁共振預處理：

將維生素c組和空白組的水相蒸發后采用含有(3－三甲基硅烷基)－2,2,3,3－四氘代丙酸鈉(tsp)的d2o溶解，離心，凍干；將凍干之后的樣品用d2o配制的磷酸鹽緩沖液溶解，離心，得到上清液；

核磁共振待測樣品制備階段，樣品的預處理方法會對核磁共振檢測結果和主成分分析的準確性產生影響，由于代謝組學需要高通量的試驗數據，必須保證數據的穩定性和可比較性，基于對核磁共振檢測影響，本發明建立了針對raw264.7或k562細胞萃取液的預處理方法。故在本發明的優選的技術方案中，核磁共振預具體的處理方法是：將維生素c組和空白組的水相蒸干后用900μl含有0.1％(w/w)tsp的d2o溶解，離心后取上清液凍干，將凍干的樣品用d2o配制的磷酸鹽緩沖液溶解至650μl，離心后取上清液至核磁管中，待測。

(4)核磁共振檢測：將核磁共振預處理后的維生素c組和空白組的上清液進行核磁共振檢測，獲得細胞核磁共振譜圖，從而得到raw264.7或k562細胞樣品代謝物的信號值，該信號值指的是不同化學位移處的核磁信號，每個信號峰既包含了代謝物的定性信息，也包含了定量信息，定性信息就是該代謝物的特征譜圖和化學位移，定量信息就是該代謝物的核磁響應強度，如峰高、峰面積；

核磁共振樣品檢測階段中，核磁共振的檢測參數對核磁共振檢測結果產生影響，代謝組學是一種需要高通量試驗數據的技術，必須保證試驗數據的穩定性，本發明篩選優化得到一套針對raw264.7或k562細胞萃取液的核磁共振檢測條件。所有的核磁共振氫譜都采用配備了¹³c、¹h雙優化5mmcptci三共振反式超低溫探頭的iii600mhz超導超屏蔽傅立葉變換核磁共振波譜儀檢測。其中質子共振頻率為600.104mhz，脈沖序列為zg30，譜寬為12019.230hz，累加次數為256次，空采次數為2次，實驗溫度為298k，使用topspin3.2(brukerbiospin,germany)處理譜圖。

(5)差異性代謝物的篩選：核磁共振譜圖使用mestrenova6.11(mestrelabresearch,espain)處理，所有譜圖添加指數窗函數(exponential:0.5)，以提高信噪比。手動相位矯正，基線矯正后，用tsp定標，手動切除水峰，選取0.002ppm為間隔標準分段積分，這一間隔標準能夠提高細胞萃取液譜峰的識別度，減小核磁共振譜峰重疊引起的誤差，之后對譜圖積分面積進行歸一化。積分面積數據以excel文件保存，分組編號。之后，將數據導入simca-p+12.0軟件(umetricsinc.,umea,sweden)中。使用偏最小二乘判別分析(pls-da)分析數據。為了確保pls-da模型建立的可信性，運用排列實驗進行驗證篩選差異性變量。根據第一主成分的變量權重重要性排序值(vip)和載荷權重(loadingweights)確定差異性代謝產物。選取在偏最小二乘判別分析(pls-da)中vip值大于1的物質，判定為差異性代謝產物。載荷權重的正負代表相關差異性代謝產物在空白組與維生素c組中的上下調關系。最后通過人類代謝組數據庫(hmdb)以及生物核磁共振數據庫(bmrb)進行定性分析，得到差異性代謝產物的種類名稱。

(6)代謝通路分析：將確定的差異性代謝產物導入京都基因與基因組百科全書(kegg)數據庫獲得kegg號，然后metaboanalyst(metpa)中進行通路富集分析，得到由差異性代謝物歸屬出的代謝影響分析通路以及代謝序列富集分析通路，代謝影響分析通路的通路影響值>0.1的代謝通路和代謝序列富集分析通路的通路影響值<0.1的代謝通路均被識別為基于維生素c組受到顯著影響的通路；最后從所述受到顯著影響的通路中篩選出具有代表性的代謝途徑。

篩選具有代表性的代謝途徑時，將各種氨基酸、牛磺酸和亞牛磺酸、乙醛酸鹽、二羧酸鹽代謝、甲烷代謝、氨循環等代謝途徑排除，因為當細胞受到ic50劑量維生素c作用時，上述的代謝途徑均為常規的代謝途徑(或者屬于細胞的基礎代謝途徑)，并不可以作為代表性的代謝途徑。

