本發(fā)明涉及腫瘤診斷及免疫組化檢測，具體為一種pd-l1的免疫組化檢測試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

1、目前，免疫檢查點抑制劑（如pd-1/pd-l1抑制劑）已經(jīng)成為腫瘤治療的重要手段，其通過阻斷免疫抑制信號恢復(fù)t細(xì)胞活性，為患者帶來了顯著的生存獲益。然而，pd-l1免疫組化檢測作為免疫治療患者篩選的重要伴隨診斷工具，現(xiàn)有技術(shù)在靈敏度、特異性及數(shù)據(jù)解讀能力方面仍存在諸多不足，制約了檢測方法的廣泛應(yīng)用。

2、傳統(tǒng)的pd-l1免疫組化檢測方法主要依賴單表位抗體，通過dab顯色法評估腫瘤組織中pd-l1的表達(dá)。然而，單表位抗體在結(jié)合低表達(dá)pd-l1或結(jié)構(gòu)發(fā)生變構(gòu)的靶分子時，其親和力和特異性往往不足，導(dǎo)致染色信號微弱甚至難以檢測。此外，dab顯色方法的信號輸出能力有限，尤其在弱陽性樣本中，顯色區(qū)域的可見性較差，嚴(yán)重影響了檢測的靈敏度。這種局限使弱表達(dá)pd-l1患者可能未被正確識別，錯失免疫治療的機(jī)會。

3、現(xiàn)有技術(shù)嘗試引入信號放大技術(shù)以提高弱陽性信號的檢測能力，但多采用單輪信號放大策略。雖然能夠增強(qiáng)目標(biāo)信號，但背景噪聲也隨之被同步放大，導(dǎo)致檢測特異性下降。復(fù)雜組織中的高背景干擾尤為明顯，例如在高背景的結(jié)腸癌或胃癌組織中，非特異性染色經(jīng)常覆蓋目標(biāo)信號區(qū)域，使檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性難以保證。同時，現(xiàn)有的抗原修復(fù)和封閉方案多為單一措施，缺乏針對非特異性結(jié)合行為的有效應(yīng)對，進(jìn)一步加劇了染色背景問題。

4、隨著免疫組化技術(shù)的發(fā)展，多靶點檢測成為深入解析腫瘤微環(huán)境的主要方向。通過同時檢測pd-l1及其他免疫相關(guān)標(biāo)志物（如cd8、foxp3）的表達(dá)及分布，可為患者的免疫狀態(tài)提供更全面的信息。然而，傳統(tǒng)的dab多輪顯色方法在多靶點檢測中表現(xiàn)出顯著局限。顯色試劑之間的交叉干擾導(dǎo)致染色結(jié)果難以分辨，染色區(qū)域之間的邊界模糊，使得腫瘤與免疫細(xì)胞的空間關(guān)系難以清晰解析。這種不足限制了腫瘤微環(huán)境的綜合評估能力，也削弱了檢測方法對免疫治療指導(dǎo)的作用。

5、此外，現(xiàn)有的pd-l1檢測評分體系通常以腫瘤陽性比例（tps）為基礎(chǔ)，評估pd-l1陽性細(xì)胞的占比。這種單一評分方法雖然簡單直觀，但忽視了pd-l1表達(dá)區(qū)域與免疫活性或抑制細(xì)胞的空間關(guān)聯(lián)信息。在高異質(zhì)性腫瘤中，tps難以全面反映患者的免疫狀態(tài)，導(dǎo)致部分免疫治療潛在響應(yīng)患者未能被有效識別，也影響了免疫治療效果的預(yù)測精度。

6、綜上所述，現(xiàn)有pd-l1免疫組化檢測方法在低表達(dá)區(qū)域的檢測靈敏度不足，復(fù)雜組織中的背景噪聲干擾較大，傳統(tǒng)多靶點檢測技術(shù)的空間解析能力有限，單一維度評分體系無法全面評估腫瘤免疫狀態(tài)。這些不足限制了現(xiàn)有技術(shù)對腫瘤免疫微環(huán)境的精準(zhǔn)分析，也阻礙了其在免疫治療伴隨診斷中的進(jìn)一步應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種pd-l1的免疫組化檢測試劑盒及方法，解決現(xiàn)有pd-l1免疫組化檢測中靈敏度不足、背景干擾顯著、多靶點分析受限及評分模型單一的問題。

