本發(fā)明屬于流式細(xì)胞分析，具體地，涉及一種緩沖液在制備基于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞因子的試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞因子由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。細(xì)胞因子可被分為白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子等。細(xì)胞因子的分泌在病理?xiàng)l件下會(huì)發(fā)生改變，如各種感染性疾病等。細(xì)胞因子的檢測(cè)為臨床上預(yù)防、診斷、治療疾病提供了科學(xué)輔助依據(jù)。

2、輔助性t細(xì)胞（th）是t細(xì)胞的亞群之一，通常指一類具有協(xié)助體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答能力的t細(xì)胞亞群。根據(jù)所分泌細(xì)胞因子的不同，th細(xì)胞可分為th1、th2等細(xì)胞亞群。目前，研究較多的分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞為th1和th2細(xì)胞。th1細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子ifn-γ、il-2和tnf-α，它們有利于b細(xì)胞產(chǎn)生有調(diào)理作用的抗體（il-2、il-4、il-6、il-10、tnf-α、ifn-γ、iga）和與補(bǔ)體相結(jié)合的抗體（igm、il-2、il-4、il-6、il-10、tnf-α、ifn-γ），能夠刺激巨噬細(xì)胞、nk細(xì)胞、cd8+細(xì)胞毒性t細(xì)胞對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)病原體，引起t淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和細(xì)胞免疫。但對(duì)于有自身免疫性疾病和基礎(chǔ)性疾病的患者，人體內(nèi)的自身免疫性抗體（如類風(fēng)濕因子、抗線粒體抗體、hama等）常常會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，產(chǎn)生非特異性的免疫反應(yīng)，即出現(xiàn)假陽(yáng)性，導(dǎo)致檢測(cè)的結(jié)果可能與真實(shí)情況存在差異，從而影響臨床上對(duì)疾病的判斷。

3、然而，現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-12p70、il-17a、ifn-γ、tnf-α、ifn-α等細(xì)胞因子的試劑盒準(zhǔn)確性不高，靈敏度低，很多陽(yáng)性病例無(wú)法檢出，不利于稀有樣本的檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題中的至少一個(gè)，發(fā)明人對(duì)檢測(cè)試劑和檢測(cè)條件進(jìn)行了一系列摸索，意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在微球稀釋液中添加度米芬時(shí)，該方法能夠解決微球聚集，提高同時(shí)檢測(cè)12種細(xì)胞因子的靈敏度和準(zhǔn)確度，提高試劑的穩(wěn)定性，從而完成本發(fā)明。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

2、本發(fā)明第一方面提供一種緩沖液在制備基于流式細(xì)胞儀檢測(cè)12種細(xì)胞因子的試劑盒中的應(yīng)用，所述緩沖液為tris緩沖液，所述tris緩沖液中還含有1~3‰?v/v防腐劑、5~15‰?m/v無(wú)機(jī)鹽、1~5‰?m/v第一表面活性劑、0.3~1‰?v/v第二表面活性劑和20~50‰?m/vbsa，所述第一表面活性劑為度米芬，所述細(xì)胞因子包括il-2、il-4、il-6、il-10、tnf-α、ifn-γ、il-17a、il-1β、il-5、il-12p70、ifn-α和il-8。

3、度米芬為季銨類陽(yáng)離子表面活性劑，常用作化學(xué)防腐劑或抗菌劑。在本發(fā)明中，當(dāng)在緩沖液中添加度米芬，在作為微球稀釋液時(shí)，能夠避免微球聚集。

4、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述tris緩沖液的濃度為80～150mmol/l。

5、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述無(wú)機(jī)鹽為nacl、kcl、mgcl2和/或zncl2。

6、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述防腐劑為krovin系列防腐劑中的至少一種。

7、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述krovin系列防腐劑包括krovin?100、krovin?400、krovin?500和krovin?750。

8、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述防腐劑為proclin系列防腐劑中的至少一種。

9、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述proclin系列防腐劑包括proclin?50、proclin?150、proclin?200、proclin?300、proclin?950和proclin?5000。

10、在本發(fā)明中，對(duì)于第二表面活性劑沒(méi)有特殊要求，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述第二表面活性劑選自sds、triton?x-100、tween?80和tween?20中的至少一種。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第二表面活性劑為tween?20。

11、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括偶聯(lián)熒光微球的抗體溶液、熒光標(biāo)記的抗體溶液和微球緩沖液，其中，