基于以上ic50劑量維生素c對raw264.7或k562細胞亞毒性的分析研究，本發明的第二個方面，提出下述任一應用：

(1)促進半乳糖代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細胞亞毒性的試劑中的應用；

(2)抑制谷胱甘肽代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細胞亞毒性的試劑中的應用；

(3)抑制丙酮酸代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細胞亞毒性的試劑中的應用；

(4)抑制果糖和甘露糖代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細胞亞毒性的試劑中的應用；

(5)抑制糖異生途徑試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細胞亞毒性的試劑中的應用；

(6)促進甘油酯代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的癌細胞亞毒性的試劑中的應用；

(7)促進磷酸肌醇代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細胞亞毒性的試劑中的應用；

(8)抑制甜菜堿代謝試劑在制備治療由ic50劑量維生素c引起的正常細胞亞毒性的試劑中的應用。

其中，促進半乳糖代謝試劑為能夠促進體內細胞半乳糖代謝的試劑，使得細胞內的半乳糖的含量降低。

抑制谷胱甘肽代謝的試劑為能夠抑制體內細胞谷胱甘肽代謝的試劑，使得細胞內的谷胱甘肽的含量增加。

抑制丙酮酸代謝試劑為能夠抑制體內細胞丙酮酸代謝的試劑，使得細胞內的丙酮酸的含量增加。

抑制果糖和甘露糖代謝試劑為能夠抑制體內細胞果糖和半乳糖代謝的試劑，使得細胞中的果糖和甘露糖的含量增加。

抑制糖異生途徑試劑為能夠抑制體內細胞糖異生途徑發生的試劑，使得細胞中的非糖前體(例如：乳酸、甘油、生糖氨基酸等)的含量增加。

促進甘油酯代謝試劑為能夠促進體內細胞甘油酯代謝的試劑，使得細胞中的甘油酯的含量增加。

促進磷酸肌醇代謝試劑為能夠促進體內細胞磷酸肌醇代謝的試劑，使得細胞中的磷酸肌醇的含量增加。

抑制甜菜堿代謝試劑為能夠促進體內細胞甜菜堿代謝的試劑，使得細胞中的甜菜堿的含量降低。

所述的正常細胞為小鼠巨噬細胞raw264.7，所述的癌細胞為人白血病淋巴細胞k562。

本發明的第三個方面，提供一種ic50劑量維生素c對raw264.7或k562細胞的差異性代謝物的篩選方法，包括以下步驟：

(1)確定維生素c對raw264.7或k562細胞的ic50劑量；

(2)細胞萃取液的制備：

維生素c組細胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細胞在相應的維生素cic50劑量下進行培養，培養后加入冷甲醇使細胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進行超聲破碎提取，收集水相；

空白組細胞萃取液的制備：將raw264.7或k562細胞進行培養，培養后加入冷甲醇使細胞代謝淬滅，然后采用甲醇氯仿水提取法進行超聲破碎提取，收集水相；

(3)核磁共振預處理：

將維生素c組和空白組的水相蒸發后采用含有(3－三甲基硅烷基)－2,2,3,3－四氘代丙酸鈉(tsp)的d2o溶解，離心，凍干；將凍干之后的樣品用d2o配制的磷酸鹽緩沖液溶解，離心，得到上清液；

(4)¹h核磁共振檢測：將核磁共振預處理后的維生素c組和空白組的上清液進行核磁共振檢測，獲得細胞核磁共振譜圖，從而得到raw264.7或k562細胞樣品中代謝物的信號值；

(5)差異性代謝物的篩選：

將細胞核磁共振譜圖的積分面積進行歸一化處理，得到積分面積數據，使用偏最小二乘判別(pls-da)和正交偏最小二乘判別分析(opls-da)進行數據分析，并采用排列實驗進行驗證篩選差異性變量，選取偏最小二乘判別(pls-da)中第一主成分的變量權重重要性排序值>0.1的代謝物作為差異性代謝物。