2、為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：一種pd-l1的免疫組化檢測試劑盒，包括以下組分：

3、雙表位高親和力抗pd-l1單克隆抗體，質(zhì)量份數(shù)占比為0.5%～5%；

4、顯色試劑，質(zhì)量份數(shù)占比為1%～10%，所述顯色試劑為dab顯色液或tyramide信號放大試劑；

5、抗原修復(fù)液，質(zhì)量份數(shù)占比為5%～15%，所述抗原修復(fù)液為檸檬酸緩沖液或edta緩沖液；

6、封閉試劑，質(zhì)量份數(shù)占比為2%～10%；

7、穩(wěn)定劑，質(zhì)量份數(shù)占比為0.1%～1%；

8、配制所述抗體和試劑的磷酸鹽緩沖液，余量至100%。

9、優(yōu)選的，所述雙表位高親和力抗pd-l1單克隆抗體通過柔性肽鏈連接兩個單鏈抗體，所述單鏈抗體針對pd-l1的不同活性表位。

10、優(yōu)選的，所述雙表位高親和力抗體通過噬菌體展示技術(shù)篩選獲得，其親和常數(shù)小于10-9m。

11、優(yōu)選的，所述顯色試劑包括dab底物液，所述dab底物液的濃度為0.02mg/ml～0.05mg/ml，并配合0.01%～0.03%的過氧化氫。

12、優(yōu)選的，所述抗原修復(fù)液為0.01m～0.05m的檸檬酸緩沖液，ph為6.0～7.0，或0.01m～0.05m的edta緩沖液，ph為8.5～9.5。

13、一種pd-l1的免疫組化檢測方法，包括以下步驟：

14、s1.將固定后的組織切片置于抗原修復(fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù)；

15、s2.滴加雙表位高親和力抗pd-l1單克隆抗體進(jìn)行初級抗體孵育；

16、s3.加入顯色試劑進(jìn)行顯色處理；

17、s4.對染色后的切片進(jìn)行核復(fù)染、脫水和封片；

18、s5.在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

19、優(yōu)選的，所述抗原修復(fù)步驟為將組織切片置于抗原修復(fù)液中，在95℃～100℃下處理10分鐘～20分鐘。

20、優(yōu)選的，所述抗體孵育步驟中，抗體濃度為0.5μg/ml～1.5μg/ml，孵育溫度為37℃，孵育時間為30分鐘～60分鐘。

21、優(yōu)選的，所述s3步驟中，顯色時間為1分鐘～3分鐘，顯色試劑包括dab底物液或tyramide信號放大試劑。

22、優(yōu)選的，所述染色結(jié)果在顯微鏡下通過圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，所得數(shù)據(jù)包括pd-l1表達(dá)水平的陽性比例。

23、本發(fā)明提供了一種pd-l1的免疫組化檢測試劑盒及方法。具備以下有益效果：

24、1、本發(fā)明采用雙表位高親和力抗體技術(shù)，通過靶向pd-l1的兩個不同活性表位，顯著提高了抗體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合穩(wěn)定性和特異性。相比于現(xiàn)有技術(shù)中單表位抗體方案容易出現(xiàn)假陽性或假陰性的問題，本發(fā)明的設(shè)計有效克服了低表達(dá)區(qū)域檢測靈敏度不足的難題，特別適用于低表達(dá)患者樣本的免疫組化分析。

25、2、本發(fā)明引入動態(tài)信號放大技術(shù)，結(jié)合tyramide信號放大（tsa）和多輪循環(huán)放大方案，有效增強(qiáng)了弱信號的可檢測性。現(xiàn)有技術(shù)中，傳統(tǒng)dab顯色在低濃度目標(biāo)抗原時顯色信號容易被背景噪聲掩蓋，而本發(fā)明通過顯色與信號放大的結(jié)合，大幅提升了檢測信噪比，確保了染色結(jié)果的可靠性和對比度。