12、所述偶聯(lián)熒光微球的抗體溶液是將偶聯(lián)熒光微球的il-2第一抗體、il-4第一抗體、il-6第一抗體、il-10第一抗體、tnf-α第一抗體、ifn-γ第一抗體，il-17a第一抗體、il-1β第一抗體、il-5第一抗體、il-8第一抗體、il-12p70第一抗體和ifn-a第一抗體加入所述tris緩沖液中制備得到，每種第一抗體偶聯(lián)的熒光微球的熒光強(qiáng)度不同；

13、所述熒光標(biāo)記的抗體溶液中包括熒光標(biāo)記的il-2第二抗體、il-4第二抗體、il-6第二抗體、il-10第二抗體、tnf-α第二抗體、ifn-γ第二抗體，il-17a第二抗體、il-1β第二抗體、il-5第二抗體、il-8第二抗體、il-12p70第二抗體和ifn-a第二抗體；

14、所述微球緩沖液包括0.2%～0.3%?m/v?kh2po4、3%～4%?m/v?na2hpo4·12h2o、0.5%～1.0%?m/v?nacl、0.1%～0.5%?m/v?kcl、2%～4%?m/v?bsa、0.1%～0.2%?m/v?proclin300、0.05%～0.1%?v/v?tween-20和0.1%～0.3%?m/v?pvp-k30。

15、在本發(fā)明中，所述微球緩沖液用于在利用所述試劑盒檢測(cè)液體生物樣本中12種細(xì)胞因子時(shí)，替換所述偶聯(lián)熒光微球的抗體溶液的tris緩沖液，具體步驟為：將所述偶聯(lián)熒光微球的抗體溶液離心去上清，加入所述微球緩沖液。同時(shí)或依次再加入所述液體生物樣本和所述熒光標(biāo)記的抗體溶液，室溫下避光孵育，得到待檢測(cè)溶液。

16、本發(fā)明第二方面提供一種基于流式細(xì)胞儀檢測(cè)12種細(xì)胞因子的試劑盒，包括偶聯(lián)熒光微球的抗體溶液、熒光標(biāo)記的抗體溶液和微球緩沖液，其中，

17、所述偶聯(lián)熒光微球的抗體溶液是將偶聯(lián)熒光微球的il-2第一抗體、il-4第一抗體、il-6第一抗體、il-10第一抗體、tnf-α第一抗體、ifn-γ第一抗體，il-17a第一抗體、il-1β第一抗體、il-5第一抗體、il-8第一抗體、il-12p70第一抗體和ifn-a第一抗體加入本發(fā)明第一方面中所述tris緩沖液中制備得到，每種第一抗體偶聯(lián)的熒光微球的熒光強(qiáng)度不同；

18、所述熒光標(biāo)記的抗體溶液中包括熒光標(biāo)記的il-2第二抗體、il-4第二抗體、il-6第二抗體、il-10第二抗體、tnf-α第二抗體、ifn-γ第二抗體，il-17a第二抗體、il-1β第二抗體、il-5第二抗體、il-8第二抗體、il-12p70第二抗體和ifn-a第二抗體；

19、所述微球緩沖液包括0.2%～0.3%?m/v?kh2po4、3%～4%?m/v?na2hpo4·12h2o、0.5%～1.0%?m/v?nacl、0.1%～0.5%?m/v?kcl、2%～4%?m/v?bsa、0.1%～0.2%?m/v?proclin300、0.05%～0.1%?v/v?tween-20和0.1%～0.3%?m/v?pvp-k30。

20、在本發(fā)明中，所述偶聯(lián)熒光微球的抗體溶液中的緩沖液在進(jìn)行檢測(cè)前利用所述微球緩沖液進(jìn)行替換。具體地：將所述偶聯(lián)熒光微球的抗體溶液離心去上清，再加入所述等體積微球緩沖液。

21、本發(fā)明第三方面提供一種利用本發(fā)明第二方面所述的試劑盒檢測(cè)液體生物樣本中12種細(xì)胞因子的方法，包括以下步驟：

22、s1，將所述偶聯(lián)熒光微球的抗體溶液離心去上清，加入所述微球緩沖液、所述液體生物樣本和所述熒光標(biāo)記的抗體溶液，室溫下避光孵育，得到待檢測(cè)溶液；

23、s2，檢測(cè)所述待檢測(cè)溶液中熒光標(biāo)記的熒光強(qiáng)度以計(jì)算所述待測(cè)樣本中不同細(xì)胞因子的含量。

24、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

25、利用本發(fā)明的緩沖液基于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞因子時(shí)，對(duì)于低濃度樣本仍有較好的線性，靈敏度高從而能夠檢測(cè)低濃度樣本，最終檢測(cè)準(zhǔn)確度高，且能夠消除隨機(jī)樣本異常，具有非常重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。能夠解決微球聚集，從而提高了試劑的準(zhǔn)確度及靈敏度。