每一步的具體技術方案可參照本發明的第一個方面。

本發明的第四個方面，提供一種ic50劑量維生素c對raw264.7或k562細胞的差異性代謝物，包括：

raw264.7細胞的差異性代謝物為d-葡糖糖酸-1,5-內酯、乳酸、甲酸、甘油、乙醇酸、dl-α-甘油磷酸、乙酸、山梨糖醇、赤蘚糖醇、肌醇、l-絲氨酸、木糖醇、葡糖酸、甘氨酸、半胱氨酸、氧化三甲胺、d-果糖、戊二酸、半胱胺、核糖醇、甲醇、α—酮戊二酸、n,n-二甲基甲酰胺、3-羥基-3-甲基戊二酸和腐胺；

k562細胞的差異性代謝物為三甲胺、肌醇、赤蘚糖醇、核糖醇、甘油和二甲基甘氨酸。

ic50劑量維生素c對raw264.7或k562細胞的差異性代謝物為兩種細胞的代謝通路分析提供基礎。

本發明的主要技術創新

(1)用¹hnmr的代謝組學技術能夠對體外細胞raw264.7和k562細胞中的差異性代謝物信息進行一個整體的獲得。

¹hnmr可以檢測到所有含氫原子的代謝產物的信號，提供所有含氫原子的代謝物的圖譜信息。代謝物是疾病、藥物、食物等與體內相互作用的最終體現，代謝組學方法能夠將維生素c組和對照組的差異性代謝物進行鑒定和定量，為探討維生素c與體內的相互作用提供借鑒信息。

(2)前處理方法操作簡單。

本發明最終確定采用甲醇氯仿水提取法，甲醇、氯仿、超純水的比例為4:4:2.8～2.9，超聲破碎收集水相。前處理步驟簡單，易于操作。

核磁共振預處理方法操作簡單，旋轉蒸發儀蒸干后溶于d2o，凍干機凍干重溶于d2o及磷酸緩沖液即可待測，方法簡單，重復性好。從主成分分析的分析結果可知，通過該核磁共振預處理方法，主成分分析模型擬合的較好，模型的預測準確性高，同組內差異性較小，不同組的樣品分離更加明顯。

(3)數據預處理可靠快捷，可利用網站信息對差異性代謝物進行鑒定和定量。

數據預處理包括傅里葉變換、加指數窗函數(提高信噪比)、相位和基線校正、定標及去除溶劑峰和其他雜峰、譜峰對齊、分段積分和面積歸一化等，通過數據預處理使數據更加規整，減少水峰的干擾，使后續更加準確。利用豐富的網站信息可對代謝物進行鑒定和定量，結果相對更加準確。

為了使得本領域技術人員能夠更加清楚地了解本發明的技術方案，以下將結合具體的實施例詳細說明本發明的技術方案。

實施例1

1、方法原理

高濃度劑量的維生素c作用于細胞后會影響細胞的代謝水平，使細胞內代謝物種類和濃度發生改變，通過利用¹hnmr技術可以將維生素c處理后和對照組的差異性代謝物進行鑒定，然后利用代謝組學分析技術對所得的數據應用pca、pls-da、opls-da等技術進行分析，尋找差異性代謝物。通過人類代謝組數據庫(hmdb)以及生物核磁共振數據庫(bmrb)進行定性分析，確定差異性代謝物的種類名稱。將確定的差異性代謝產物導入京都基因與基因組百科全書(kegg)數據庫以及metaboanalyst(metpa)中進行通路富集分析。

2、儀器與材料

儀器與設備：

statfax-2000酶標儀美國awareness公司

labservco2培養箱美國thermofisher公司

epsilon2-4lscplus凍干機德國christ公司

5804r高速冷凍離心機德國eppendorf公司

sb-1000旋轉蒸發儀日本eyela公司

vc130pb細胞超聲波破碎儀美國sonic公司

avanceiii600mhz全數字化超導核磁共振波譜儀德國bruker公司

材料與試劑：

raw264.7細胞上海中科院細胞庫

k562細胞上海中科院細胞庫

維生素c(純度≥98％)美國sigma公司

含有0.1％tsp的d2o美國sigma公司

dmem培養基美國hyclone公司

rpmi1640培養基美國hyclone公司

二甲基亞砜北京solarbio公司

雙抗試劑、谷氨酰胺試劑北京邁晨公司

胎牛血清杭州四季青公司

3、樣品前處理

首先利用mtt實驗分別確定維生素c作用于raw264.7細胞和k562細胞的ic50濃度，分別用ic50濃度的維生素c處理細胞24小時，處理后用冷甲醇使細胞代謝猝滅；然后按甲醇：氯仿：超純水為4:4:2.85的體積比例即甲醇氯仿水提取法收集細胞，細胞懸液進行超聲破碎收集水相。旋轉蒸發儀將上清蒸干后溶于含有0.1％tsp的d2o，12000rpm，4℃離心取上清，凍干機凍干后重溶于650μld2o和d2o配制的磷酸緩沖液中，12000rpm，4℃離心15min后，取550μl上清加入5mm核磁管中，待核磁檢測。