26、3、本發(fā)明將空間組學(xué)分析引入免疫組化檢測，通過多靶點熒光標(biāo)記技術(shù)和ai輔助算法，全面解析腫瘤免疫微環(huán)境的動態(tài)特征。與現(xiàn)有單靶點檢測方法僅能提供簡單的pd-l1表達(dá)信息不同，本發(fā)明可同時分析pd-l1與其他免疫相關(guān)標(biāo)志物的空間分布關(guān)系。這一創(chuàng)新實現(xiàn)了腫瘤免疫微環(huán)境的多維度評估，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)技術(shù)無法揭示空間異質(zhì)性的不足。

27、4、本發(fā)明采用抗原修復(fù)與背景噪聲抑制的綜合優(yōu)化方案，通過高效抗原修復(fù)液配方和雙重封閉步驟，進(jìn)一步提升了染色特異性。相比于現(xiàn)有技術(shù)中因組織處理不足導(dǎo)致的染色不均或背景染色過高的問題，本發(fā)明在提高目標(biāo)信號質(zhì)量的同時，顯著降低了非特異性染色的風(fēng)險，從而優(yōu)化了染色結(jié)果的清晰度和一致性。

技術(shù)特征：

1.一種pd-l1的免疫組化檢測試劑盒，其特征在于，包括以下組分：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種pd-l1的免疫組化檢測試劑盒，其特征在于，所述雙表位高親和力抗pd-l1單克隆抗體通過柔性肽鏈連接兩個單鏈抗體，所述單鏈抗體針對pd-l1的不同活性表位。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種pd-l1的免疫組化檢測試劑盒，其特征在于，所述雙表位高親和力抗體通過噬菌體展示技術(shù)篩選獲得，其親和常數(shù)小于10-9m。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種pd-l1的免疫組化檢測試劑盒，其特征在于，所述顯色試劑包括dab底物液，所述dab底物液的濃度為0.02mg/ml～0.05mg/ml，并配合0.01%～0.03%的過氧化氫。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種pd-l1的免疫組化檢測試劑盒，其特征在于，所述抗原修復(fù)液為0.01m～0.05m的檸檬酸緩沖液，ph為6.0～7.0，或0.01m～0.05m的edta緩沖液，ph為8.5～9.5。

6.一種pd-l1的免疫組化檢測方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1-5任一項所述的一種pd-l1的免疫組化檢測試劑盒，包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種pd-l1的免疫組化檢測方法，其特征在于，所述抗原修復(fù)步驟為將組織切片置于抗原修復(fù)液中，在95℃～100℃下處理10分鐘～20分鐘。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種pd-l1的免疫組化檢測方法，其特征在于，所述抗體孵育步驟中，抗體濃度為0.5μg/ml～1.5μg/ml，孵育溫度為37℃，孵育時間為30分鐘～60分鐘。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種pd-l1的免疫組化檢測方法，其特征在于，所述s3步驟中，顯色時間為1分鐘～3分鐘，顯色試劑包括dab底物液或tyramide信號放大試劑。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種pd-l1的免疫組化檢測方法，其特征在于，所述染色結(jié)果在顯微鏡下通過圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，所得數(shù)據(jù)包括pd-l1表達(dá)水平的陽性比例。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及腫瘤診斷及免疫組化檢測技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種PD?L1的免疫組化檢測試劑盒及方法，其中，試劑盒由雙表位高親和力抗體、顯色試劑、信號放大系統(tǒng)、抗原修復(fù)液、封閉試劑等組成。檢測方法采用雙表位抗體靶向結(jié)合PD?L1不同活性表位，通過Tyramide動態(tài)信號放大技術(shù)增強(qiáng)弱信號區(qū)域的顯色效果，同時引入多靶點熒光標(biāo)記技術(shù)解析PD?L1與其他免疫標(biāo)志物的空間分布特性，建立多維度評分模型，全面評估腫瘤免疫微環(huán)境。本發(fā)明提升了PD?L1檢測的靈敏度和特異性，降低背景噪聲干擾，解決了弱陽性區(qū)域漏檢、多靶點檢測交叉干擾以及單一評分模型不精準(zhǔn)等問題，廣泛適用于腫瘤免疫治療伴隨診斷及微環(huán)境研究領(lǐng)域。

技術(shù)研發(fā)人員：董洪梅,趙瑞君,王露,林宇晟,馬佳康,崔偉恒
受保護(hù)的技術(shù)使用者：暨南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28