4、核磁共振檢測

所有¹hnmr譜都采用配備¹³c、¹h雙優化5mmcptci三共振反式超低溫探頭的avance600ⅲ(bruker)超導超屏蔽傅立葉變換核磁共振波譜儀檢測。其中，質子共振頻率為600.104mhz，采用zg30脈沖序列，譜寬(swh)為12019.230hz，累加次數(ns)為256次，空采次數(ds)為2次，實驗溫度(te)為298k，使用topspin3.2(brukerbiospin,germany)處理譜圖。

5、成果展示

(1)mtt法確定維生素c對raw264.7細胞和k562細胞的ic50作用濃度。

為了確定維生素c對raw264.7和k562細胞活性的影響，本發明用含有不同濃度維生素c的培養基處理細胞，細胞活性的影響如圖1和2所示。mtt實驗結果表明，維生素c處理細胞24h后有明顯抑制作用，并且確定了兩種細胞不同的ic50濃度。

根據圖1，巨噬細胞raw264.7經mtt法最終確定的維生素c的ic50作用濃度為920mmol/l(21.528g/130ml)。

根據圖2，白血病細胞k562經mtt法最終確定的維生素c的ic50作用濃度為800mmol/l(8.64g/30ml)。

(2)核磁共振譜圖分析

根據raw264.7和k562兩種細胞水相萃取物的核磁共振氫譜譜圖，能夠確定相應的差異性代謝產物并進一步進行多元統計分析。兩種細胞系各自維生素c組和空白組的核磁共振譜圖如圖7和13所示。從譜圖中可見，維生素c組和空白組相比，兩者的信號峰具有較大的差異，這預示著維生素c組和空白組中的具有差異性代謝物，而且代謝物的種類非常多。

(3)多元統計分析

將核磁共振譜圖使用mestrenova6.11(mestrelabresearch,espain)處理，所有譜圖添加指數窗函數(exponential:0.5)，以提高信噪比。手動相位矯正，基線矯正后，用tsp定標，手動切除水峰，選取0.002ppm為間隔標準分段積分，之后對譜圖積分面積進行歸一化。積分面積數據以excel文件保存，分組編號。之后，將數據導入simca-p+12.0軟件(umetricsinc.,umea,sweden)中。使用主成分分析(pls-da)和正交偏最小二乘判別分析(opls-da)分析數據。為了確保pls-da和opls-da模型建立的可信性，運用排列實驗和cv-anova進行驗證篩選差異性變量。根據第一主成分的變量權重重要性排序值(vip)和載荷權重(loadingweights)確定差異性代謝產物。選取在偏最小二乘判別分析(pls-da)中vip值大于1的物質，判定為差異性代謝產物。載荷權重的正負代表相關差異性代謝產物在空白組與維生素c組中的上下調關系。最后通過人類代謝組數據庫(hmdb)以及生物核磁共振數據庫(bmrb)進行定性分析，得到差異性代謝產物的種類名稱，如表1和表2。

取vip≥1的化學位移。其中vip值越大對差異性分組貢獻越大。兩種細胞系的化學位移確定的差異性代謝產物以及比較差異性代謝產物的上下調程度見表1和表2。

表1raw264.7細胞系差異性代謝物

表2k562細胞系差異性代謝物

simca-p軟件中進行多元統計分析的pca和pls－da分析結果表明，對于raw264.7和k562細胞，維生素c組和空白組能夠分開。兩種細胞的pca得分圖(圖3和圖9)和載荷圖表明，兩種細胞經過維生素c處理后都有各自的差異性代謝產物。

首先，使用pca模型對數據進行降維處理，提取數據集中的大部分信息觀察空白組和維生素c組的自然分組狀況。結果顯示對于raw264.7細胞來說，維生素c組和空白組能夠從第一主成分和第二主成分上明顯區分。同樣地，k562的維生素c組和空白組也能在其第一主成分和第二主成分上有良好的區分。pca作為無師監督的分析方法，只能反應數據的原始狀況。但是，在實驗的實際操作中存在許多因子影響結果的準確性，例如環境或某些系統性錯誤。為了獲取更為準確的分組情況，盡可能排除這些外在影響因子，我們使用有師監督的分析方法pls-da和opls-da處理數據。巨噬細胞raw264.7和k562細胞的pls-da得分圖中vc組和對照組都能發生明顯區分，見圖4和圖10。通過排列實驗可以驗證模型的有效性，觀察兩個細胞系的排列驗證實驗結果圖，如圖5和圖11所示，結果表明raw264.7(r²x＝0.891，r²y＝0.972，q²＝0.939)，無過擬合現象，具有較好的數據預測能力。k562細胞系建立的pls-da模型擬合的也較好(r²x＝0.98，r²y＝0.989，q²＝0.978)，無過擬合現象，也具有較好的數據預測能力。

利用opls-da分析建立raw264.7細胞的模型，根據得分圖(圖6)發現空白組和維生素c組能夠最大程度的得到區分并且能夠降低組內差異。k562細胞建立opls-da模型，對其得分圖(圖12)觀察發現也能夠很好的區分。

(4)代謝通路分析

為了研究維生素c作用于raw264.7和k562細胞相關生物標志物的代謝通路，本發明將篩選得到的差異性代謝物通過kegg數據庫確定kegg號，然后再通過metaboanalyst(metpa)(網址：http://www.metaboanalyst.ca/)歸屬出這些差異性代謝物的代謝通路，從而探究差異性代謝物與代謝通路之間的相互作用關系。metpa能夠根據代謝信息數據庫(kegg)得到相應代謝物的kegg序列號(keggid)，利用計算機自動對不同代謝物的生化變化進行分組，從而尋找出相關度最高的代謝通路和疾病。一種是路徑分析，即整合富集分析和路徑拓撲分析，該模型能夠對21種模式生物進行可視化分析。所得結果以通路影響特性作為橫坐標，代表代謝通路富集重要性的-logp值為縱坐標，計算代謝通路重要性的拓撲分析進行作圖。代謝途徑影響的-logp值越大，不同分組之間的代謝相關性越高。兩種細胞得到的路徑分析圖見圖7和11。另一種是對人類和哺乳動物的代謝物組富集分析(msea)，基于數據庫中的大約6300組代謝物組進行的通路歸屬分析。本實驗選取表征分析(overrepresentaionanalysis,ora)作為富集分析算法，該方法只需要將對應化合物的kegg序列號導入即可進行后續分析。該模型通過傳統的特征選擇方法或是聚類算法檢測有意義的生物模式。

將raw264.7的25種差異性代謝物和k562的6種差異性代謝物分別導入metpa軟件中，通過兩種數據庫歸屬代謝通路。raw264.7細胞相關的25個差異性代謝產物歸屬出28條代謝通路，包括：1.氰基氨基酸代謝；2.乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝；3.甲烷代謝；4.丙酮酸代謝；5.三羧酸循環；6.賴氨酸降解；7.丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝；8.酪氨酸代謝；9.丁酸代謝；10.牛磺酸和亞牛磺酸代謝；11.硫代謝；12.維生素b6代謝；13.苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成；14.硒氨基酸代謝；15.氮代謝；16.脂肪酸代謝；17.d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代謝；18.氨酰trna的生物合成；19.硫胺代謝；20.脂肪酸在線粒體中的延長；21.糖酵解或糖異生；22.賴氨酸生物合成；23.泛醌和其他萜醌類生物合成；24.葉酸生物合成；25.苯丙氨酸代謝；26.組氨酸代謝；27.戊糖和葡萄糖醛酸鹽互變；28.半胱氨酸和甲硫氨酸代謝。而k562細胞相關的6個生物標記物歸屬出8條相關代謝通路，包括：1.甘油脂代謝；2.肌醇磷酸代謝；3.甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝；4.半乳糖代謝；5.核黃素代謝；6.甲烷代謝；7.維生素c代謝；8.戊糖和葡萄糖醛酸鹽互變。

raw264.7細胞差異代謝物的通路富集分析顯示經ic50劑量vc處理后，細胞代謝的改變途徑主要集中在蛋氨酸代謝、半乳糖代謝、氨循環、牛磺酸及亞牛磺酸代謝、果糖和甘露糖的降解、谷胱甘肽代謝、甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝、丙酮酸代謝、丙氨酸代謝、糖異生、半胱氨酸代謝、蘋果酸-天冬氨酸穿梭、泛酸和輔酶a的生物合成、葡萄糖-丙氨酸循環、甘油酯代謝、淀粉和蔗糖的代謝、鞘脂代謝、戊糖磷酸途徑、谷氨酸代謝、肌醇代謝、蛋白質合成、尿素循環、卟啉代謝、檸檬酸循環、膽酸生物合成，共25種信號通路。

raw264.7細胞信號通路影響分析結果與通路富集分析結果綜合來看，兩者在蛋氨酸代謝、牛磺酸和亞牛磺酸代謝、丙酮酸代謝、丙氨酸代謝、糖異生、三羧酸循環和谷氨酸代謝中共發生代謝通路的改變。其中在信號通路分析中存在顯著性差異的有氰基氨基酸代謝、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、甲烷代謝和丙酮酸代謝(如圖8(a)所示，pi值大于0.1)。蛋氨酸代謝、半乳糖代謝、氨循環、牛磺酸和亞牛磺酸代謝、谷胱甘肽代謝、甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝、果糖和甘露糖代謝、丙酮酸代謝、丙氨酸代謝和糖異生在信號通路富集分析中存在顯著性差異(如圖8(b)所示，pvalue值小于0.1，圖中5e-03代表5×10^-3)。

報道表明甲烷的產生與氧化還原調節有關，且在抗壞血酸存在下由膽堿形成甲烷，ic50濃度維生素c作用細胞后，細胞氧化還原狀態發生改變，細胞缺氧從而導致甲烷產生。丙酮酸對于真核生物和人類新陳代謝的許多方面是一個重要的分子，線粒體丙酮酸代謝由許多酶調節，其中在應激條件下代謝物乙酸能通過細胞內酯化誘導細胞反應，未解離的乙酸穿透細胞膜的脂質雙分子層酯化內環境而誘導細胞反應，因此細胞在ic50濃度維生素c作用后，乙酸含量上升丙酮酸代謝發生顯著性差異；蛋氨酸是細胞存活的必需氨基酸，在蛋氨酸循環中檢測出一種甜菜堿同型半胱氨酸-s-甲基轉移酶，該酶在維持蛋氨酸水平和滲透調節中發揮雙重作用，蛋氨酸代謝酶的變化能促進巨噬細胞中atpase和adpase活性的增加，因此蛋氨酸代謝的改變對于細胞維持滲透壓平衡和正常生命狀態有關；半乳糖與誘導細胞衰老有關，但誘導機制尚不清楚，似乎與葡萄糖和脂質代謝紊亂有關，d-半乳糖通過4種酶催化反應代謝為丙酮酸和d-甘油醛-3-磷酸，這與ic50劑量維生素c作用后導致的果糖和甘露糖代謝、丙酮酸代謝、甘油脂代謝等變化是相符的；據報道牛磺酸發揮許多生理功能，包括膜穩定，滲透調節和細胞保護作用，抗氧化和抗炎作用以及調節細胞內鈣濃度和離子通道功能，能夠影響多數哺乳動物細胞的線粒體功能、細胞凋亡以及抗氧化防御；已有研究表明牛磺酸能夠作為神經膠質瘤細胞凋亡的標志物，這意味著在raw264.7細胞中亞牛磺酸降低合成了更多的牛磺酸，進而引發細胞在ic50濃度維生素c作用時發生凋亡，且牛磺酸的改變推測也與細胞滲透壓的變化有關；細胞可以通過轉運蛋白將胞外的牛磺酸轉運至胞內而代謝成半胱氨酸，這是半胱氨酸代謝中代謝物濃度增高的一個原因，有研究表明丙氨酸能夠拮抗牛磺酸的轉運，因此丙氨酸代謝也隨之發生變化。氧化三甲胺(tmao)主要被認為是膽堿代謝的廢物，許多研究表明tmao參與許多生物體的重要生物學功能，例如細胞使用tmao以在滲透壓和靜水壓力的條件下維持細胞體積，所以當ic50濃度維生素c作用細胞后，tmao在維持細胞正常體積方面發揮部分作用；谷胱甘肽在保護細胞免受氧化損傷、異質親電子毒性及維持氧化還原穩態方面起重要作用，是細胞中合成的低分子量抗氧化劑，ic50濃度維生素c作用巨噬細胞后，細胞氧化還原狀態發生變化，谷胱甘肽為維持細胞氧化還原穩態而發生顯著性變化；在巨噬細胞raw264.7的代謝障礙過程中還涉及了糖異生、甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝、氨循環的顯著性差異，該代謝通路的改變是細胞應激時會發生的正常的變化。每種代謝通路顯著性變化的具體意義仍然需要進一步研究，以明確各自分子機制。

k562細胞差異代謝物的通路富集分析顯示經ic50劑量維生素c處理后，細胞代謝的改變途徑主要集中在蛋氨酸代謝、半乳糖代謝、甜菜堿代謝、甘油酯代謝、肌醇代謝、甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝，共6種信號通路。k562細胞信號通路影響分析結果與通路富集分析結果綜合來看，兩者在半乳糖代謝、甘油酯代謝、肌醇代謝和甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝中都發生顯著變化。在信號通路分析中發生顯著性變化的代謝通路有甘油脂代謝和肌醇磷酸代謝(如圖14(a)所示，pi值大于0.1)；信號通路富集分析中半乳糖代謝、甜菜堿代謝和甘油脂代謝存在顯著性差異(如圖14(b)所示，pvalue值小于0.1，圖中1e-02代表1×10^-2)。

研究發現磷酸肌醇代謝途徑的成員能調節細胞增殖、細胞遷移和磷脂酰肌醇-3-激酶/akt的信號轉導，ic50濃度維生素c作用k562細胞后，肌醇含量顯著下降，不利于細胞膜雙層結構的維持、細胞滲透性和代謝穩態的維持；半乳糖代謝中甘油和肌醇表達量下降表明維生素c也加速了細胞的衰老過程；二甲基甘氨酸表達量上升導致甜菜堿代謝發生顯著差異，這對于維持細胞滲透壓的平衡具有重要意義，且甜菜堿作為蛋氨酸循環中的甲基供體，導致蛋氨酸代謝也發生相同的變化趨勢；遺傳和生物化學分析顯示，甘油脂在細胞信號轉導、膜運輸等過程起重要作用，其生物合成的調節對于細胞脂質存儲和膜穩態至關重要，甘油含量的下降表明ic50劑量維生素c作用后，能量存儲水平下降、膜結構穩定性受到影響；k562細胞供能效率的下降還與細胞有氧呼吸轉變為糖酵解的呼吸方式有關。

綜上，針對巨噬細胞raw264.7，半乳糖代謝、谷胱甘肽代謝、丙酮酸代謝、果糖和甘露糖代謝和糖異生為其代表性代謝途徑，也就是說，維生素c對raw264.7細胞的亞毒性的影響體現在半乳糖代謝、谷胱甘肽代謝、丙酮酸代謝、果糖和甘露糖代謝和糖異生代謝途徑上；針對k562細胞，甘油脂代謝、肌醇磷酸代謝、甜菜堿代謝和半乳糖代謝為其代表性的代謝途徑，也就是說，維生素c對k562細胞的亞毒性體現在甘油脂代謝、肌醇磷酸代謝、甜菜堿代謝和半乳糖代謝。申請人后續經過了細胞實驗驗證，可以驗證以上結論。

raw264.7細胞和k562細胞共同改變的細胞代謝途徑有蛋氨酸代謝、半乳糖代謝、甘油脂代謝、肌醇代謝、甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝。結果表明ic50劑量維生素c作用細胞后，蛋氨酸代謝變化、各種氨基酸代謝變化與維持細胞正常生命活動有關，屬于細胞正常的代謝變化途徑；而ic50劑量維生素c在使癌細胞k562細胞衰老的同時也加速正常細胞的衰老，且導致巨噬細胞raw264.7中大量物質的代謝紊亂。因此我們應該合理、正確辯證地態度對待和服用維生素c。本實驗利用代謝組學方法對ic50劑量維生素c作用細胞后產生的影響作了初步研究，為后期實驗探究提供實驗方法、思路和理論基礎。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。